Name: Un protocole efficace pour l’analyse CUT and RUN de cellules satellites de souris isolées par FACS (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Découvrez un protocole CUT&RUN pour analyser la régulation transcriptionnelle dans les cellules satellites musculaires de souris isolées par FACS. Cette méthode permet d'étudier le recrutement des facteurs de transcription in vivo.

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Nous remercions Anastasia Bannwarth pour son excellente assistance technique. Nous remercions l’animalerie de l’IGBMC, la culture cellulaire, l’Institut Clinique de la Souris (ICS, Illkirch, France), l’imagerie, la microscopie électronique, la cytométrie en flux, et la plateforme GenomEast, membre du consortium France Génomique (ANR-10-INBS-0009).
Ces travaux de l’Institut Thématique Interdisciplinaire IMCBio, dans le cadre du programme ITI 2021-2028 de l’Université de Strasbourg, du CNRS et de l’Inserm, ont été soutenus par l’IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) et par le projet SFRI-STRAT’US (ANR 20-SFRI-0012) et l’EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) dans le cadre du Programme Français d’Investissements d’Avenir. Des financements complémentaires ont été apportés par l’INSERM, le CNRS, l’Unistra, l’IGBMC, l’Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), le programme stratégique AFM-Téléthon 24376 (à D.D.), la bourse Jeunes chercheurs de l’Inserm (à la D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, et un fonds d’Etat géré par l’ANR dans le cadre du programme-cadre Investissements d’Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. a bénéficié du soutien du Programme CDFA-07-22 de l’Université franco-allemande et du Ministère de l’Enseignement Supérieur de la Recherche et de l’Innovation, et K.G. de l’Association pour la Recherche à l’IGBMC (ARI).

Isolement de cellules satellites à partir de muscles de membres de souris et analyse par cytométrie en flux

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle%3A+a+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle: a brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+skeletal+muscle%3A+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+progenitor+cells+and+the+role+of+Pax+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes.</a> Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).</li>
<li>Tosic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lsd1+regulates+skeletal+muscle+regeneration+and+directs+the+fate+of+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 366(2018).</li>
<li>Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche+regulation+of+muscle+satellite+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).</li>
<li>Collins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+function%2C+self-renewal%2C+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li>
<li>Robinson, D. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+elongation+factor+regulates+muscle+progenitor+expansion+for+efficient+myofiber+repair+and+stem+cell+pool+repopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation.</a> Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li>
<li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85(2019).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, (2019).</li>
<li>Gunther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myf5-positive+satellite+cells+contribute+to+Pax7-dependent+long-term+maintenance+of+adult+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).</li>
<li>Donlin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+high-dimensional+analysis+of+cells+dissociated+from+cryopreserved+synovial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue.</a> Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139(2018).</li>
<li>Rico, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+cell+doublet+profiles%3A+Comparison+of+light+scattering+with+fluorescence+measurement+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques.</a> Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).</li>
<li>Schreiber, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+NEUROG3+occupancy+in+the+human+pancreatic+endocrine+gene+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network.</a> Molecular Metabolism. 53, 101313(2021).</li>
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<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).</li>
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<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+skeletal+muscle+for+flow+cytometric+characterization+of+immune+cells+in+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).</li>
<li>Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+tissue+residency+of+lymphocytes+in+the+murine+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 8, 250(2017).</li>
<li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La présente étude fait état d’une méthode standardisée, fiable et facile à réaliser pour l’isolement et la culture de cellules satellites de souris, ainsi que l’évaluation de la régulation transcriptionnelle par la méthode CUT&RUN.
Ce protocole comporte plusieurs étapes critiques. Le premier est la perturbation musculaire et la digestion des fibres pour assurer un nombre élevé de cellules collectées. Malgré l’augmentation de la concentration enzymatique, plus de cellules vivantes ont été obten...

