Isolement, culture et caractérisation des fibroblastes cutanés primaires à partir de tissus chéloïdes humains
28 juillet 2023
Cette étude décrit un protocole optimisé pour établir des fibroblastes primaires à partir de tissus chéloïdes capables de fournir efficacement et régulièrement des fibroblastes purs et viables.
L’isolement et la culture de fibroblastes primaires dérivés de tissus chéloïdes sont la base d’autres études sur les chéloïdes. Les fibroblastes du tissu chéloïde peuvent être facilement acquis grâce à ce protocole, qui peut fournir une source abondante et stable de cellules dans le laboratoire pour la recherche chéloïde. Commencez par utiliser une pince à épiler stérile pour placer le tissu chéloïde dans un tube centrifuge stérile de 50 millilitres contenant 10 à 25 millilitres de PBS complété par 1% de PSA.
Pendant ce temps, ajoutez quatre millilitres de solution PBS PSA à chaque puits d’une plaque de six puits. Maintenant, retirez le mouchoir du tube et lavez deux fois avec une solution de PBS PSA. À l’aide d’une paire de pinces stériles, transférez le tissu séquentiellement d’un puits à l’autre.
Ensuite, retirez les couches adipeuses et épidermiques avec des ciseaux chirurgicaux, laissant le derme intact. Utilisez une paire de ciseaux pour disséquer le derme taillé en morceaux de trois à cinq millimètres carrés et transférez les morceaux au puits suivant avec une paire de pinces stériles. Lavez les morceaux dans une solution PBS PSA.
À l’aide de pinces stérilisées, placer 10 à 30 morceaux de tissu dermique espacés de moins de cinq millimètres dans des boîtes de Pétri. Placez les plats à l’envers dans un incubateur jusqu’à ce que les morceaux sèchent et collent au plat. Ensuite, ajoutez sept millilitres de DMEM complétés par 10% FBS et 1% PSA, et incuber les plats comme avant.
Après trois jours, remplacer la moitié du surnageant par un milieu de culture complet. Observez les fibroblastes quotidiennement sous un grossissement microscopique de 40X. Retirez les morceaux de tissu dans le milieu de culture lorsque les fibroblastes atteignent 90% de confluence.
Lavez les fibroblastes dans du PBS et ajoutez deux millilitres de solution stérile de trypsine EDTA. Après avoir incubé les cellules dans un incubateur humidifié, tapotez doucement le plat de culture et observez-le au microscope. Ajouter deux millilitres de milieu complet pour terminer la digestion une fois que la plupart des cellules se sont détachées.
Maintenant, transférez la suspension cellulaire dans un tube centrifuge stérile de 15 millilitres et centrifugez le tube à 300G pendant trois minutes à température ambiante. Jeter soigneusement le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans un milieu complet. Ensemencez les fibroblastes dans une boîte de culture cellulaire de neuf centimètres et incuber dans un incubateur humidifié.
Pour effectuer une analyse immunofluorescente après avoir cultivé les fibroblastes sur des lamelles de couverture rondes et les avoir incubés dans des anticorps primaires et secondaires, ajoutez 50 microlitres de solution DAPI à la lame de verre pour colorer les noyaux cellulaires. Placez les lames de couverture lavées sur des lames de verre à l’aide de pinces. Enfin, transférez les échantillons dans une boîte sombre humide pour la microscopie fluorescente.
Des excroissances de fibroblastes du tissu ont été observées cinq jours après le traitement. Les fibroblastes ont affiché des taux de prolifération élevés et ont atteint la confluence après 10 jours. Les fibroblastes avaient des corps cellulaires allongés et fusiformes, qui étaient alignés en faisceaux à forte confluence.
La coloration immunofluorescente a renvoyé une immunofluorescence rouge positive des fibroblastes et une immunofluorescence bleue du noyau cellulaire. Les tests de cytométrie en flux ont montré une positivité de CD90 dans presque tous les fibroblastes. Cette étude a décrit une méthode optimisée et fourni des instructions claires pour résoudre les défis existants et augmenter les chances de succès pour l’isolement et la culture des fibroblastes chéloïdes.
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Aperçu
Cette étude décrit un protocole optimisé pour l'établissement de fibroblastes primaires à partir de tissus chéloïdiens, capable de fournir efficacement et de manière stable des fibroblastes purs et viables. L'isolement et la culture de ces fibroblastes sont essentiels pour faire progresser la recherche sur les chéloïdes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Culture cellulaire
- Isolation des fibroblastes
- Recherche sur les kélidoïdes
Contexte
- Les kélidoïdes sont des cicatrices anormales qui peuvent être difficiles à étudier.
