Name: Isolement, culture et caractérisation des fibroblastes cutanés primaires à partir de tissus chéloïdes humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Apprenez à isoler et cultiver des fibroblastes cutanés primaires à partir de tissus chéloïdes humains. Cette méthode optimisée fournit une source stable de cellules viables pour la recherche sur les chéloïdes.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 81903189 et 82073418) et de la Fondation pour la science et la technologie de Guangzhou (numéro de subvention 202102020025).

Cette étude a été approuvée par le comité d’examen institutionnel de l’hôpital de dermatologie de la Southern Medical University (2020081). Le consentement éclairé du patient a été obtenu avant que les tissus ne soient prélevés sur les individus.
1. Préparation
REMARQUE : Les procédures suivantes doivent être effectuées dans un environnement stérile sous une enceinte de sécurité biologique.
<ol><li>Préparer un milieu de culture complet en ajoutant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de solution de pénicilline-streptomycine-amphotéricine B (PSA) au milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) à haute teneur en glucose.</li>
	<li>Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec du PSA en ajoutant 1% de PSA dans 1x PBS. Préparez PBS avec FBS en ajoutant 1% FBS à 1x PBS.</li>
	<li>Préparez plusieurs ciseaux, pinces et scalpels stérilisés par autoclavage.</li>
</ol>2. Obtention de tissus enlevés
<ol><li>Obtenir des tissus de patients chéloïdes par chirurgie. Recueillir les tissus chéloïdes frais dans un sac d’emballage stérile ou un tube à centrifuger stérile et les transférer dans une enceinte de sécurité biologique en laboratoire dès que possible. REMARQUE: Dans ce protocole, la taille du tissu chéloïde acquis était d’environ ~20 x 20 x 10 mm3, et la taille peut varier en fonction de la chirurgie.</li>
</ol>3. Isolement
<ol><li>Retirez le tissu chéloïde à l’aide d’une pince à épiler stérile et placez-le dans un tube centrifuge stérile de 50 ml contenant 10 à 25 ml de PBS avec 1% de PSA pendant 10 min. Ensuite, préparez une plaque de 6 puits et ajoutez 4 mL de PBS complété par 1% PSA à chaque puits. Retirez le mouchoir à l’aide d’une pince à épiler stérilisée et lavez-le deux fois avec du PBS supplémenté en PSA à 1%. À l’aide de pinces stériles, transférez le tissu séquentiellement d’un puits à l’autre.</li>
	<li>Retirez les couches adipeuses et épidermiques à l’aide de ciseaux chirurgicaux ou d’un scalpel chirurgical et laissez la couche dermique intacte. Couper et disséquer la couche de derme en 3-5 mm2 morceaux avec des ciseaux, transférer ces morceaux à l’aide de pinces stériles au puits suivant et les laver à nouveau dans du PBS avec une solution de PSA à 1%.</li>
</ol>4. La culture
<ol><li>Placez les morceaux de tissu dermique dans des boîtes de Petri à l’aide de forceps stérilisés; Assurez-vous que le nombre de pièces est compris entre 10 et 30 et que la distance entre chaque pièce est de >5 mm. Mettez les boîtes de Petri à l’envers dans un incubateur à 5% de CO2 à 37 °C pendant 30-60 minutes jusqu’à ce que les morceaux de tissus sèchent un peu et collez à la boîte de Pétri. Ensuite, ajoutez du DMEM complété par 10% FBS et 1% PSA, et placez soigneusement les boîtes de Petri dans un incubateur à 5% de CO2 à 37 ° C. NOTE: Les fibroblastes sont une population cellulaire morphologiquement et fonctionnellement hétérogène. Compte tenu de cette complexité, les étapes d’isolement et de culture doivent être effectuées avec soin; Sélectionnez les morceaux de tissu dermique chéloïde uniformément et mélangez-les bien avant de les placer dans la boîte de Pedia.</li>
	<li>Après 3 jours, remplacer la moitié du surnageant par un milieu de culture complet. Changez le milieu de culture tous les 2-3 jours. Observez les fibroblastes au microscope à un grossissement de 40x tous les jours. REMARQUE: Toutes les étapes doivent être effectuées en douceur. Ne déplacez pas la boîte de Petri pendant 2 jours après l’isolement, car les morceaux de tissu prennent du temps à adhérer aux boîtes de Pétri.</li>
	<li>Lorsque les fibroblastes qui se développent autour des morceaux de tissu atteignent environ 90% de confluence, retirez les morceaux de tissu et le milieu de culture. Lavez les fibroblastes avec 1x PBS stérile et ajoutez 2 ml de solution stérile 1x trypsine-EDTA aux plaques. Incuber les cellules pendant environ ~3-5 min à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 . Tapotez doucement le plat de culture et observez-le au microscope. Lorsque la majorité des cellules se détachent de la plaque, ajouter 2 mL de milieu complet pour mettre fin au processus de digestion.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml et centrifuger le tube à 300 × g pendant 3 minutes à température ambiante. Jeter soigneusement le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans un milieu complet. Ensemencer les fibroblastes dans une boîte de culture cellulaire de 9 cm et incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 .</li>
