Name: Dissection de la strie vasculaire de souris adulte pour le séquençage mononucléaire ou l’immunomarquage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Découvrez la dissection de la strie vasculaire chez la souris adulte pour le séquençage mononucléaire et l'immunomarquage. Cette méthode permet d'explorer le paysage transcriptionnel et les mécanismes des troubles auditifs instables comme la maladie de Menière.

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Cette recherche a été financée en partie par le programme de recherche intra-muros des NIH, NIDCD to M.H. (DC000088)

Toutes les expériences et procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux et l’Institut national sur la surdité et autres troubles de la communication, National Institutes of Health. Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux et l’Institut national sur la surdité et autres troubles de la communication, National Institutes of Health. Toutes les méthodes ont été appliquées conformément aux directives et règlements pertinents du Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux et de l’Institut national sur la surdité et autres troubles de la communication, National Institutes of Health.
1. Euthanasie animale
<ol><li>Utilisez des souris transgéniques C57BL/6J ou Kcnj10-ZsGreen, jour 30+ postnatal (P30+), qui pèsent entre 15 et 20 g.</li>
	<li>Euthanasier une souris adulte (âge P30 ou plus) en utilisant un protocole approuvé (ici l’asphyxie au CO2 ). Effectuez la décapitation comme étape secondaire. REMARQUE: En cas d’immunomarquage, certains anticorps peuvent avoir un signal de fond en raison d’une liaison non spécifique au sang dans les capillaires de la SV. La perfusion cardiaque avec fixateur peut résoudre ce problème en retirant le sang des capillaires du SV. Cependant, la plupart des anticorps peuvent obtenir de bons résultats sans cette méthode, et elle ne sera pas couverte par ce protocole.</li>
</ol>2. Exposer le labyrinthe osseux
<ol><li>Nettoyez la souris en pulvérisant avec de l’éthanol à 70% et en l’essuyant avec une serviette en papier. Portez une attention particulière à la région de la tête pour réduire le risque de contamination. Enlevez la peau du crâne en tirant la peau vers le nez.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux tranchants, fendez le crâne le long du plan médio-sagittal pour séparer les parties gauche et droite.</li>
	<li>Retirez le cerveau du crâne pour exposer le labyrinthe osseux.</li>
</ol>3. Extraction de l’oreille interne
<ol><li>Identifiez l’oreille interne dans l’os temporal (Figure 2A) et grattez les nerfs crâniens à l’aide d’une pince #55. REMARQUE: L’utilisateur doit stabiliser l’échantillon avec sa main non dominante à l’aide d’un deuxième jeu de pinces #55. Différentes zones de l’échantillon peuvent être saisies avec la pince stabilisatrice tout au long de la dissection si les zones critiques de l’échantillon sont évitées (p. ex., ne pas écraser la cochlée).</li>
	<li>À l’aide de la pince #55, disséquez la bulle et la capsule, en les détachant de l’os environnant. Retirez tous les tissus mous restants de la surface de l’oreille interne.</li>
	<li>Transférer l’échantillon dans une boîte de culture tissulaire transparente contenant 1x PBS froid (solution saline tamponnée au phosphate), pH 7,4, et placer sous une lunette de dissection (figure 2B).</li>
</ol>4. Dissection SV
REMARQUE: Avec de la pratique, il est possible de disséquer le SV comme une longue pièce ressemblant à un ruban. Le SV est fragile, donc s’il se brise en morceaux, ceux-ci peuvent être stockés ensemble. Alternativement, ceux-ci peuvent être stockés dans des puits étiquetés séparément en fonction de leur tour (par exemple, basal, moyen, apical).
<ol><li>Si les sources lumineuses de la lunette de dissection peuvent être déplacées, placez une lumière au-dessus de l’antenne parabolique et la deuxième source lumineuse sur le côté, parallèlement à la surface de dissection. Cela permet un meilleur contraste du tissu sous l’os cochléaire.</li>
	<li>À l’aide d’une pince #55, tenez le spécimen par la partie vestibulaire avec la cochlée tournée vers le haut.</li>
	<li>À l’aide de la pince #55, percez l’os cochléaire à l’apex. REMARQUE: Les pinces #5 sont plus épaisses que #55 et peuvent être utilisées pour casser les os, mais l’augmentation de la taille / force sacrifie la finesse des pinces et la capacité de manipuler de petits tissus. Envisagez d’utiliser des pinces fabriquées avec un matériau tel que l’inox ou le dumostar pour éviter les dommages qui pourraient survenir aux pinces plus délicates. Évitez d’enfoncer la pince trop profondément sous l’os pour éviter d’endommager le SV.</li>
