In vivo Imagerie du cerveau entier de larves de poisson-zèbre à l’aide de la microscopie à fluorescence tridimensionnelle
28 avril 2023
Un protocole d’imagerie in vivo du cerveau entier de larves de poisson-zèbre à l’aide de la microscopie à fluorescence tridimensionnelle est présenté ici. La procédure expérimentale comprend la préparation des échantillons, l’acquisition d’images et la visualisation.
Nous développons des systèmes immunitaires optiques et des algorithmes informatiques pour enregistrer et analyser la neuroactivité de l’ensemble du cerveau avec une résolution spatiale et temporelle élevée. Le poisson de laboratoire est un animal modèle idéal pour la recherche. Grâce à chaque transparence optique et à la disponibilité de divers outils génétiques, la qualité de l’image optique peut être dégradée en raison de l’aberration introduite par le gel d’agarose utilisé pour le montage des échantillons, et les poissons peuvent se déplacer pendant l’enregistrement, provoquant des artefacts de mouvement dans les images ou empêchant l’extraction du signal de précision des images.
Les protocoles accessibles au public ne fournissent qu’un bref aperçu de la procédure expérimentale, des parties substantielles vivantes des détails, tels que les techniques de montage précis de solidification de l’agarose et le positionnement simple. Par conséquent, un protocole efficace et reproductible est nécessaire pour acquérir des données d’image de haute qualité. Avec un minimum de bruit et de mouvement.
Notre protocole fournit une procédure expérimentale optimisée et reproductible. Ce protocole permet l’imagerie in vivo du cerveau entier sur une période prolongée et la visualisation des données d’imagerie acquises. Le flux de travail s’est concentré sur l’imagerie du cerveau entier, mais il peut être facilement appliqué à l’imagerie d’autres organes de beaucoup de nos poissons zèbres.
Notre objectif est de démêler les principes sous-jacents du calcul neuronal. Pour cela, nous continuerons à travailler sur un pipeline qui implique l’imagerie à grande échelle de l’activité et de la structure neuronales et l’analyse informatique de celle-ci pour la cartographie systématique du cerveau.
Aperçu
Cet article présente un protocole détaillé pour l'imagerie in vivo de tout le cerveau de larves de zebrafish, en utilisant une microscopie de fluorescence tridimensionnelle. Le modèle du zebrafish est privilégié en raison de sa transparence optique et de son accessibilité génétique pour l'étude du calcul et de l'activité neuronaux. Le protocole aborde les problèmes courants tels que les artefacts de mouvement et les aberrations du gel d'agarose, assurant ainsi une acquisition de données d'image de haute qualité.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biophysique
- Techniques d'imagerie
Contexte
- Les larves de poisson zèbre constituent un modèle essentiel pour les études sur l'activité neuronale en raison de leur transparence.
- Les défis importants incluent les aberrations dues au gel d'agarose et les artefacts de mouvement pendant l'imagerie.
- Les protocoles actuels ne fournissent pas d'étapes détaillées pour le montage et le positionnement efficaces des échantillons.
- L'imagerie à haute résolution est cruciale pour comprendre le traitement neuronal.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole reproductible pour l'imagerie de haute qualité de l'activité cérébrale du poisson zèbre.
- Réduire le bruit et les artefacts de mouvement pendant les séances d'imagerie.
- Faciliter l'étude du calcul neuronal sur de longues périodes.
Méthodes utilisées
- La plateforme principale utilisée est la microscopie de fluorescence tridimensionnelle.
- Le modèle biologique implique des larves de poisson zèbre, préparées et immobilisées pour l'imagerie.
- Un protocole expérimental optimisé est mis en place afin de garantir un minimum d'artéfacts.
- Les étapes critiques incluent le positionnement précis des poissons zèbres et les réglages adéquats des paramètres d'imagerie.
- La visualisation des données acquises est réalisée à l'aide d'outils logiciels tels que napari.
Résultats principaux
- Le protocole d'imagerie permet une visualisation complète des régions cérébrales, y compris des structures neuronales du prosencéphale, du mésencéphale et du rhombencéphale.