</ol>5. Entretien et préservation
<ol><li>Environ 3-4 jours plus tard, lorsque les fibroblastes ont atteint 80% de confluence, répétez les étapes 4.2-4.4 et passez les fibroblastes dans un rapport de 1:3. Utilisez les fibroblastes passés pour d’autres expériences. REMARQUE: La culture de fibroblastes doit être arrêtée après 10 passages, car les cellules peuvent commencer à montrer des caractéristiques modifiées par rapport aux cellules d’origine.</li>
	<li>Cryoconserver les cellules de passage de P1-P3 dans de l’azote liquide pour une utilisation ultérieure.<ol><li>Répétez les étapes 4.2 à 4.3. Transférer la suspension cellulaire dans un tube centrifuge stérile de 15 ml et centrifuger le tube pendant 3 min à 300 × g. Jeter soigneusement le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de congélation cellulaire contenant 90 % de FBS et 10 % de DMSO, et transférer la suspension dans des cryotubes cellulaires.</li>
		<li>Déplacez les cellules dans une boîte congelée, puis mettez la boîte congelée dans un congélateur à −80 °C. Après 1 jour, transférer les cellules dans de l’azote liquide pour une conservation à long terme.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Identification des fibroblastes par coloration par immunofluorescence
<ol><li>Placer des lamelles de couverture rondes dans une assiette de 24 puits et mettre en culture les fibroblastes passés à une concentration de 1 × 104 cellules/puits. Lorsque les fibroblastes atteignent 60% de confluence, retirez le milieu de culture. Ajouter 1 mL de paraformaldéhyde à 4% pour fixer les fibroblastes pendant 20 min à température ambiante, et laver 3x avec du PBS pendant 1 min à chaque fois. REMARQUE: Comptez le nombre de cellules à l’aide d’une lame d’hémocytomètre sous un microscope ou un compteur de cellules automatique.</li>
	<li>Retirer le PBS, incuber avec 0,5% de Triton X-100 pendant 20 min pour la perméabilisation des membranes cellulaires, puis laver 3x avec du PBS pendant 1 min à chaque fois. Ajouter le PBS avec 0,5 % d’albumine sérique bovine et laisser tremper pendant 30 minutes. Ensuite, retirez-le et ajoutez l’anticorps PDGFR-α/vimentine dilué dans un diluant d’anticorps à 1:1 000. Incuber pendant une nuit à 4 °C.</li>
	<li>Le lendemain, retirez l’anticorps primaire, lavez les cellules 3x avec du PBS pendant 3 min, et ajoutez l’anticorps secondaire Alexa Fluor-555 chèvre anti-lapin IgG dilué avec un diluant d’anticorps à 1:200 pour faire tremper pendant 1 h.</li>
	<li>Retirez l’anticorps secondaire et lavez les cellules 3x avec du PBS. Retirez les lamelles rondes à l’aide d’une pince, placez-les sur des lames de verre et ajoutez 50 μL de solution de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à 5 μg/mL pour colorer les noyaux cellulaires. Conservez les échantillons dans une boîte humide et sombre et observez-les au microscope confocale à fluorescence laser. REMARQUE: Ajouter un groupe témoin négatif sans anticorps primaire mais avec un anticorps secondaire pour exclure la coloration non spécifique.</li>
</ol>7. Identification des fibroblastes par cytométrie en flux
<ol><li>Recueillir la pastille cellulaire dans un tube centrifuge stérile de 1,5 mL et la remettre en suspension avec 50 μL de PBS contenant 1 % de FBS. Incuber avec anti-CD90 pendant 30 minutes dans l’obscurité et ajouter un contrôle d’isotype anti-IgG au groupe témoin. Ensuite, ajouter 200 μL de PBS contenant 1% de FBS et centrifuger le tube pendant 10 min à 300 × g à 4 °C.</li>
	<li>Retirer le surnageant et ajouter 200 μL de PBS contenant 1 % de FBS. Resuspendre et filtrer la suspension à travers une crépine à cellules (70 mesh). Ajouter une solution mère de 5 μg/mL de DAPI à 1:100 au filtrat, puis obtenir les résultats par cytométrie en flux. Définissez la diffusion vers l’avant (FSC) comme abscisse et la diffusion latérale (SSC) comme ordonnée, et encerclez la population cellulaire principale. Sélectionnez la population cellulaire et définissez la phycoérythrine comme abscisse et le nombre comme ordonnée pour l’analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883(2022).</li>
<li>Feng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+regulatory+factors+and+therapeutic+targets+in+keloid+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 906212(2022).</li>
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<li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+explant+culture%3A+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815(2021).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331(2022).</li>
<li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+PDGFR%CE%B1+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Temporal control of PDGFRα regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192(2022).</li>
<li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936(2022).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625(2022).</li>
<li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li>
</ol>