	<li>À l’aide de la pince #55, gratter le long du tour apical (Figure 2C), en appliquant une force douce pour détacher de petits morceaux de la couche osseuse externe. Soulevez doucement l’os et détachez-le de la paroi latérale. NOTE: Il peut être utile de penser à cette dissection comme « enlever tout du SV », plutôt que de « disséquer le SV hors de la cochlée ».</li>
	<li>Continuez à utiliser les pinces #55 pour retirer les morceaux d’os cochléaire des tours apical et moyen (Figure 2D,E). En poussant doucement le long de la paroi latérale, soulevez et retirez les morceaux de paroi osseuse vers le virage du milieu pour exposer la paroi latérale des virages apical et moyen.</li>
	<li>En continuant à utiliser la pince #55, poussez doucement la paroi latérale du virage apical de côté pour exposer le ganglion en spirale. Détachez la paroi latérale des spires apicales et moyennes du ganglion en spirale le long de la couche externe des cellules ciliées. Retirez des morceaux de ganglion en spirale de l’intérieur de la cochlée. REMARQUE: Les pinces #55 sont plus petites et offrent un avantage lors de la manipulation de tissus petits et délicats. Des précautions supplémentaires doivent être prises pour éviter de les plier ou de les endommager.</li>
	<li>Pour avoir un meilleur accès à la paroi latérale du tour basal, détachez la cochlée de la partie vestibulaire de l’os temporal à l’aide d’une pince #55. Placez la pince #55 dans la fenêtre ronde et ovale et poussez vers le bas vers le vestibule. La cochlée se détachera. Retirez la partie vestibulaire de l’oreille interne.</li>
	<li>En continuant à utiliser les pinces #55, retirez maintenant les morceaux d’os cochléaire basal, en commençant par la zone de virage du milieu. Poussez doucement la couche de paroi latérale sous l’os pour le détacher.</li>
	<li>Enlevez la partie basale la plus éloignée de la paroi latérale en retirant et en tirant doucement le tissu. L’os dans cette région peut être trop épais pour être enlevé sans endommager les tissus mous en dessous.</li>
	<li>Maintenant, avec la partie basale de la paroi latérale détachée, séparez autant que possible la paroi latérale de la cochlée. Cela peut être fait en traçant la pince #55 le long de la paroi latérale. Brossez doucement la pince entre l’os et la paroi latérale restante. Cela peut être fait jusqu’au sommet en un seul morceau si l’utilisateur est expérimenté. Déplacez la paroi latérale vers un nouveau PBS. REMARQUE : Bien que les plus gros morceaux de SV puissent être plus faciles à imager, étant donné la nature délicate des tissus, des morceaux plus petits peuvent être prélevés (Figure 2F, G) et, selon la taille, peuvent également fonctionner pour l’imagerie.</li>
	<li>Utilisez des pinces #55 pour poser la paroi latérale à plat. Le SV doit être visible sous la forme d’une couche de tissu plus foncée sur le côté interne de la paroi latérale. REMARQUE : Les utilisateurs peuvent constater, particulièrement près de l’extrémité apicale, qu’une partie du tissu SV se détache accidentellement de la paroi latérale tout au long de la dissection.</li>
	<li>Retirez doucement la couche SV pour la détacher de la paroi latérale à son extrémité basale (Figure 2H). Écartez doucement le SV détaché et déplacez la pince plus loin vers l’extrémité apicale de la paroi latérale, en détachant le SV comme un long ruban si possible (Figure 2I). Ne pressez pas le SV avec une pince pour le tirer. Si le tissu est trop fragile pour être saisi, il peut également être prélevé à l’aide d’une cuillère de tissu, telle qu’une curette chalazion. REMARQUE: Le déplacement du SV doit toujours être effectué sous microscopie optique pour s’assurer qu’il n’est pas perdu. Soyez toujours prudent lorsque vous saisissez à l’aide de forceps en raison du risque de dommages. Les utilisateurs peuvent constater que l’utilisation de chalazion curette atténue le risque de dommages aux tissus SV. Pour le séquençage mononoyau, passez à la section 5. Pour l’immunocoloration par SV, passez à la rubrique 7.</li>
</ol>5. Suspension mononoyau SV
