Name: Microinjection ciblée et électroporation d’organoïdes cérébraux de primates pour la modification génétique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T12:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Découvrez l'électroporation d'organoïdes cérébraux de primates pour modifier génétiquement les progéniteurs corticaux. Cette méthode précise permet d'étudier le développement cérébral et l'évolution néocorticale.

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Nous nous excusons auprès de tous les chercheurs dont les travaux n’ont pas pu être cités en raison du manque d’espace. Nous remercions Ulrich Bleyer des services techniques de DPZ et Hartmut Wolf de l’atelier de MPI-CBG pour la construction des chambres d’électrodes de la boîte de Petri ; Stoyan Petkov et Rüdiger Behr pour avoir fourni des CSPi humaines (iLonza2.2), rhésus (iRh33.1) et ouistitis (cj_160419_5); Sabrina Heide pour la cryosectionnement et la coloration par immunofluorescence; et Neringa Liutikaite et César Mateo Bastidas Betancourt pour la lecture critique du manuscrit. Les travaux dans le laboratoire de W.B.H. ont été soutenus par une subvention ERA-NET NEURON (MicroKin). Les travaux dans le laboratoire de M.H. ont été soutenus par une bourse de démarrage du CER (101039421).

Modification génétique des organoïdes cérébraux de primates

<ol><li>Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+neurodegenerative+and+neurodevelopmental+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases.</a> Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).</li>
<li>Zhao, X., Bhattacharyya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+models+are+needed+for+studying+human+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders.</a> The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+microcephaly+with+cerebral+organoids+reveals+a+WDR62%E2%80%93CEP170%E2%80%93KIF2A+pathway+promoting+cilium+disassembly+in+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors.</a> Nature Communications. 10 (1), 2612(2019).</li>
<li>Sasaki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgenic+non-human+primates+with+germline+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of transgenic non-human primates with germline transmission.</a> Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).</li>
<li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rhesus+monkeys+produced+by+gene+transfer+into+early-cleavage%E2%80%93stage+embryos+using+a+simian+immunodeficiency+virus-based+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).</li>
<li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+gene-modified+cynomolgus+monkey+via+Cas9%2FRNA-mediated+gene+targeting+in+one-cell+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos.</a> Cell. 156 (4), 836-843 (2014).</li>
<li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rhesus+monkeys+carrying+the+human+MCPH1+gene+copies+show+human-like+neoteny+of+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22National+Science+Review%22%5BJournal%5D)">Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development.</a> National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).</li>
<li>Heide, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-specific+ARHGAP11B+increases+size+and+folding+of+primate+neocortex+in+the+fetal+marmoset%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset.</a> Science. 369 (6503), 546-550 (2020).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell%E2%80%93derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+models+of+human+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell models of human brain development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li>
<li>Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).</li>
<li>Arlotta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+required%21+A+new+path+to+understanding+human+brain+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease.</a> Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).</li>
<li>Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids+as+models+to+study+human+neocortex+development+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution.</a> Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).</li>
<li>Qian, X., Song, H., Ming, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids%3A+Advances%2C+applications+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brain organoids: Advances, applications and challenges.</a> Development. 146 (8), dev166074(2019).</li>
<li>Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+brain+organoids+in+neurodevelopment+and+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases.</a> Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30(2021).</li>
<li>Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of brain organoids.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 558(2019).</li>
<li>Pașca, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nomenclature+consensus+for+nervous+system+organoids+and+assembloids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids.</a> Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).</li>
<li>Kyrousi, C., Cappello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+brain+organoids+to+study+human+neurodevelopment%2C+evolution+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347(2020).</li>
<li>Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+in+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering in organoids.</a> Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 555-568 (2021).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genetic+manipulation+of+cortical+progenitors+in+gyrencephalic+carnivores+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation.</a> Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).</li>
<li>Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+genetic+manipulation+of+gyrencephalic+carnivores+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation.</a> Molecular Brain. 5 (1), 24(2012).</li>
<li>Bai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).</li>
<li>Kalebic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-induced+disruption+of+gene+expression+in+mouse+embryonic+brain+and+single+neural+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo.</a> EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).</li>
<li>Fischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-specific+ARHGAP11B+ensures+human-like+basal+progenitor+levels+in+hominid+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids.</a> EMBO Reports. 23 (11), e54728(2022).</li>
<li>Stauske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-human+primate+iPSC+generation%2C+cultivation%2C+and+cardiac+differentiation+under+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions.</a> Cells. 9 (6), 1349(2020).</li>
<li>Mora-Bermúdez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+and+similarities+between+human+and+chimpanzee+neural+progenitors+during+cerebral+cortex+development%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development.</a> eLife. 5, e18683(2016).</li>
<li>Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+switch+from+neurogenesis+to+pluripotency+during+marmoset+monkey+somatic+cell+reprogramming+with+self-replicating+mRNAs+and+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules.</a> Cells. 9 (11), 2422(2020).</li>
<li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).</li>
<li>Kanton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+single-cell+genomic+atlas+uncovers+human-specific+features+of+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development.</a> Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li>
<li>Cakir, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+human+brain+organoids+with+a+functional+vascular-like+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system.</a> Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).</li>
<li>Masselink, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+applicability+of+a+streamlined+ethyl+cinnamate-based+clearing+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure.</a> Development. 146 (3), dev166884(2019).</li>
<li>Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+and+electroporation+of+plasmid+DNA+into+human+cortical+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101129(2022).</li>
<li>Denoth-Lippuner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+individual+cell+division+history+in+complex+tissues+using+iCOUNT%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT.</a> Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).</li>
<li>Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgens+increase+excitatory+neurogenic+potential+in+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids.</a> Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+self-organization+and+cortical+plate+formation+in+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).</li>
<li>Kalebic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+expansion+due+to+increased+proliferation+of+basal+progenitors+is+linked+to+changes+in+their+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology.</a> Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Les procédures décrites ici représentent un protocole unifié pour la génération d’organoïdes cérébraux à partir de différentes espèces de primates avec une approche d’électroporation ciblée. Cela permet l’expression ectopique d’un GOI dans un système modèle qui émule le développement du néocortex (patho)physiologique des primates (y compris humains). Ce protocole unifié pour la génération d’organoïdes cérébraux de primates utilise les mêmes matériaux (p. ex., les mêmes milieux) et les mêmes étapes de protocole pour les q...