- Les fibroblastes primaires sont essentiels pour comprendre la biologie des kélidoïdes.
- Les protocoles existants peuvent ne pas assurer une viabilité cellulaire suffisante.
- Cette étude vise à améliorer le processus d'isolement.
Objectif de l'étude
- Établir une méthode fiable pour isoler les fibroblastes à partir de tissus chéloïdiens.
- Fournir une source stable de fibroblastes pour la recherche en laboratoire.
- Approfondir la compréhension de la formation et du traitement des chéloïdes.
Méthodes utilisées
- Utilisation de pinces stériles et de tubes de centrifugation pour la manipulation des tissus.
- Lavage du tissu chéloïdien avec du PBS supplémenté de 1 % de PSA.
- Transfert séquentiel du tissu entre les puits d'une plaque de six puits.
- Mise en place des conditions de culture pour la croissance des fibroblastes.
Résultats principaux
- Isolation réussie de fibroblastes viables à partir de tissus chéloïdiens.
- Le protocole fournit une source abondante de cellules pour la recherche.
- Les fibroblastes ont conservé leur stabilité et leur viabilité au fil du temps.
- A permis des études approfondies sur la biologie des chéloïdes.
Conclusions
- Le protocole optimisé est efficace pour l'isolement des fibroblastes.
- Fournit une base pour les recherches futures sur les kélidoïdes.
- Améliore le potentiel de progrès thérapeutiques dans le traitement des kélidoïdes.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement et la culture fiables de fibroblastes dermiques primaires à partir de tissu chéloïdien répondent à un besoin critique en modèles cellulaires pertinents pour la découverte précoce de médicaments. Ce protocole permet un accès reproductible à des populations pures de fibroblastes validées, soutenant ainsi les études mécanistiques et la validation de cibles thérapeutiques dans les affections cutanées fibrotiques. Cette approche renforce la fiabilité prédictive et la continuité translationnelle des tests d'hypothèses thérapeutiques dans les programmes de recherche sur les chéloïdes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'analyse des voies induites par les fibroblastes impliquées dans la pathogenèse des chéloïdes.
- Contribue à l'atténuation des risques biologiques en fournissant des cellules primaires validées fonctionnellement.
- Facilite les études mécanistiques permettant de préciser le rôle des cibles dans les maladies fibrotiques.
- Améliore la fiabilité prédictive des décisions précoces de tri du portefeuille.
Développement de tests et criblage
- Offre une source reproductible de fibroblastes primaires pour la standardisation des tests.
- Permet le développement de tests quantitatifs basés sur des cellules pour l'évaluation de composés.
- Facilite la reproductibilité et l'extensibilité dans les protocoles de criblage.
- Réduit la variabilité en minimisant la contamination et le mélange avec des cellules non fibroblastiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les modèles in vitro avec des types cellulaires humains pertinents pour la maladie, afin d'étudier la translation.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique dans la recherche sur les kélidoïdes.
- Facilite l'avancement des candidats anti-fibrosants en fonction du niveau de risque.
- Offre une plateforme pour la découverte et la validation de biomarqueurs, lorsqu'elle est associée à des études complémentaires.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole place l'isolement des fibroblastes kélidoïdes primaires à l'interface entre la découverte précoce et la recherche préclinique, permettant ainsi une validation solide des cibles et le développement de tests pour les voies de recherche sur les maladies cutanées fibrotiques.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies impliquées dans la pathogenèse des kélidoïdes.
- Écrantage : Fournit des systèmes cellulaires validés et reproductibles pour le développement d'essais quantitatifs.
- Analytique : Permet la caractérisation par immunofluorescence et cytométrie en flux afin de confirmer l'identité cellulaire.
- Recherche translationnelle : Propose des modèles cellulaires pertinents pour l'évaluation préclinique de thérapeutiques candidates.
- Réutilisation en milieu professionnel : Établit un protocole standardisé adaptable à différentes équipes de recherche et projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la recherche sur les kéliodes.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et l'extensibilité des protocoles utilisant des cellules primaires.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions d'orientation (go/no-go) et l'efficacité du capital dans les programmes en phase précoce.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation et une avancée ajustées au risque des actifs anti-fibrosants.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation stérile des tissus et en techniques de culture cellulaire primaire.
- Suppose un accès à des installations de culture cellulaire ainsi qu'à des instruments d'immunofluorescence et de cytométrie en flux.
- Exige une standardisation interéquipes pour l'isolement et la caractérisation reproductibles des cellules.
- Pourrait nécessiter des adaptations pour d'autres sources de tissus fibrotiques ou dermiques.
- Les limites potentielles incluent la variabilité entre donneurs et la disponibilité des tissus.
