Name: Pinces magnétiques à grande vitesse pour les mesures nanomécaniques sur des éléments sensibles à la force (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Découvrez les pinces magnétiques à grande vitesse pour les mesures nanomécaniques sur des biomolécules sensibles à la force. Cette méthode permet d'étudier les événements mécanobiologiques en temps réel.

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Ce travail a été soutenu par la subvention de la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 et NRF- 2021R1A6A1A10042944). S.-H.R. a été soutenu par la subvention NRF (2021R1C1C2009717).

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Dans ce travail, nous avons introduit une configuration de spectroscopie de force à molécule unique qui peut observer les changements structurels des biomolécules avec une grande précision spatio-temporelle. La caméra CMOS haute vitesse utilisée acquiert 1 200 images s−1 à une résolution de 1 280 x 1 024, permettant un suivi des billes de 1,2 kHz. Cependant, la vitesse des mesures est actuellement limitée par le logiciel de suivi des perles, de sorte que le retour sur investissement est généralement réduit à d...

Les cellules détectent activement les stimuli mécaniques et y répondent. Ce faisant, de nombreuses biomolécules présentent des propriétés dépendantes de la force qui permettent des changements structurels dynamiques. Des exemples très appréciés incluent les canaux ioniques mécanosensibles et les éléments cytosquelettiques qui fournissent aux cellules des informations mécaniques clés de leur environnement.
En outre, les molécules qui présentent une nature unique de force porteuse peuvent également être considérées comme mécanosensibles dans un sens plus large. Par exemple, la formation locale et la fusion des duplex d’acides nucléiques, ainsi que des structures d’ordre supérieur telles que les quadriplex G, jouent un rôle crucial dans la réplication, la transcription, la recombinaison et, plus récemment, l’édition du génome. De plus, certaines protéines neuronales impliquées dans les communications synaptiques remplissent leurs fonctions en générant des forces physiques qui dépassent les niveaux des interactions intermoléculaires typiques. Quel que soit l’exemple étudié, l’étude de la nanomécanique des biomolécules impliquées avec une grande précision spatio-temporelle s’avérera très utile pour révéler les mécanismes moléculaires des processus mécanobiologiques associés 1,2,3.
Les méthodes de spectroscopie de force à molécule unique ont servi d’outils puissants pour examiner les propriétés mécaniques des biomolécules 2,4,5,6. Ils peuvent surveiller les changements structurels dans les acides nucléiques et les protéines en même temps que l’application de la force, examinant ainsi les propriétés dépendantes de la force. Deux configurations bien connues sont les pinces optiques et les pinces magnétiques (MT), qui utilisent des billes de la taille d’un micron pour manipuler les molécules 5,6,7,8. Dans ces plateformes, le polystyrène (pour les pinces optiques) ou les billes magnétiques (pour les MT) sont attachés à des molécules cibles (p. ex. acides nucléiques et protéines) via des « poignées » moléculaires, généralement constituées de courts fragments d’ADN double brin (ADNds). Les billes sont ensuite déplacées pour exercer une force et imagées pour suivre leurs emplacements qui signalent les changements structurels dans les molécules cibles. Les pinces optiques et magnétiques sont largement interchangeables dans leurs applications, mais il existe des différences importantes dans leurs approches du contrôle de la force. Les pincettes optiques sont intrinsèquement des instruments de serrage de position qui emprisonnent les billes en position, à cause desquelles la force appliquée fluctue lorsqu’une construction cible subit des changements de forme; L’augmentation de l’extension, par exemple en se dépliant, desserre l’attache et réduit la tension, et vice versa. Bien que la rétroaction active puisse être mise en œuvre pour contrôler la force dans les pincettes optiques, les MT en revanche fonctionnent naturellement comme un dispositif de serrage de force, tirant parti des forces magnétiques stables et éloignées des aimants permanents, qui peuvent également résister à la perturbation de l’environnement.
Malgré leur longue histoire et leur conception simple, les MT ont pris du retard par rapport aux pincettes optiques dans leurs applications pour les mesures de haute précision, en grande partie en raison des défis techniques liés au suivi rapide des talons. Récemment, cependant, plusieurs groupes ont mené conjointement une amélioration multidimensionnelle du matériel et des logiciels pour les instruments de traduction automatique 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Dans ce travail, nous présentons un exemple d’une telle configuration fonctionnant à 1,2 kHz et décrivons comment l’utiliser pour effectuer des mesures nanomécaniques sur des biomolécules sensibles à la force. En tant que systèmes modèles, nous utilisons des épingles à cheveux à ADN et des complexes SNARE neuronaux et examinons leurs changements structurels rapides dans le régime piconewton. Les épingles à cheveux ADN présentent des transitions simples à deux états dans une plage de force bien définie20,21, et servent donc de modèles de jouets pour vérifier les performances d’une pince à épiler. Comme les protéines SNARE s’assemblent en un complexe sensible aux forces qui entraîne la fusion membranaire22, elles ont également été étudiées de manière approfondie par spectroscopie de force à molécule unique 14,23,24,25. Les approches standard pour analyser les données et extraire des informations utiles sur la thermodynamique et la cinétique sont présentées. Nous espérons que cet article facilitera l’adoption de MT de haute précision dans les études mécanobiologiques et motivera les lecteurs à explorer leurs propres systèmes d’intérêt sensibles à la force.