Étudier le développement (physio)physiologique et l’évolution du cortex cérébral est une tâche formidable qui est entravée par le manque de systèmes modèles appropriés. Auparavant, ces études se limitaient à des modèles de culture cellulaire bidimensionnelle (tels que les cultures de cellules neuronales primaires ou neuronales) et à des modèles animaux distants de l’évolution (tels que les rongeurs)1,2. Bien que ces modèles soient utiles pour répondre à certaines questions, ils sont limités dans la modélisation de la complexité, de la composition du type cellulaire, de l’architecture cellulaire et des modèles d’expression génique du néocortex humain en développement dans des états sains et malades. Ces limitations conduisent, par exemple, à la faible transposabilité des modèles murins de maladies humaines à la situation humaine, comme décrit pour certains cas de microcéphalie (par exemple, Zhang et al.3). Récemment, les primates transgéniques non humains, qui sont un modèle évolutif, fonctionnel et morphologiquement plus proche du développement du néocortex humain, ont attiré l’attention 4,5,6,7,8 alors qu’ils surmontent de nombreuses limitations des modèles basés sur la culture cellulaire et les rongeurs. Cependant, l’utilisation de primates non humains dans la recherche est non seulement très coûteuse et prend beaucoup de temps, mais soulève également des préoccupations éthiques. Plus récemment, le développement de la technologie des organoïdes cérébraux 9,10 est apparu comme une alternative prometteuse qui résout bon nombre des limitations des modèles précédents 11,12,13,14,15,16.
Les organoïdes cérébraux sont des structures multicellulaires tridimensionnelles (3D) qui émulent les principales caractéristiques de la cytoarchitecture et de la composition de type cellulaire d’une ou de plusieurs régions du cerveau pendant une fenêtre temporelle de développement définie 11,12,13,14,17. Ces structures 3D sont générées soit à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) ou, si elles sont disponibles pour l’espèce d’intérêt, à partir de cellules souches embryonnaires (CSE). En général, deux types d’organoïdes cérébraux peuvent être distingués en fonction de la méthodologie utilisée: les organoïdes cérébraux non guidés et régionalisés (guidés)18. Lors de la génération de ce dernier type d’organoïdes, de petites molécules ou facteurs sont fournis qui guident la différenciation des cellules souches pluripotentes en organoïdes d’une région particulière du cerveau (par exemple, les organoïdes du cerveau antérieur)18. En revanche, chez les organoïdes non guidés, la différenciation n’est pas guidée par l’addition de petites molécules, mais repose exclusivement sur la différenciation spontanée des CSPi/ESC. Les organoïdes cérébraux qui en résultent sont constitués de types de cellules représentant différentes régions du cerveau (p. ex., les organoïdes cérébraux)18. Les organoïdes cérébraux combinent de nombreuses caractéristiques clés du développement du cerveau avec une génération relativement rentable et rapide à partir de toute espèce d’intérêt pour laquelle des CSPi ou des CSE sont disponibles11,12,13,14. Cela fait des organoïdes cérébraux un excellent modèle pour de nombreux types d’études neurobiologiques, allant des questions évolutives et développementales à la modélisation des maladies et aux tests de médicaments15,16. Cependant, la résolution de ces questions à l’aide d’organoïdes cérébraux dépend fortement de la disponibilité de différentes méthodes de modification génétique.
Un aspect clé de l’étude du développement (physio)physiologique du néocortex et de son évolution est l’analyse fonctionnelle des gènes et des variantes génétiques. Ceci est généralement réalisé par expression (ectopique) et / ou par knock-down (KD) ou knock-out (KO) de ces gènes. Ces modifications génétiques peuvent être classées en modifications génétiques stables et transitoires, ainsi qu’en modifications limitées temporellement et spatialement ou non restreintes. La modification génétique stable est définie par l’introduction d’une altération génétique dans le génome de l’hôte qui est transmise à toutes les générations cellulaires ultérieures. Selon le moment de la modification génétique, elle peut affecter toutes les cellules d’un organoïde ou peut être limitée à certaines populations cellulaires. Le plus souvent, une modification génétique stable est obtenue dans les organoïdes cérébraux au niveau iPSC/ESC en appliquant des lentivirus, des systèmes de type transposon et la technologie CRISPR/Cas9 (examinée par, par exemple, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19, et Teriyapirom et al.20). Cela a l’avantage que toutes les cellules de l’organoïde cérébral portent la modification génétique et qu’elle n’est pas restreinte dans le temps ou dans l’espace. Cependant, la génération et la caractérisation de ces lignées stables d’iPSC/ESC prennent beaucoup de temps, prenant souvent plusieurs mois avant que les premiers organoïdes cérébraux modifiés puissent être analysés (examinés par exemple par Fischer et al.17, Kyrousi et al.19, ou Teriyapirom et al.20).