REMARQUE: Ce protocole est adapté pour le tissu SV spécifiquement à partir d’un protocole de suspension mononoyau publié par le fabricant. Des plates-formes de différents fabricants peuvent être utilisées31. Compte tenu des variations propres à la plate-forme, il est recommandé de revoir le protocole spécifique au fabricant fourni avec l’équipement. Pour obtenir des résultats optimaux pour sNuc-Seq et minimiser la dégradation de l’ARN, plus la dissection tissulaire est rapide, mieux c’est (recommandé dans les 15 à 20 minutes suivant l’euthanasie). Il peut être utile d’euthanasier un animal à la fois et seulement lorsqu’il est prêt à le disséquer. Le fait que plusieurs personnes travaillent simultanément sur les dissections peut également éliminer le temps de dégradation (p. ex., un membre du personnel de laboratoire travaille sur l’oreille gauche tandis qu’un autre travaille sur l’oreille droite).
<ol><li>Si le tissu SV doit être utilisé pour le sNuc-Seq, placer le tissu dans un tampon de lyse réfrigéré (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,005% nonidet P40 dans de l’eau sans nucléase). REMARQUE : Si le séquençage doit être effectué immédiatement après la dissection, poursuivez le protocole. Si l’on souhaite mettre en pause le protocole, la préservation de SV est possible en plaçant le SV dans RNAlater. Conserver toute la nuit à 4 °C, puis congeler dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé. Lorsque vous êtes prêt à l’emploi, décongeler et laver deux fois dans du PBS pendant 5 minutes chacun, puis procéder à l’homogénéisation (étape 5.2).</li>
	<li>Homogénéiser le tissu dans un homogénéisateur de rebond de 2 ml avec 10-20 coups sur la glace. REMARQUE: Le cylindre de verre entrera en contact manuellement avec le fond du tube de verre, fragmentant le SV. Le SV est délicat, donc 20 coups permettent généralement une homogénéisation réussie.</li>
	<li>Lyser le tissu sur la glace pendant 25 min. REMARQUE: Le temps de lyse varie selon le type de tissu. Une lyse de 25 minutes dans le tissu SV peut atteindre une faible viabilité cellulaire (moins de 4%), mais le temps peut être adapté si la viabilité cellulaire est trop élevée (étape 5.8).</li>
	<li>Filtrer à travers un filtre de 30 μm et faire tourner le filtrat à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon de lavage et de remise en suspension des noyaux (1x PBS, albumine sérique bovine à 1 % [BSA], inhibiteur de la RNase 0,2U/μL).</li>
	<li>Filtrer les cellules à travers un filtre de 10 μm et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 50 μL de tampon de lavage et de remise en suspension des noyaux.</li>
	<li>Compter les noyaux à l’aide d’un compteur de cellules et d’une coloration bleue au trypan. Diluer 5 μL de la suspension cellulaire dans 50 μL de 1x PBS pour le comptage cellulaire; La viabilité devrait être minime (3 % à 4 %) à ce stade. Si la viabilité s’avère plus élevée, adapter le protocole pour l’étape 5.3 (lyse) et normaliser le temps de lyse pour assurer une lyse adéquate des cellules. REMARQUE: Une viabilité cellulaire élevée dans une préparation à un seul noyau signifie qu’il y a plus de cellules intactes que souhaité, et qu’une digestion supplémentaire peut être nécessaire.</li>
	<li>Chargez l’échantillon avec la densité nucléaire souhaitée sur l’appareil/puce du fabricant (voir le guide du fabricant). Les captures à noyau unique sont maintenant prêtes. REMARQUE : À partir d’une souris adulte SV, on obtient habituellement 50 μL de la suspension à une concentration de 150 000 noyaux/mL.</li>
</ol>6. Séquençage mononoyau SV
<ol><li>Envoyez les échantillons à l’installation centrale pour le séquençage. REMARQUE: Cette partie du protocole suit les étapes générales de (1) la génération et le codage à barres de l’émulsion de billes de gel (GEM), (2) le nettoyage post-GEM-RT et l’amplification de l’ADNc, et (3) la construction de la bibliothèque d’expression génique 3'. Le reste du protocole sNuc-Seq est relativement long, et il est recommandé aux lecteurs d’utiliser leur protocole spécifique au fabricant. Le guide du fabricant décrira probablement les étapes avec des détails spécifiques et des images d’accompagnement. Il peut également y avoir des vidéos pratiques sur le site Web du fabricant. Les ensembles de données générés peuvent être représentés de manière dimensionnelle réduite, telle qu’une approximation et une projection de variété uniforme (UMAP; Graphique 3). De nombreux laboratoires utilisent un noyau de séquençage qui peut exécuter ce protocole pour les utilisateurs.</li>
</ol>7. Immunomarquage SV et montage tissulaire