Les muscles striés squelettiques représentent en moyenne 40 % du poids de l’ensemble du corps humain1. Les fibres musculaires présentent une capacité remarquable de régénération en cas de blessure, qui est décrite par la fusion des myocytes nouvellement formés et la génération de nouvelles myofibres qui remplacent celles endommagées2. En 1961, Alexander Mauro a signalé une population de cellules mononucléées qu’il a appelées cellules satellites3. Ces cellules souches expriment le facteur de transcription apparié boîte 7 (PAX7), et sont situées entre la lame basale et le sarcolemme des fibres musculaires4. Il a été rapporté qu’ils exprimaient le cluster de différenciation 34 (CD34 ; un marqueur hématopoïétique, progéniteur endothélial et marqueur de cellules souches mésenchymateuses), l’intégrine alpha 7 (ITGA7 ; un marqueur de muscles lisses, cardiaques et squelettiques), ainsi que le récepteur de chimiokines C-X-C de type 4 (CXCR4 ; un marqueur lymphocytaire, hématopoïétique et de cellules satellites)5. Dans des conditions basales, les cellules satellites résident dans un microenvironnement particulier qui les maintient dans un état de repos6. Lors d’une lésion musculaire, ils s’activent, prolifèrent et subissent une myogenèse7. Cependant, ne contribuant qu’à une fraction mineure du nombre total de cellules musculaires, leurs analyses à l’échelle du génome sont particulièrement difficiles, en particulier dans des contextes physiologiques (<1% du nombre total de cellules).
Diverses méthodes d’isolement de la chromatine à partir de cellules satellites ont été décrites, qui impliquent l’immunoprécipitation de la chromatine suivie d’expériences de séquençage parallèle massif (ChIP-seq) ou de clivage sous cibles et marquage (CUT&Tag). Néanmoins, ces deux techniques présentent des limites importantes qui restent incontestées. En effet, le ChIP-seq nécessite une grande quantité de matière première pour générer suffisamment de chromatine, dont une grande partie est perdue lors de l’étape de sonication. CUT&Tag est plus approprié pour un faible nombre de cellules, mais génère plus de sites de clivage hors cible que ChIP-seq en raison de l’activité de la transposase Tn5. De plus, étant donné que cette enzyme a une forte affinité pour les régions ouvertes de la chromatine, l’approche CUT&Tag pourrait être utilisée préférentiellement pour analyser les modifications des histones ou les facteurs de transcription associés à des régions du génome activement transcrites, au lieu de l’hétérochromatine réduite au silence 8,9.
Nous présentons ici un protocole détaillé qui permet l’isolement des cellules satellites musculaires des membres de souris par FACS pour le clivage sous les cibles et la libération à l’aide de l’analyse de nucléase (CUT&RUN)10,11. Les différentes étapes impliquent la perturbation mécanique des tissus, le tri cellulaire et l’isolement des noyaux. L’efficacité de la méthode, en ce qui concerne la préparation d’une suspension cellulaire viable, a été démontrée par la réalisation d’une analyse CUT&RUN pour les modifications covalentes des histones et les facteurs de transcription. La qualité des cellules isolées rend la méthode décrite particulièrement intéressante pour la préparation de la chromatine qui capture fidèlement l’état d’occupation génomique natif, et est susceptible d’être adaptée pour capturer la conformation chromosomique en combinaison avec le séquençage à haut débit à des loci spécifiques (4C-seq) ou à des niveaux à l’échelle du génome (Hi-C).