- L'activité neuronale peut être capturée par imagerie en séries temporelles, révélant des informations importantes sur les fonctions neuronales.
- La visibilité nette de toutes les régions cérébrales indique l'efficacité du protocole.
Conclusions
- La présente étude démontre une nouvelle approche d'imagerie qui améliore la compréhension de l'activité neurologique du poisson zèbre.
- Le protocole établit non seulement une norme pour l'imagerie du poisson zèbre, mais a également des implications pour des recherches neuronales plus larges.
- Un développement ultérieur des chaînes de traitement d'images devrait améliorer les études de cartographie cérébrale et de computation neuronale.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'imagerie tridimensionnelle par fluorescence des cerveaux de larves de poisson-zèbre permet une cartographie in vivo à haute résolution des structures et activités neuronales, soutenant la découverte en neurosciences à un stade précoce. Ce protocole vise à améliorer la reproductibilité et à réduire les artefacts, offrant ainsi une base solide pour l'atténuation des risques mécanistiques et la validation de cibles en recherche neurobiologique. Son adaptabilité et ses sorties quantitatives en font une capacité réutilisable pour les chaînes de R&D industrielles axées sur l'analyse des circuits neuronaux et le criblage fonctionnel.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation systématique des voies neuronales et de l'activité cellulaire dans un modèle de vertébré.
- Réduit les risques biologiques en minimisant les artefacts de mouvement et les aberrations d'imagerie.
- Facilite la confiance prédictive dans l'identification des cibles neuronales grâce à des données quantitatives et à l'ensemble du cerveau.
Développement de criblages et de tests
- Prépare des échantillons de zebrafish validés et immobilisés pour des protocoles d'imagerie reproductibles.
- Standardise les paramètres d'imagerie et le positionnement des échantillons afin d'assurer la cohérence du test.
- Génère des données quantitatives volumétriques et en séries temporelles adaptées à l'analyse ultérieure et au criblage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Offre un système vertébré pertinent pour la maladie afin de cartographier fonctionnellement les circuits neuronaux.
- Permet une continuité entre l'imagerie de découverte et le développement de modèles précliniques pour les composés neuroactifs.
- Facilite un développement adapté au risque en fournissant des résultats d'imagerie riches en contenu et reproductibles.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole d'imagerie s'intègre dans la continuité découverte-préclinique, permettant la vérification d'hypothèses, la cartographie des voies métaboliques et l'analyse quantitative dans les modèles de neurosciences vertébrées.
- Biologie de la découverte : Permet la cartographie fondée sur des hypothèses de l'activité et de la structure neuronales à une résolution cellulaire.
- Écrans : Fournit des images quantitatives reproductibles pour des études de composés ou de perturbations génétiques.
- Analyse : Produit des jeux de données volumétriques et séries temporelles destinés à l'analyse computationnelle et à la comparaison entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans le développement de modèles précliniques en permettant l'imagerie fonctionnelle dans un système vertébré.
- Réutilisation en milieu professionnel : Le protocole peut être adapté pour l'imagerie d'autres organes ou systèmes chez le poisson-zèbre larvaire, favorisant l'extensibilité de la plateforme.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles neuronales.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation entre les expériences d'imagerie.
- Valeur stratégique : Renforce la prise de décision « aller/ne pas aller » et l'efficacité du capital dans les portefeuilles de neurosciences.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles neuronales et des tests fonctionnels.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation, l'immobilisation et la microscopie à fluorescence des zebrafish.
- Exige un accès à des plateformes d'imagerie par fluorescence, confocales ou sur mesure, ainsi qu'à des outils d'analyse informatique.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de préparation des échantillons et des paramètres d'imagerie.
- Adaptable à d'autres organes de larves de zebrafish, mais peut nécessiter une optimisation du protocole selon les tissus.
- Les limites potentielles incluent des artefacts d'imagerie dus à l'agarose et aux mouvements en cas d'immobilisation incomplète.