En revanche, la modification génétique transitoire est définie par la livraison d’une cargaison génétique (p. ex., un plasmide d’expression génique) qui ne s’intègre pas dans le génome de l’hôte. Bien que cette modification puisse, en principe, être transmise aux générations cellulaires suivantes, la cargaison génétique délivrée sera progressivement diluée à chaque division cellulaire. Par conséquent, ce type de modification génétique est généralement limité dans le temps et dans l’espace. La modification génétique transitoire peut être effectuée dans les organoïdes cérébraux par des virus adéno-associés ou par électroporation (examinés par, par exemple, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 et Teriyapirom et al.20), ces derniers étant décrits en détail dans cet article. Contrairement à la modification génétique stable, cette approche est très rapide et rentable. En effet, l’électroporation peut être effectuée en quelques minutes et, selon la ou les populations de cellules cibles, les organoïdes électroporés sont prêts à être analysés en quelques jours (examinés par, par exemple, Fischer et al.17 et Kyrousi et al.19). Cependant, les changements morphologiques bruts de l’organoïde cérébral, tels que les différences de taille, ne peuvent pas être détectés à l’aide de cette méthode, car ce type de modification génétique est limité dans le temps et dans l’espace. Cette restriction peut également être un avantage, par exemple, dans le cas de l’étude de populations cellulaires individuelles au sein de l’organoïde ou des effets sur les organoïdes cérébraux à des moments précis du développement (examinés par, par exemple, Fischer et al.17 et Kyrousi et al.19).
Une approche classique pour étudier la fonction des gènes au cours du développement et de l’évolution du cerveau est l’électroporation in utero. L’électroporation in utero est une technique bien connue et utile pour l’administration de constructions d’expression génique dans les cerveaux des rongeurs 21,22,23 et des furets24,25. Tout d’abord, une solution contenant la ou les constructions d’expression d’intérêt est microinjectée à travers la paroi utérine dans un certain ventricule du cerveau embryonnaire, en fonction de la région à cibler. Dans la deuxième étape, des impulsions électriques sont appliquées pour transfecter les cellules qui tapissent directement le ventricule ciblé. Cette approche ne se limite pas seulement à l’expression ectopique ou à la surexpression des gènes, car elle peut également être appliquée dans les études KD ou KO par micro-injection d’épingle à cheveux courte (shRNA) ou de CRISPR/Cas9 (sous forme de plasmides d’expression ou de ribonucléoprotéines [RNP]), respectivement26,27. Cependant, l’électroporation in utero d’embryons de souris, de rats et de furets présente les mêmes limites que celles décrites ci-dessus pour ces modèles animaux.
Idéalement, on aimerait effectuer une électroporation in utero directement chez les primates. Bien que cela soit, en principe, techniquement possible, l’électroporation in utero n’est pas effectuée chez les primates en raison de préoccupations éthiques, de coûts élevés d’entretien des animaux et de la petite taille des portées. Pour certains primates, comme les grands singes (y compris les humains), ce n’est pas possible du tout. Cependant, ces primates ont le plus grand potentiel pour l’étude du développement du néocortex humain (physionomique) physiologique et de son évolution. Une solution à ce dilemme est d’appliquer la technique d’électroporation aux organoïdes cérébraux des primates28.
Cet article présente un protocole pour l’électroporation d’un sous-type d’organoïdes cérébraux de primates, les organoïdes cérébraux des primates. Cette approche permet la modification génétique rapide et rentable des populations cellulaires dans les structures ventriculaires des organoïdes. Plus précisément, nous décrivons un protocole unifié pour la génération d’organoïdes cérébraux de primates à partir d’iPSC humains (Homo sapiens), de chimpanzés (Pan troglodytes), de macaques rhésus (Macaca mulatta) et de ouistiti commun (Callithrix jacchus). De plus, nous décrivons en détail la technique de micro-injection et d’électroporation et fournissons des critères « go » et « no-go » pour effectuer l’électroporation organoïde cérébrale des primates. Cette approche est un outil efficace pour étudier le développement (physionomophysiologique) du néocortex et son évolution dans un modèle particulièrement proche de la situation humaine.