<table><tbody><tr><td>Microtube de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>2080422</td><td></td></tr><tr><td>Microtube de 2 mL</td><td>Star Lab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 5 mL</td><td>CORNING-FALCON</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>anti-AR</td><td>abcam</td><td>ab108341</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD11b</td><td>eBioscience</td><td>25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31</td><td>eBioscience</td><td>12-0311-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34</td><td>eBioscience</td><td>48-0341-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td></td></tr><tr><td>anti-CXCR4</td><td>eBioscience</td><td>17-9991-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-DMD</td><td>abcam</td><td>ab15277</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3K27ac</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3K4me2</td><td>Active Motif</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>anti-ITGA7</td><td>MBL</td><td>k0046-4</td><td></td></tr><tr><td>anti-PAX7</td><td>DSHB</td><td>AB_528428</td><td></td></tr><tr><td>anti-TER119</td><td>BD Pharmingen TM</td><td>553673</td><td></td></tr><tr><td>Perles</td><td>Polysciences</td><td>86057-3</td><td>BioMag&reg ; Plus Concanavalin A</td></tr><tr><td>Cell Strainer 100 & micro ; m</td><td>Corning&reg ; &nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>431752 Cell Strainer 40 & micro ; m</td><td>Corning&reg ; &nbsp ;</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Crépine à cellules 70 & micro ; m</td><td>Corning&reg ; &nbsp ;</td><td></td><td>Centrifugeuse 431751</td></tr><tr><td>1</td><td>Eppendorf</td><td>521-0011</td><td>Centrifugeuse 5415 R</td></tr><tr><td>Centrifugeuse 2</td><td>Eppendorf</td><td>5805000010</td><td>Centrifugeuse 5804 R Système</td></tr> de <tr><td>lames de chambre&nbsp ;</td><td>ThermoFischer</td><td>171080</td><td>Syst&egrave ; moi Nunc&trade ; Lab-Tek&trade ; </td></tr><tr><td>Agent de nettoyage de</td> lames de chambre <td>Sigma&nbsp ; &nbsp ;</td><td>SLBQ7780V</td><td>RNaseZAPTM</td></tr><tr><td>Collagénase, type I&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17100017</td><td>10 mg/mL</td></tr><tr><td>Dispase&nbsp ;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>7913</td><td>5 U/mL</td></tr><tr><td>DynaMag&trade ;-2 Aimant</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Stain</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre</td><td>en flux BD FACSAria&trade ; Cytomètre en flux de fusion</td><td>23-14816-01</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G avec DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>Genome browser&nbsp ;</td><td>IGV</td><td></td><td>http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td></tr> <tr><td>Glycérol&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogel</td><td>Corning&reg ; &nbsp ;</td><td>354277</td><td>matrice qualifiée Matrigel hESC</td></tr><tr><td>Logiciel de traitement d’images</td><td>Image J&reg ;</td><td></td><td>V 1.8.0</td></tr><tr><td>Film de laboratoire</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>PARAFILM&reg ; M</td></tr><tr><td>Liberase LT</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr>Séquenceur de<td>gallate de propyle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Illumina Hiseq 4000</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>vibrant Bioblock Scientific polytest 20</td><td>18724</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocole efficace pour l’analyse cut&amp;run de cellules satellites de souris isolées par facs

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Les analyses à l’échelle du génome avec des populations de petites cellules constituent une contrainte majeure pour les études, en particulier dans le domaine des cellules souches. Ce travail décrit un protocole efficace pour l’isolement des cellules satellites du muscle du membre, un tissu à haute teneur en protéines structurelles. Les muscles des membres disséqués de souris adultes ont été perturbés mécaniquement par hachage dans un milieu complété par de la dispase et de la collagénase de type I. Lors de la digestion, l’homogénat a été filtré à travers des tamis cellulaires et les cellules ont été mises en suspension dans un tampon FACS. La viabilité a été déterminée à l’aide d’une coloration de viabilité réparable, et les cellules satellites immunocolorées ont été isolées par FACS. Les cellules ont été lysées avec Triton X-100 et les noyaux libérés ont été liés à des billes magnétiques de concanavaline A. Des complexes noyau/billes ont été incubés avec des anticorps contre le facteur de transcription ou les modifications d’histones d’intérêt. Après les lavages, les complexes noyau/billes ont été incubés avec la protéine A-micrococcique nucléase, et le clivage de la chromatine a été initié avec CaCl2. Après l’extraction de l’ADN, des banques ont été générées et séquencées, et les profils de liaison aux facteurs de transcription à l’échelle du génome et de modifications des histones covalentes ont été obtenus par analyse bioinformatique. Les pics obtenus pour les différentes marques d’histones ont montré que les événements de liaison étaient spécifiques aux cellules satellites. De plus, l’analyse des motifs connus a révélé que le facteur de transcription était lié à la chromatine via son élément de réponse apparenté. Ce protocole est donc adapté pour étudier la régulation des gènes dans les cellules satellites musculaires des membres de souris adultes.