Il n’y a pas de conflits d’intérêts à déclarer.

L’obtention de fibroblastes primaires à partir de tissus chéloïdes est une base essentielle pour la poursuite des recherches. Jusqu’à présent, il existait deux méthodes d’acquisition de fibroblastes primaires: la digestion enzymatique et la culture d’explant11,12,13,14. Cependant, les deux méthodes traditionnelles ont des limites, telles que la susceptibilité à la contamination, le mélange avec...

Chéloïde, une maladie fibroproliférative, se manifeste par la croissance continue de plaques qui envahissent souvent la peau normale environnante sans autolimitation et provoquent divers degrés de démangeaisons, de douleurs et de fardeaux cosmétiques et psychologiques pour les patients1. Les fibroblastes, les cellules primaires impliquées dans les chéloïdes, jouent un rôle essentiel dans la formation et le développement de cette maladie par une prolifération excessive, une production redondante de matrice extracellulaire et des collagènes désorganisés 2,3. Cependant, la pathogenèse sous-jacente reste floue et il manque encore une méthode thérapeutique efficace pour la chéloïde; Par conséquent, il est urgent de poursuivre les recherches 4,5.
Comme il n’existe pas de modèle animal idéal pour la recherche chéloïde in vivo 6,7, la construction d’un modèle in vitro par l’acquisition de fibroblastes primaires à partir de tissus chéloïdes peut offrir faisabilité et fiabilité pour la recherche chéloïde 2,6. Les cellules primaires sont celles qui proviennent directement de tissus vivants, et il est généralement reconnu que ces cellules peuvent ressembler davantage à l’état physiologique et au bagage génétique de plusieurs individus que les lignées cellulaires 8,9. La culture de cellules primaires fournit un moyen puissant d’étudier la croissance et le métabolisme des cellules, ainsi que d’autres phénotypes cellulaires.
À l’heure actuelle, il existe deux méthodes d’acquisition de fibroblastes primaires: la digestion enzymatique et la culture d’explant. Cependant, plusieurs obstacles ont été identifiés à l’obtention de fibroblastes primaires, tels que le risque de contamination par diverses bactéries ou champignons, le mélange avec d’autres types de cellules qui ne sont pas facilement éliminées, la longue période du cycle de culture, les modifications ultérieures des caractéristiques cellulaires par rapport aux cellules d’origine, etc.9. Par conséquent, le développement d’un processus réalisable et efficace pour obtenir des fibroblastes primaires est la base d’études et d’applications ultérieures. Cette étude décrit un protocole optimisé pour extraire les fibroblastes primaires des tissus chéloïdes qui peuvent fournir efficacement et régulièrement des fibroblastes purs et viables.