<ol><li>Si le tissu doit être utilisé pour l’immunomarquage, transférez-le dans une plaque de 24 puits, immergée dans 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4% dans 1x PBS et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. REMARQUE: Il est utile d’effectuer tout l’élimination des liquides, le lavage et l’immunocoloration sous un microscope. La visualisation lors du pipetage du tissu garantira qu’il n’est pas perdu accidentellement lors de l’élimination du liquide. Les volumes des anticorps et des lavages peuvent être ajustés tant que le volume est suffisamment important pour immerger le tissu SV dans la solution.</li>
	<li>Après l’étape de fixation, retirer le PFA en effectuant deux courts lavages dans 1x PBS (environ 500 μL) à 4 °C pendant 5 minutes chacun sur un agitateur orbital à bas régime (30-50) RPM. En cas de stockage, le tissu peut être stocké dans 1x PBS à 4 °C.</li>
	<li>Retirer le PBS et perméabiliser et bloquer pendant au moins 1 h à température ambiante dans environ 300 μL de solution PBS-T (0,05 Tween20 dans 1x PBS avec 10% de sérum fœtal bovin). REMARQUE : Les anticorps primaires et secondaires doivent être dilués dans cette solution bloquante.</li>
	<li>Colorer le tissu avec l’anticorps primaire selon les spécifications de l’anticorps particulier utilisé, généralement pendant une nuit à 4 ° C. Retirez le PBS restant et ajoutez l’anticorps primaire dilué. NOTA: La dilution doit être choisie en fonction des suggestions du fabricant, des données publiées, de l’expérience antérieure, etc. Habituellement, la première concentration à tester est une dilution de 1:100-200. Pour l’exemple présenté dans cet article, les anticorps GS-IB4 et DAPI ont chacun été dilués à 1:200. En cas de coloration pour plus d’une protéine, plusieurs anticorps primaires peuvent être combinés dans la même solution, à condition que chaque anticorps primaire ait un hôte différent pour éviter la réactivité croisée des anticorps secondaires.</li>
	<li>Laver l’anticorps primaire du tissu en utilisant environ 500 μL de 1x PBS deux fois pendant 10 minutes chacun sur un agitateur orbital à bas régime. REMARQUE : Continuez à vous assurer que le tissu SV est immergé dans la solution et non coincé sur le côté du puits.</li>
	<li>Coloration avec un anticorps secondaire selon les spécifications de l’anticorps particulier utilisé, généralement pendant 2 h à température ambiante sur un agitateur orbital à bas régime. Couvrir la plaque de 24 puits afin que l’anticorps secondaire marqué par fluorescence soit protégé de la lumière. REMARQUE : Si plus d’un anticorps secondaire est nécessaire, combinez les anticorps secondaires dans la même solution. Assurez-vous d’éviter l’étiquetage croisé.</li>
	<li>Laver l’anticorps secondaire du tissu en utilisant environ 500 μL de 1x PBS quatre fois pendant 5 minutes chacun sur un agitateur orbital à bas régime. Gardez la plaque de 24 puits couverte pour la protéger de la lumière.</li>
	<li>Préparez la plus grande lame microscopique (75 mm x 25 mm) en plaçant deux petites traînées de colle le long de l’axe de 25 mm, juste plus petites que la lamelle de verre plus petite de 18 mm x 18 mm. Placez une goutte de réactif de montage (environ 50 μL) entre les traînées de colle. REMARQUE: La colle crée une petite quantité d’espace vertical de sorte que lorsque le deuxième couvercle est placé sur le dessus, l’échantillon de tissu SV peut exister en toute sécurité, mais continuer à rester en place. Bien que l’épaisseur de la strie soit de 30 à 40 microns, il faut éviter de presser le tissu entre les surfaces vitrées pour préserver la morphologie. Alternativement, du ruban adhésif transparent peut également être utilisé.</li>
	<li>À l’aide de pinces #55, saisir le moins de tissu possible à une extrémité du SV et transférer du PBS à la goutte de réactif de montage sur la plus grande microlame (75 mm x 25 mm). Placez une extrémité d’une petite glissière de verre (18 mm x 18 mm) sur la glissière où une traînée de colle a été placée et relâchez-la doucement pour éviter de créer des bulles d’air. Le couvercle tombera sur l’autre traînée de colle et couvrira le tissu SV.</li>
	<li>Scellez le support en tamponnant une goutte de vernis à ongles transparent sur chaque coin du support. Étiquetez l’échantillon en conséquence sur le couvercle en verre loin du champ de visualisation. Il est maintenant prêt pour la microscopie confocale (Figure 4).</li>
	<li>Visualisez le tissu SV à l’aide d’un microscope à dissection pour vous assurer qu’il est posé à plat et non près de bulles d’air. Si le tissu SV n’est pas orienté correctement, l’utilisateur peut tenter d’expulser les bulles d’air ou retirer soigneusement le plus petit capot en verre et repositionner le SV. Cela doit être fait doucement pour éviter de casser les lamelles de couvercle.</li>
</ol>