<table><tbody><tr><td>20 et micro ; L Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>8.05740.0005</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire de 35 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire de 60 mm</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-3359</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP3003</td><td></td></tr><tr><td>AOC1</td><td>Selleckchem</td><td>S7217</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 Microscope à fluorescence inversée</td><td>Zeiss</td><td></td><td>remplaçable par des microscopes fluorescents comparables</td></tr><tr><td>AZD0530</td><td>Selleckchem&nbsp ;</td><td>S1006</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplément de vitamine A (acide rétinoïque, RA) (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>B-27 sans vitamine A (50x)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM 830 Système d’électroporation à ondes carrées</td><td>BTX</td><td>45-2052</td><td></td></tr><tr><td>CGP77675</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0314</td><td></td></tr><tr><td>lignée de cellules souches pluripotentes induite par le chimpanzé Sandra A</td><td></td><td></td><td>doi : 10.7554/elife.18683&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lignée de cellules souches pluripotentes induites par le ouistiti commun cj_160419_5</td><td></td><td></td><td>doi : 10.3390/cells9112422</td></tr><tr><td>Mélange de milieux et de nutriments modifiés Eagle de Dulbecco F-12 (DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>pH 7,0 et moins ; 7.3; Chauffer à température ambiante avant utilisation</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Selleckchem</td><td>2449</td><td></td></tr><tr><td>Supplément GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Supplément de substitut de glutamine</td></tr><tr><td>Héparine (1 mg/mL stock)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Lignée de cellules souches pluripotentes induites par l’homme iLonza2.2</td><td></td><td></td><td>doi : 10.3390/cells9061349</td></tr><tr><td>Neurotrophine-3 humaine (NT-3)</td><td>PeproTech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope Leica MS5 (base en lumière transmise MDG 17)</td><td>Leica</td><td>10473849</td><td>remplaçable par des stéréomicroscopes comparables</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277/354234</td><td>matrice de membrane basale ; alternativement, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) peut être utilisé</td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Merck 818715 poignée avec causion due à la cancérogénicité</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>PanBiotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’électrode en boîte de Pétri</td><td>autoproduite (voir Dossier supplémentaire 1)</td><td></td><td>également disponible dans le commerce</td></tr><tr><td>Pipettes en verre pré-tiré</td><td>WPI</td><td>TIP10LT</td><td>pipettes en verre borosilicaté à cône long, 10 &micro ; m tip</td></tr><tr><td>diameter Pro-Survival Compound</td><td>MerckMillipore</td><td>529659</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human/Murine/RatBrain Derived Neurotrophic Factor (BDNF)</td><td>PeproTech</td><td>AF-450-02</td><td></td></tr><tr><td>Lignée de cellules souches pluripotentes induite par le macaque rhésus iRh33.1</td><td></td><td></td><td>doi : 10.3390/cells9061349</td></tr><tr><td>StemMACS iPS-Brew XF</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-104-368</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de dissociation cellulaire StemPro Accutase</td><td>Gibco</td> A1110501 <td>mélange d’enzymes protéolytiques et collagénolytiques</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604-013</td><td>substitut de trypsine recombinant ; réchauffé à température ambiante avant</td></tr><tr><td>utilisation Fixation ultra-faible Plaques à 96 puits</td><td>Costar</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72305</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection ciblée et électroporation d’organoïdes cérébraux de primates pour la modification génétique

Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification

Le cortex cérébral est la structure cérébrale la plus externe et est responsable du traitement des entrées sensorielles et des sorties motrices; Il est considéré comme le siège des capacités cognitives d’ordre supérieur chez les mammifères, en particulier les primates. L’étude des fonctions des gènes dans le cerveau des primates est difficile pour des raisons techniques et éthiques, mais la mise en place de la technologie organoïde du cerveau a permis l’étude du développement du cerveau dans des modèles traditionnels de primates (par exemple, le macaque rhésus et le ouistiti commun), ainsi que chez des espèces de primates auparavant inaccessibles expérimentalement (par exemple, les grands singes), dans un système éthiquement justifiable et moins exigeant techniquement. De plus, les organoïdes cérébraux humains permettent l’investigation avancée des troubles neurodéveloppementaux et neurologiques.
Comme les organoïdes cérébraux récapitulent de nombreux processus de développement du cerveau, ils représentent également un outil puissant pour identifier les différences et comparer fonctionnellement les déterminants génétiques sous-jacents au développement du cerveau de diverses espèces dans un contexte évolutif. Un grand avantage de l’utilisation d’organoïdes est la possibilité d’introduire des modifications génétiques, ce qui permet de tester les fonctions des gènes. Cependant, l’introduction de telles modifications est laborieuse et coûteuse. Cet article décrit une approche rapide et rentable pour modifier génétiquement les populations cellulaires dans les structures ventriculaires des organoïdes cérébraux des primates, un sous-type d’organoïdes cérébraux. Cette méthode combine un protocole modifié pour la génération fiable d’organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) humaines, chimpanzés, macaques rhésus et communes dérivées de ouistitis. Cela fournit un outil efficace pour l’étude des processus neurodéveloppementaux et évolutifs qui peut également être appliqué à la modélisation de la maladie.