<table><tbody><tr><td>Tube à centrifuger stérile de 1,5 mL</td><td>JETBIOFIL</td><td>CFT002015</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger stérile de 15 mL</td><td>JETBIOFIL</td><td>8076</td><td></td></tr><tr><td>4 % de polyformaldéhyde</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0099</td><td>Fixation cellulaire</td></tr><tr><td>Tube de centrifugation stérile de 50 mL</td><td>JETBIOFIL</td><td>8081</td><td>Mettre le tissu chéloïde</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-555 chèvre anti-lapin IgG&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>Alexa&nbsp ; Fluor&nbsp ; 555&nbsp ;</td><td>Deuxième anticorps pour le test de coloration par immunofluorescence</td></tr><tr><td>Anti humain CD90</td><td>BioLegend</td><td>B301002</td><td>Identifier la pureté des fibroblastes</td></tr><tr><td>Anticorps diluant</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0262</td><td></td></tr><tr><td>Enceinte de sécurité biologique&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 série A2</td><td>Cellules d’isolement et de culture</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>aladdin</td><td>B265993</td><td>Blocage pour le test de coloration par immunofluorescence</td></tr><tr><td>Incubateur de dioxyde de carbone</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td>Utilisation pour la culture de cellules</td></tr><tr><td>Cryotubes cellulaires</td><td>Corning</td><td>43513</td><td>Stocker les cellules dans une machine centrifuge à basse température</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>ST 16R</td><td>Surnageant de mise au rebut&nbsp ;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C1006</td><td>Colorer le noyau cellulaire</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>MP Biomedicals</td><td>196055</td><td>Utilisation pour la préservation des cellules</td></tr><tr><td>Milieu d’aigle modifié de Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>Milieu de culture solution</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>BI</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux</td><td>BD</td><td>BD FACSCelesta</td><td>Observation l’identité des cellules</td></tr><tr><td>congelées en boîte</td><td>Thermo Scientific</td><td>&nbsp ; 5100-0050</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal laser</td><td>Nikon</td><td>AIR-HD25</td><td>Observation du test de coloration par immunofluorescence</td></tr><tr><td>Anticorps PDGFR-&alpha ;</td><td>CST</td><td>3174T</td><td>Premier anticorps pour le test de coloration par immunofluorescence</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine Solution</td><td>Am Solarbio</td><td>P1410</td><td>Ajouter une solution de milieu de culture pour éviter la contamination</td></tr><tr>de la<td>boîte de Pétri</td><td>JETBIOFIL</td><td>7556</td><td>Fibroblastes de culture</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>Solution de milieu de culture</td></tr><tr><td>Lapin (DAIE) mAB IgG XR (R) Contrôle des isotuges (PE)</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>5742S</td><td>Comme contrôle pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Lambeau rond</td><td>Biosharp</td><td>801007</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Solarbio</td><td>T8200</td><td>Perforations dans la membrane cellulaire</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Utilisé pour le passage des cellules</td></tr><tr><td>Anticorps Vimentin</td><td>Abcam</td><td>ab8978</td><td>Premier anticorps pour le test de coloration par immunofluorescence</td></tr></tbody></table>

isolement, culture et caractérisation des fibroblastes cutanés primaires à partir de tissus chéloïdes humains