Microdissection de stries vasculaires pour le séquençage d’un seul noyau ou l’immunocoloration

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<li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-Seq+technologies+and+related+computational+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317(2019).</li>
<li>Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+and+spatial+transcriptomics+to+elucidate+intercellular+tissue+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics.</a> Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).</li>
<li>Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+single-nucleus+RNA+sequencing+in+different+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-sequencing+from+single+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visuazlied+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561(2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Avant l’avènement du séquençage unicellulaire, de nombreux chercheurs utilisaient l’analyse tissulaire en vrac, qui ne permettait que d’analyser les transcriptomes moyennés entre les cellules. En particulier, single-cell et sNuc-Seq ont permis d’isoler le transcriptome d’une seule cellule ou d’un seul noyau, respectivement32. Dans ce cas, les transcriptomes mononucléaux peuvent être identifiés pour les cellules marginales, intermédiaires et basales, ainsi que pour les cellules fusiformes<sup class...

La cochlée se compose de trois chambres remplies de liquide, la scala vestibuli, la scala media et la scala tympan. La scala vestibuli et la scala tympani contiennent chacune de la périlymphe, qui a une forte concentration de sodium (138 mM) et une faible concentration de potassium (6,8 mM)1. La scala media contient de l’endolymphe, qui a une forte concentration de potassium (154 mM) et une faible concentration de sodium (0,91 mM)1,2,3. Cette différence de concentration ionique peut être appelée potentiel endocochléaire (EP) et est principalement générée par le mouvement des ions potassium à travers divers canaux ioniques et jonctions lacunaires dans la strie vasculaire (SV) le long de la paroi latérale de la cochlée 4,5,6,7,8,9,10,11 . Le SV est un tissu hétérogène hautement vascularisé qui tapisse la face médiale de la paroi latérale de la cochlée et contient trois principaux types de cellules : les cellules marginales, intermédiaires et basales12 (Figure 1).
Les cellules marginales sont reliées par des jonctions serrées pour former la surface la plus médiale du SV. La membrane apicale fait face à l’endolymphe de la scala moyenne et contribue au transport des ions potassium dans l’endolymphe en utilisant divers canaux, y compris KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 et Na+-K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. Les cellules intermédiaires sont des cellules pigmentées qui résident entre les cellules marginales et basales et facilitent le transport du potassium à travers le SV en utilisant KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Les cellules basales se trouvent à proximité de la paroi latérale de la cochlée et sont étroitement associées aux fibrocytes du ligament spiralé pour favoriser le recyclage du potassium de la périlymphe12. La pathologie du SV a été impliquée dans de nombreux troubles otologiques17,18. Les mutations dans les gènes exprimés dans les principaux types de cellules SV, tels que Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 et Cldn11, peuvent causer la surdité et le dysfonctionnement de SV, y compris la perte de EP 19,20,21,22,23. En plus des trois principaux types cellulaires, il existe d’autres types de cellules moins étudiés dans le SV, tels que les cellules fusiformes 22, les cellules racinaires12,24, les macrophages 25, les péricytes 26 et les cellules endothéliales 27, qui ont des rôles incomplètement définis impliquant l’homéostasie ionique et la génération de EP 28.
Par rapport au séquençage de l’ARN en vrac, le séquençage de l’ARN à noyau unique (sNuc-Seq) fournit des informations sur l’hétérogénéité cellulaire, plutôt qu’une moyenne de l’ARNm dans un groupe de cellules29, et peut être particulièrement utile lors de l’étude de l’hétérogène SV30. Par exemple, sNuc-Seq a produit une analyse transcriptionnelle qui suggère qu’il pourrait y avoir un rôle pour les cellules fusiformes et racinaires dans la génération de PE, la perte auditive et la maladie de Ménière18. Une caractérisation transcriptionnelle plus poussée des différents types de cellules SV peut nous fournir des informations précieuses sur la physiopathologie sous-jacente aux différents mécanismes et sous-types de fluctuation auditive et de perte auditive liée à la SV. La récolte de ces structures délicates de l’oreille interne est d’une importance primordiale pour une analyse tissulaire optimale.
Dans cette étude, l’approche de microdissection pour accéder à la strie vasculaire et l’isoler de la cochlée de souris adulte pour sNuc-Seq ou immunomarquage est décrite. La dissection de la SV de souris adulte est nécessaire pour comprendre divers types de cellules SV et caractériser davantage leur rôle dans l’audition.