Le protocole décrit ici permet la génération efficace d’organoïdes cérébraux à partir de lignées d’iPSC humaines, de chimpanzés, de macaques rhésus et de ouistitis communs avec un minimum de modifications temporelles requises entre les espèces (Figure 1A). Ces organoïdes peuvent être électroporés dans la plage de 20 dps à 50 dps, selon l’accessibilité des structures ventriculaires et l’abondance de la ou des populations cellulaires d’intérêt. Cependant, avant l’électroporation, il est import...

L’électroporation des organoïdes cérébraux des primates fournit une approche précise et efficace pour introduire des modifications génétiques transitoires dans différents types de progéniteurs et de neurones dans un système modèle proche du développement du néocortex (patho)physiologique des primates. Cela permet l’étude des processus neurodéveloppementaux et évolutifs et peut également être appliqué à la modélisation des maladies.

Microinjection ciblée et électroporation d’organoïdes cérébraux de primates pour la modification génétique

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of ...

Notre domaine de recherche est le développement et l’évolution du cerveau des primates. Nous essayons de comprendre les facteurs sous-jacents à l’expansion néocorticale chez les primates. Pour répondre à cette question de manière pratique et éthiquement justifiable, nous utilisons les organoïdes cérébraux comme modèle de recherche.Des différences dans le développement du cerveau entre les humains modernes, nous et les Néandertaliens sont récemment apparues. Ces différences sont dues à un petit nombre de changements d’acides aminés dans les protéines avec des rôles clés dans le développement du cerveau. Les organoïdes cérébraux ont été un système modèle crucial dans ces études.L’étude du développement des primates d’un point de vue évolutif est importante en menant des études de gain et de perte de fonction. Cependant, les singes, y compris les humains, ne peuvent naturellement pas être utilisés pour de telles expériences, de sorte que la modification génétique des organoïdes joue un rôle vital dans ce domaine. Alors qu’il travaillait comme post-doctorant dans mon laboratoire, Michael Heide a démontré que le gène spécifique humain ARHGAP11B était un acteur clé dans l’augmentation de la taille du cerveau au cours de l’évolution humaine.En tant que chef de groupe au Centre allemand des primates, Michael a apporté des informations cruciales en comparant les organoïdes cérébraux humains et chimpanzés. Notre protocole offre une approche ciblée pour les modifications génétiques par des structures spécifiques de type ventricule à micro-injection au lieu de cuvettes d’électroporation commerciales. Cette approche utilise une configuration rentable comprenant un électroporateur à ondes carrées et une chambre d’électrode de boîte de Petri au lieu de solutions d’effecteurs nucléaires coûteuses.Bien que l’étude de la fonction et du développement du cerveau chez les primates par modification génétique soit techniquement possible, elle est méthodologiquement exigeante, coûteuse et non autorisée pour les grands singes. L’électroporation des organoïdes cérébraux des primates fournit une approche rapide et rentable pour introduire des modifications génétiques dans un modèle proche du développement du cerveau des primates. À l’avenir, nous aimerions nous concentrer sur la caractérisation des gènes exprimés différentiellement dans le cortex de différentes espèces de primates.Nous étudierons ces gènes par électroporation d’organoïdes cérébraux de primates et analyserons leurs effets potentiels sur les cellules progénitrices corticales.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Le but du présent protocole est d’isoler les primates non-humains CD34+ des cellules de moelle apprêtée, gène-modification de ces cellules avec des vecteurs lentiviraux et de préparer un produit infusion dans l’hôte autologue. La longueur totale de protocole est d’environ 48 h.

Préparation et Modification de gène de Primate non-humaine souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices

Telle qu’elle est actuellement mise en œuvre, l’optogénétique chez les primates non humains nécessite l’injection de vecteurs viraux dans le cerveau. Une méthode d’injection optimale doit être fiable et, pour de nombreuses applications, capable de cibler des sites individuels de profondeur arbitraire qui sont facilement et sans ambiguïté identifiés en histologie post-mortem. Une méthode d’injection avec ces propriétés est présentée.