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

Les fibroblastes, le principal type cellulaire dans le tissu chéloïde, jouent un rôle essentiel dans la formation et le développement des chéloïdes. L’isolement et la culture de fibroblastes primaires dérivés de tissus chéloïdes sont à la base d’études plus approfondies de la fonction biologique et des mécanismes moléculaires des chéloïdes, ainsi que de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les traiter. La méthode traditionnelle d’obtention de fibroblastes primaires présente des limites, telles qu’un mauvais état cellulaire, le mélange avec d’autres types de cellules et la susceptibilité à la contamination. Cet article décrit un protocole optimisé et facilement reproductible qui pourrait réduire l’apparition de problèmes possibles lors de l’obtention de fibroblastes. Dans ce protocole, les fibroblastes peuvent être observés 5 jours après l’isolement et atteignent près de 80% de confluence après 10 jours de culture. Ensuite, les fibroblastes sont passés et vérifiés à l’aide d’anticorps PDGFRα et vimentine pour les tests d’immunofluorescence et d’anticorps CD90 pour la cytométrie en flux. En conclusion, les fibroblastes du tissu chéloïde peuvent être facilement acquis grâce à ce protocole, ce qui peut fournir une source abondante et stable de cellules dans le laboratoire pour la recherche chéloïde.

La chronologie du protocole est résumée à la figure 1A. Quelques images représentatives du processus d’isolement sont présentées à la figure 2; L’épiderme et les couches adipeuses ont été soigneusement enlevés et la couche dermique a été séparée en petits fragments de 3-4 mm2, qui ont été inoculés dans les boîtes de Pétri.
Comme le montre la figure 3A, plusieurs excroissances de fibroblaste...

Cette étude décrit un protocole optimisé pour établir des fibroblastes primaires à partir de tissus chéloïdes capables de fournir efficacement et régulièrement des fibroblastes purs et viables.

Isolement, culture et caractérisation des fibroblastes cutanés primaires à partir de tissus chéloïdes humains

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

L’isolement et la culture de fibroblastes primaires dérivés de tissus chéloïdes sont la base d’autres études sur les chéloïdes. Les fibroblastes du tissu chéloïde peuvent être facilement acquis grâce à ce protocole, qui peut fournir une source abondante et stable de cellules dans le laboratoire pour la recherche chéloïde. Commencez par utiliser une pince à épiler stérile pour placer le tissu chéloïde dans un tube centrifuge stérile de 50 millilitres contenant 10 à 25 millilitres de PBS complété par 1% de PSA.Pendant ce temps, ajoutez quatre millilitres de solution PBS PSA à chaque puits d’une plaque de six puits. Maintenant, retirez le mouchoir du tube et lavez deux fois avec une solution de PBS PSA. À l’aide d’une paire de pinces stériles, transférez le tissu séquentiellement d’un puits à l’autre.Ensuite, retirez les couches adipeuses et épidermiques avec des ciseaux chirurgicaux, laissant le derme intact. Utilisez une paire de ciseaux pour disséquer le derme taillé en morceaux de trois à cinq millimètres carrés et transférez les morceaux au puits suivant avec une paire de pinces stériles. Lavez les morceaux dans une solution PBS PSA.À l’aide de pinces stérilisées, placer 10 à 30

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Une façon rapide, robuste d'isoler des cellules adultes viables souches épithéliales de la peau humaine est décrite. La méthode utilise la digestion enzymatique de la matrice collagène de la peau, suivie par la plumaison des follicules pileux et à l'isolement des suspensions de cellules uniques ou fragments de tissus pour la culture cellulaire.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales adultes de la peau humaine

Le protocole de culture d'explants de fibroblastes humains à partir de biopsies de perforation de la peau est une façon techniquement robuste et simple à dériver des cellules de la peau dans les 4-8 semaines pour la banque d'environ 15-20 millions de cellules dans un certain nombre de passage faible.

Peau biopsie explantation Culture pour la dérivation de fibroblastes humains primaires

Cette vidéo présente un protocole d’isolement et de culture de cellules de Schwann à partir de tissus dermiques humains. Le derme humain contient différents types de cellules, notamment des fibroblastes et des cellules de Schwann. Après l’isolement, les cellules sont traitées avec un agent antimitotique pour éliminer les fibroblastes proliférants, ce qui permet d’obtenir une culture pure de cellules de Schwann.