<table><tbody><tr><td>10 et micro ; m filtre (polyéthylentérétalate)</td><td>PluriSelect</td><td>#43-50010-01</td><td>Tissu filtrant pendant sNuc-Seq</td></tr><tr><td>18 x 18 mm verre de couverture</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td>Housse pour montage SV</td></tr><tr><td>30-&micro ; Filtre m (Polyéthylentérphétalate)</td><td>PluriSelect</td><td>#43-50030-03</td><td>Filtrer le tissu pendant le sNuc-Seq</td></tr><tr><td>75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide</td><td>Daigger</td><td>EF15978Z</td><td>Microslide pour monter SV sur</td></tr> les <tr><td>souris C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory RRID</td><td> : IMSR_JAX :000664</td><td>Souche de souris à usage général dont le pigment est plus facilement visible dans les cellules intermédiaires du SV.</td></tr><tr><td>Compteur de cellules</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>Utilisé pour le comptage cellulaire</td></tr><tr><td>Curette Chalizon 5'', taille 3 2,5 mm</td><td>Instruments de recherche biomédicale</td><td>15-1020</td><td>Utilisé pour le transfert</td></tr> SV <tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM Kit v3.1</td><td>Chromium</td><td>PN-1000141</td><td>Génère des bibliothèques d’expression génique single cell 3'</td></tr><tr><td>Vernis à ongles transparent</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td>Utilisé pour l’étanchéité</td></tr> des <tr><td>boîtes de culture tissulaire standard Corning Falcon à monture SV, 24 puits</td><td>Corning</td><td>08-772B</td><td>Boîte de culture utilisée pour maintenir l’échantillon lors de la dissection</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306, RRID : AB_2629482</td><td>Teinture utilisée pour l’étiquetage des noyaux</td></tr><tr><td>Dounce homogénéisateur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8938</td><td>Utilisé pour homogénéiser les tissus pour les pinces Dumont #5 sNuc-seq</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>Pince générale pour dissection</td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps Fine</td><td>Science Tools</td><td>11255-20</td><td>Pince à pointe fine qui facilite la manipulation</td></tr><tr><td>de SV Sérum fœtal bovin</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>Utilisé pour les étapes de sNuc-Seq Bâton de</td></tr><tr><td>colle</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0691392</td><td>Utilisé pour le montage</td></tr> SV <tr><td>GS-IB4 Anticorps</td><td>Moléculaire Sondes</td><td>I21411, RRID : AB-2314662</td><td>Anticorps utilisé pour le marquage capillaire</td></tr><tr><td>KCNJ10-ZsGreen Souris</td><td>n/a</td><td>n/a souris</td><td>transgénique qui exprime KCNJ10-ZsGreen, en particulier dans les cellules intermédiaires de la SV.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9530G</td><td>Utilisé pour les étapes de sNuc-Seq Réactif de</td></tr><tr><td>montage</td><td>ThermoFisher</td><td>#S36940</td><td>Réactif de montage pour</td></tr><tr><td>SV Multiwell 24 puits Plaque</td><td>Corning</td><td>#353047</td><td>Plaque utilisée pour l’immunomarquage</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ216183</td><td>Utilisé pour les étapes de sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9-16-45-9</td><td>Utilisé pour les étapes de sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>ThermoFisher</td><td>4387936</td><td>Utilisé pour les étapes de l’agitateur orbital sNuc-Seq</td></tr><tr><td></td><td>Silent Shake</td><td>SYC-2102A</td><td>Utilisé pour les étapes de l’immunocoloration</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>J61196. AP</td><td>Utilisé pour les étapes d’immunocoloration et de dissection</td></tr><tr><td>de l’ARN</td><td>Invitrogen</td><td>ultérieur AM7021</td><td>Utilisé pour la préservation de SV pour les scizzors sNuc-Seq</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Utilisé pour fendre le crâne de souris</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15506017</td><td>Utilisé pour les étapes de sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Trypan blue stain</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>Utilisé pour le comptage cellulaire</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ20605AP</td><td>Utilisé pour les étapes de sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope Zeiss STEMI SV 11 Apo</td><td>Microscope Zeiss</td><td>n/a</td><td>Utilisé pour les dissections</td></tr></tbody></table>