Injections de vecteurs AAV pour l’optogénétique dans le cerveau de primates non humains anesthésiés et éveillés

Ici, nous présentons la manipulation génétique aiguë d’organoïdes corticaux humains tranchés par électroporation. Ces modèles d’organoïdes corticaux sont particulièrement susceptibles d’être injectés car les structures semblables aux ventricules peuvent être facilement identifiées après le tranchage, ce qui permet l’étude fonctionnelle du développement cortical humain, des troubles neurodéveloppementaux et de l’évolution corticale.

Électroporation d’organoïdes corticaux humains tranchés pour l’étude de la fonction des gènes

Ce protocole décrit l’induction efficace de l’endothélium hémogène et des progéniteurs hématopoïétiques multipotentiels à partir de cellules souches pluripotentes humaines via l’expression forcée de facteurs de transcription.

Induction directe de Hemogenic endothélium et le sang par la surexpression de facteurs de transcription dans pluripotentes humaines Cellules souches

Nous décrivons ici une procédure basée sur l’utilisation de particules lentivirales pour la modification génétique à long terme des cellules souches neurales et/ou de leurs cellules épendymaires adjacentes dans la niche neurogène ventriculaire-sous-ventriculaire adulte qui permet l’analyse séparée des effets autonomes et non autonomes des cellules dépendantes de la niche sur les cellules souches neurales.

Stable et efficace modification génétique de cellules dans le Adulte souris V-SVZ pour l&#39;analyse des cellules souches neurales autonome et effets non autonomes

La couche de granules cérébelleux externe est le site de la plus grande amplification de transit dans le cerveau en développement. Ici, nous présentons un protocole de cibler la modification génétique de cette couche au sommet de la prolifération utilisant ex électroporation et la culture de tranches de cervelet vivo à partir embryonnaires Jour 14 embryons de poulet.

Culture ex vivo de Chick cervelet tranches et spatialement ciblées électroporation de granules précurseurs de cellules

La quantification du renouvellement des cardiomyocytes est un défi. Le protocole décrit ici apporte une contribution importante à ce défi en permettant une quantification précise et sensible de la génération de noyaux de néo-cardiomyocytes et de la ploïdie des noyaux.

Évaluation simultanée de cardiomyocytes synthèse de l&#39;ADN et Ploïdie: Une méthode pour aider Quantification de cardiomyocytes Régénération et Chiffre d&#39;affaires

Manipulations transgéniques et l' édition du génome sont essentielles pour tester fonctionnellement le rôle des gènes et des éléments cis -Informations règlementaires. Voici un protocole de microinjection détaillé pour la génération de modifications génomiques (y compris les constructions fluorescentes Tol2 médiées reporters transgène, TALENs et CRISPRs) est présenté pour le poisson modèle émergent, l'épinoche à trois épines.

Microinjection pour transgénèse et Génome Édition dans Épinoche à trois épinoches

Nous présentons transgénèse transitoire et knockdown de gènes dans Ciona intestinalis, un groupe de soeur chordés aux vertébrés, en utilisant des techniques de microinjection et électroporation. Ces méthodes facilitent la génomique fonctionnelle dans cet invertébré simple qui comporte des caractéristiques rudimentaires de vertébrés, y compris notochorde et la tête épithéliums sensorielle, et de nombreux orthologues de gènes de maladies humaines associées.

La micro-injection et l&#39;électroporation d&#39;embryons dans le chordés<em&gt; Ciona intestinalis</em

Microinjection des embryons de poisson-zèbre et des larves est une technique cruciale mais difficile utilisée dans de nombreux modèles de poisson-zèbre. Nous présentons ici une gamme d’outils de micro-échelle pour aider à la stabilisation et l’orientation du poisson-zèbre pour microinjection et l’imagerie.

Microstructurées dispositifs pour Microinjection optimisée et l’imagerie des larves de poisson zèbre

Découvrez l'électroporation d'organoïdes cérébraux de primates pour modifier génétiquement les progéniteurs corticaux. Cette méthode précise permet d'étudier le développement cérébral et l'évolution néocorticale.

Microinjection ciblée et électroporation d’organoïdes cérébraux de primates pour la modification génétique

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