pinces magnétiques à grande vitesse pour les mesures nanomécaniques sur des éléments sensibles à la force

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Les pincettes magnétiques à molécule unique (MT) ont servi d’outils puissants pour interroger avec force les biomolécules, telles que les acides nucléiques et les protéines, et sont donc sur le point d’être utiles dans le domaine de la mécanobiologie. Étant donné que la méthode repose généralement sur le suivi des billes magnétiques basé sur l’image, la limite de vitesse dans l’enregistrement et l’analyse des images, ainsi que les fluctuations thermiques des billes, ont longtemps entravé son application dans l’observation de changements structurels petits et rapides dans les molécules cibles. Cet article décrit en détail les méthodes de construction et d’exploitation d’une installation de traduction automatique à haute résolution capable de résoudre la dynamique nanométrique en millisecondes des biomolécules et de leurs complexes. À titre d’exemples d’application, des expériences avec des épingles à cheveux à ADN et des complexes SNARE (machinerie de fusion membranaire) sont démontrées, en se concentrant sur la façon dont leurs états transitoires et transitions peuvent être détectés en présence de forces à l’échelle du piconewton. Nous nous attendons à ce que les MT à grande vitesse continuent de permettre des mesures nanomécaniques de haute précision sur des molécules qui détectent, transmettent et génèrent des forces dans les cellules, approfondissant ainsi notre compréhension moléculaire de la mécanobiologie.

Calibrage de la force Les résultats des deux méthodes de mesure de la force (variance de déplacement latéral des billes et analyse du spectre de puissance) différaient de 0 à 2 pN (figure 2G). Selon les résultats de la figure 2F, nous pouvons atteindre de manière fiable jusqu’à 30 pN avec des aimants en néodyme réguliers.
Transitions à deux états d’une épingle à cheveux ADN de 8 pb Nous avons d’...

Ici, nous décrivons une pince magnétique à haute vitesse qui effectue des mesures nanomécaniques sur des biomolécules sensibles à la force à la vitesse maximale de 1,2 kHz. Nous introduisons son application aux épingles à cheveux à ADN et aux complexes SNARE en tant que systèmes modèles, mais elle sera également applicable à d’autres molécules impliquées dans des événements mécanobiologiques.

Pinces magnétiques à grande vitesse pour les mesures nanomécaniques sur des éléments sensibles à la force

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Les biomolécules subissent de petits changements structurels rapides, souvent en réponse à la force. Les pinces magnétiques à haute résolution peuvent explorer ces dynamiques sous des forces physiologiquement pertinentes. Comme la méthode effectue des mesures à l’échelle nanométrique avec une précision de la milliseconde, il est possible de surveiller les changements subtils dans les acides nucléiques et les protéines en temps réel.Les dysfonctionnements des protéines du premier roulement et mécanosensibles peuvent potentiellement entraîner des troubles cardiovasculaires et musculo-squelettiques. Les pinces magnétiques peuvent donner un aperçu des mécanismes de fonctionnement de ces protéines. L’ensemble doit être correctement aligné et calibré pour obtenir de bonnes résolutions.En outre, des précautions doivent être prises lors de la préparation et de l’identification des constructions moléculaires pour les mesures. Commencez par installer un microscope inversé sur une table optique antivibratoire. Ensuite, installez une caméra CMOS haute vitesse et une carte d’acquisition.Montez verticalement une platine linéaire motorisée d’une longueur de course de plus de 20 millimètres sur un

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Dans cet article, nous décrivons l'utilisation de pinces magnétiques pour étudier l'effet de la force sur la protéolyse enzymatique à l'échelle de la molécule unique d'une manière hautement parallélisables.