Des cellules satellites provenant de muscles squelettiques de souris ont été isolées en combinant les protocoles de Gunther et al. (ci-après le Protocole 1)12 et de Liu et al.23 (ci-après le Protocole 2). Étant donné que des fibres musculaires non digérées ont été observées après la digestion lors de l’utilisation de la concentration de collagénase et de dispase proposée dans le protocole 1, la quantité d’enzymes a été augmentée pour améliorer la dissociation des fibres mus...

Un protocole efficace pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est présenté ici des cellules satellites musculaires des membres de souris, adapté à l’étude de la régulation de la transcription dans les fibres musculaires par clivage sous cibles et libération par nucléase (CUT&RUN).

Un protocole efficace pour l’analyse CUT&amp;RUN de cellules satellites de souris isolées par FACS

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Depuis plus de 20 ans, notre laboratoire s’intéresse au rôle physiopathologique des récepteurs nucléaires. Pour décrypter leur fonction in vivo, nous avons conçu un modèle murin permettant le contrôle spatial et temporel de leur expression. En parallèle, nous avons développé des techniques de pointe pour étudier leur fonction moléculaire dans les tissus de souris.Notre intérêt scientifique nous a récemment amenés à déterminer la signalisation des récepteurs des sécostéroïdes et des stéroïdes dans divers tissus, y compris le muscle squelettique. Nous avons récemment démontré que le récepteur des androgènes dans les myofibres qui différencient les cellules du muscle squelettique joue un rôle déterminant dans leurs fonctions contractiles et métaboliques. Nos récentes découvertes permettent de mieux comprendre la dynamique physiopathologique des muscles squelettiques, ce qui est crucial pour développer des traitements efficaces pour les troubles associés aux muscles.Nous avons développé ce protocole pour pouvoir effectuer des analyses de cistrome sur des cellules souches musculaires in vivo. Tous les protocoles précédents utilisaient des modaux in vitro, ce qui dissocie complètement l’investigation d’un contexte d’organisme entier. En plus d’être peu coûteux et rapide, ce protocole fournit un cadre expérimental efficace pour étudier le recrutement des facteurs de transcription et le paysage de la chromatine dans les cellules progénitrices du muscle squelettique.La chromatine préparée par ce protocole a fourni la première analyse à l’échelle du génome du cistrome AR dans les cellules satellites et facilitera les futures études sur la régulation des gènes. Parmi tant d’autres, notre objectif futur serait d’étendre ces recherches à d’autres récepteurs d’oxostéroïdes et d’explorer leurs co-régulateurs spécifiques dans les différents types de cellules impliquées dans le processus de régénération du muscle squelettique.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

L'isolement et la culture d'une population pure de cellules satellites quiescentes, une population de cellules souches musculaires, est essentielle à la compréhension de muscle tige de la biologie cellulaire et la régénération, ainsi que la transplantation de cellules souches pour des thérapies dans la dystrophie musculaire et d'autres maladies dégénératives.

L&#39;isolement, la culture, et la transplantation de cellules satellites du muscle

Des cardiomyocytes individuels de souris de type sauvage et mutantes peuvent être isolés du cœur afin d’étudier leur contractilité et leurs transitoires calciques. Cela permet de caractériser la contribution du dysfonctionnement cellulaire au dysfonctionnement cardiaque, quelle qu’en soit la cause.

L&#39;isolement et l&#39;analyse physiologique de cardiomyocytes de souris

Le comportement des fibroblastes sous-tend un spectre d’entités cliniques, mais ils restent mal caractérisés, en grande partie en raison de leur hétérogénéité inhérente. La recherche traditionnelle sur les fibroblastes repose sur la manipulation in vitro, masquant le comportement des fibroblastes in vivo. Nous décrivons un protocole basé sur FACS pour l’isolement des fibroblastes de peau de souris qui ne nécessite pas de culture cellulaire.