Isolement et culture de cellules de Schwann primaires à partir d’un derme humain

Nous rapportons une méthode pour isoler les cellules naïves multipotentes précurseurs dérivés de la peau (SKP) à partir de cultures de fibroblastes humains primaires. Nous montrons que ces SKPs issus de cultures de fibroblastes partagent des propriétés semblables des cellules souches à celles provenant directement de biopsies de peau humaine. Ces cellules expriment le marqueur de la crête neurale, nestine, en plus des marqueurs tels que OCT4 multipotentes et Nanog.

Naïve cellules souches adultes Isolation de cultures de fibroblastes humains primaires

Le comportement des fibroblastes sous-tend un spectre d’entités cliniques, mais ils restent mal caractérisés, en grande partie en raison de leur hétérogénéité inhérente. La recherche traditionnelle sur les fibroblastes repose sur la manipulation in vitro, masquant le comportement des fibroblastes in vivo. Nous décrivons un protocole basé sur FACS pour l’isolement des fibroblastes de peau de souris qui ne nécessite pas de culture cellulaire.

Murin fibroblastes dermiques Isolation par FACS

Nous présentons ici un protocole pour isoler efficacement les kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte. Cette méthode simplifie la procédure conventionnelle en utilisant le Y-27632 inhibiteur ROCK dans le milieu de l’inoculation pour séparer spontanément les cellules épidermiques des cellules dermiques.

Une méthode simple et efficace d’isoler des kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte

Ce manuscrit décrit un protocole basé sur le FACS pour l’isolement des fibroblastes papillaires et réticulaires de la peau humaine. Il contourne la culture in vitro qui était inévitable avec le protocole d’isolement couramment utilisé par les cultures explant. Les sous-ensembles de fibroblastes qui émanent sont fonctionnellement distincts et présentent une expression et une localisation différentielles dans le derme.

Isolement des fibroblastes papillaires et réticulaires de la peau humaine par tri cellulaire activé par fluorescence

La reprogrammation cellulaire nécessite l'introduction de gènes clés, qui régulent et maintiennent l'état cellulaire pluripotent. Le protocole décrit permet la formation de colonies de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de fibroblastes dermiques humains sans méthodes virales/intégratrices, mais en utilisant des ARN non modifiés (NM-ARN) combinés à des facteurs d'évasion immunitaire réduisant les mécanismes de défense cellulaire.

Isolement des fibroblastes dermiques humains adultes de la peau abdominale et génération de cellules souches pluripotentes induites à l'aide d'une méthode de non-intégration

Le présent protocole décrit l’isolement et la culture de kératinocytes oraux dérivés du palais de souris adulte. Une méthode d’évaluation utilisant l’immunocoloration est également rapportée.

Isolement et culture de kératinocytes oraux primaires du palais de souris adulte

Cet article décrit une méthode basée sur la culture d’explants pour l’isolement et la culture de cellules musculaires lisses aortiques humaines primaires spécifiques au patient et de fibroblastes dermiques. En outre, une nouvelle méthode est présentée pour mesurer la contraction cellulaire et l’analyse ultérieure, qui peut être utilisée pour étudier les différences spécifiques au patient dans ces cellules.

Isolement des cellules musculaires lisses aortiques primaires spécifiques au patient et mesures semi-quantitatives de contraction en temps réel in vitro

L’étude de la cicatrisation des plaies associée aux lésions musculo-squelettiques nécessite souvent l’évaluation des interactions in vitro entre les cellules de Schwann (SC), les kératinocytes et les fibroblastes. Ce protocole décrit l’isolement, la culture et la caractérisation de ces cellules primaires à partir du prépuce humain.

Isolement, culture et caractérisation des cellules de Schwann primaires, des kératinocytes et des fibroblastes du prépuce humain

Apprenez à isoler et cultiver des fibroblastes cutanés primaires à partir de tissus chéloïdes humains. Cette méthode optimisée fournit une source stable de cellules viables pour la recherche sur les chéloïdes.

Isolement, culture et caractérisation des fibroblastes cutanés primaires à partir de tissus chéloïdes humains

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