Multiplexée unique molécule mesures Protéolyse forcer l&#39;utilisation de pinces magnétiques

Nous avons mesuré la sortie de tension dans un axone qui a été partiellement lésé avec un dissecteur laser en mesure de spectroscopie de force simultanées effectuées sur une sonde optiquement piégé collée à la membrane de l'axone. Le protocole expérimental développé évalue l'adhérence des axones au substrat de culture.

Mesure de la tension de sortie Pendant Laser Induced Axon lésion axonale évaluer l&#39;adhésion au substrat à piconewton et Millisecond Résolution

Pinces magnétiques, une technique de manipulation de molécule unique puissante, peuvent être adaptés pour les mesures directes de la torsion (en utilisant une configuration appelée librement orbite pinces magnétiques) et le couple (en utilisant une configuration appelée pinces de couple magnétique) dans les macromolécules biologiques. Lignes directrices pour l'exécution de ces mesures sont donnés, y compris les applications à l'étude de l'ADN et des filaments nucléo-protéines associées.

Pinces magnétiques pour la mesure de la torsion et de couple

Une plate-forme de molécules simples pinces magnétiques pour manipuler les G-quadruplexes est signalée, qui permet l’étude de stabilité G4 et règlement de diverses protéines.

Manipulation de molécules simples de G-quadruplexes par pinces magnétiques

Nous présentons ici un protocole pour étudier les propriétés mécaniques intracellulaires de cellules embryonnaires isolées de poisson-zèbre en confinement tridimensionnel avec mesure directe de la force par un piège optique.

Mesures de force directe de la mécanique subcellulaire en confinement à l’aide de pinces optiques

La microscopie à force magnétique (MFM) utilise une sonde de microscopie à force atomique magnétisée verticalement pour mesurer la topographie de l’échantillon et l’intensité du champ magnétique local avec une résolution à l’échelle nanométrique. L’optimisation de la résolution spatiale et de la sensibilité MFM nécessite d’équilibrer la diminution de la hauteur de levage par rapport à l’augmentation de l’amplitude d’entraînement (oscillation), et les avantages d’un fonctionnement dans une boîte...

Optimisation de la résolution et de la sensibilité de la microscopie à force magnétique pour visualiser les domaines magnétiques à l’échelle nanométrique

Ce protocole démontre l’utilisation d’une pince magnétique à molécule unique pour étudier les interactions entre les protéines de liaison à l’ADN télomérique (facteur de liaison à la répétition des télomères 1 [TRF1] et TRF2) et les télomères longs extraits de cellules humaines. Il décrit les étapes préparatoires pour les télomères et les facteurs de liaison de répétition télomérique, l’exécution d’expériences sur une seule molécule et les méthodes de collecte et d’analyse des données.

Analyse des interactions protéine-ADN télomériques à l’aide d’une pince magnétique à molécule unique

flexibilité conformationnelle joue un rôle essentiel dans la fonction des protéines. Nous décrivons ici l'utilisation de la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation couplée à l'échange hydrogène-deutérium résolue dans le temps pour sonder les changements structurels rapides qui favorisent la fonction des protéines ordonné et désordonné.

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Nous décrivons ici un protocole simple pour produire rapidement des centaines de gélose de croissance nématode de médias, des plaques de 96 puits de culture avec un nombre uniforme de Caenorhhabditis elegans / puits. Ces cultures sont utiles pour le dépistage phénotypique des organismes entiers. Nous nous concentrons ici sur l’utilisation de ces cultures de produits chimiques pour des effets Pro-longévités.

Une méthode Simple pour le criblage à haut débit chimique chez Caenorhabditis Elegans

Nous présentons ici un protocole d’expériences électrochimiques cellule entière pour étudier la contribution du transport de protons au taux de transport des électrons extracellulaire par les cytochromes de la membrane externe complexes de Shewanella oneidensis MR-1.

Électrochimique détection de cinétique effet isotopique sur extracellulaire Transport d’électrons dans Shewanella oneidensis MR-1

Découvrez les pinces magnétiques à grande vitesse pour les mesures nanomécaniques sur des biomolécules sensibles à la force. Cette méthode permet d'étudier les événements mécanobiologiques en temps réel.

Pinces magnétiques à grande vitesse pour les mesures nanomécaniques sur des éléments sensibles à la force

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