Murin fibroblastes dermiques Isolation par FACS

Les modèles murins permettent d’étudier les mécanismes clés de l’arythmogenèse. À cette fin, des cardiomyocytes de haute qualité sont nécessaires pour effectuer des mesures patch-clamp. Ici, une méthode pour isoler les myocytes auriculaires et ventriculaires murins via une perfusion de Langendorff à base d’enzymes rétrogrades, qui permet des mesures simultanées des transitoires de calcium et du courant de calcium de type L, est décrite.

Isolement de myocytes auriculaires et ventriculaires murins de haute qualité pour des mesures simultanées des transitoires Ca2+ et du courant calcique de type L

La méthode présentée ici résume les protocoles optimisés pour évaluer la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives (HSPC) non adhérentes de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire pour mesurer le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et le taux de consommation d’oxygène (OCR) des HSPC en temps réel.

Évaluation de la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire

CUT&amp;RUN et ses variantes peuvent être utilisés pour déterminer l’occupation des protéines sur la chromatine. Ce protocole décrit comment déterminer la localisation des protéines sur la chromatine à l’aide d’uliCUT&amp;RUN unicellulaire.

Localisation du facteur unicellulaire sur la chromatine à l’aide d’un clivage d’entrée ultra-faible sous les cibles et libération à l’aide de la nucléase

L’identification précise des cellules progénitrices fibro-adipogènes (PAF) et des cellules souches musculaires (MuSC) est essentielle pour étudier leur fonction biologique dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ce protocole fournit des lignes directrices pour l’isolement, la purification et la culture des PAF et des MuSC à partir de muscles de souris adultes.

FACS-isolement et culture de progéniteurs fibro-adipogènes et de cellules souches musculaires à partir de muscles squelettiques de souris non perturbés et blessés

Les chercheurs novices dans le domaine de l’épigénétique trouveront que CUT&amp;Tag est une alternative beaucoup plus facile aux tests ChIP. CUT&amp;Tag a énormément bénéficié aux études épigénétiques sur des populations de cellules rares et primaires, générant des données de haute qualité à partir de très peu de cellules. Ce protocole décrit la réalisation de dosages H3K4me1 CUT&amp;Tag sur des myoblastes de souris isolés des muscles des membres postérieurs de souris.

Utilisation du clivage sous cibles et du test de marquage (CUT &#38; Tag) dans la recherche sur le myoblaste chez la souris

Ce protocole décrit un test de jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) extrachromosomique et un test de recombinaison homologue (HR) pour quantifier l’efficacité de NHEJ et HR dans les cellules HEK-293T.

Analyse de l’efficacité de l’assemblage d’extrémités non homologues et de la recombinaison homologue dans les cellules HEK-293T à l’aide de systèmes rapporteurs basés sur la GFP

Pour obtenir des péricytes corticaux cérébraux de souris répondant aux besoins du scRNA-seq, nous présentons un protocole FACS critique basé sur la sélection CD13⁺/CD31⁻. Nos principaux raffinements améliorent considérablement la viabilité cellulaire et l’intégrité de l’ARN, permettant un profilage transcriptomique fiable.

Isolement des péricytes à partir de tissu cortical de souris à l’aide de FACS pour le séquençage unicellulaire

Ce protocole fournit une méthode standardisée pour isoler et enrichir les myoblastes primaires du muscle squelettique de la souris adulte et néonatale via la dissociation tissulaire, la filtration séquentielle, le préplaque et des conditions de culture définies, permettant l’établissement et le maintien de cultures de myoblast dérivées des cellules satellites pour des applications expérimentales en aval.

Isolement des cellules satellites du muscle squelettique pour les études de myogenèse in vitro

Découvrez un protocole CUT&RUN pour analyser la régulation transcriptionnelle dans les cellules satellites musculaires de souris isolées par FACS. Cette méthode permet d'étudier le recrutement des facteurs de transcription in vivo.

Un protocole efficace pour l’analyse CUT&RUN de cellules satellites de souris isolées par FACS

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