dissection de la strie vasculaire de souris adulte pour le séquençage mononucléaire ou l’immunomarquage

Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

Le potentiel endocochléaire, qui est généré par la strie vasculaire, est essentiel pour maintenir un environnement propice à une mécanotransduction appropriée des cellules ciliées et, finalement, à l’audition. Les pathologies de la strie vasculaire peuvent entraîner une diminution de l’audition. La dissection de la strie vasculaire adulte permet la capture focalisée d’un seul noyau, puis le séquençage et l’immunomarquage d’un seul noyau. Ces techniques sont utilisées pour étudier la physiopathologie de la strie vasculaire au niveau unicellulaire. 
Le séquençage mononucléal peut être utilisé dans le cadre de l’analyse transcriptionnelle de la strie vasculaire. Pendant ce temps, l’immunomarquage continue d’être utile pour identifier des populations spécifiques de cellules. Les deux méthodes nécessitent une dissection appropriée de la strie vasculaire comme condition préalable, ce qui peut s’avérer techniquement difficile.

Nous présentons une méthode pour isoler le SV à utiliser pour le sNuc-Seq ou l’immunomarquage. L’anatomie pertinente (Figure 1) de la cochlée par rapport à la SV peut aider les utilisateurs à mieux comprendre l’organisation de la SV et les étapes du protocole de dissection.
Chaque étape de cette microdissection de SV à partir d’une souris P30 est détaillée dans la vidéo associée, et des instantanés des étapes clés de cette dissection et de l’isolement de SV sont p...

La strie vasculaire est vitale pour la génération du potentiel endocochléaire. Ici, nous présentons la dissection de la strie vasculaire de la souris adulte pour le séquençage mononucléaire ou l’immunomarquage.

Dissection de la strie vasculaire de souris adulte pour le séquençage mononucléaire ou l’immunomarquage

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell ...

La strie vasculaire a pour fonction de générer le potentiel endocochléaire et de réguler l’homéostasie ionique dans la cochlée. Le programme de développement et de restauration auditive cherche à comprendre les mécanismes sous-jacents reliant l’homéostasie ionique dysfonctionnelle aux troubles de l’audition et de la stabilité, qui sont des maladies où une fluctuation ou une perte auditive soudaine se produit. Les travaux dans mon laboratoire ont établi le paysage transcriptionnel de la strie vasculaire et ont contribué à notre compréhension de son importance dans l’audition.Nous avons utilisé ces données pour établir des parallèles avec des troubles de l’audition et de la stabilité mal compris, y compris la maladie de Ménière. Ce protocole permet la dissection et l’isolement de stria vascularis à montage entier pour d’autres études moléculaires, y compris l’immunohistochimie. Étant donné que les types de cellules vasculaires sont étroitement liés les uns aux autres, l’utilisation de l’isolement nucléaire et du séquençage de l’ARN mononucléaire a facilité notre compréhension de la machinerie transcriptionnelle distincte impliquée.

dissection-adult-mouse-stria-vascularis-for-single-nucleus-sequencing

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Source : Daynac, M., et. al. Tri cellulaire des cellules souches neurales et progénitrices de la zone subventriculaire de la souris adulte et imagerie en direct de la dynamique de leur cycle cellulaire. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo montre l’imagerie en accéléré de cellules souches neurales (NSC) à partir du cerveau d’une souris transgénique à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Les NSC deviennent fluorescentes en rouge pendant la phase G1 et ne sont pas fluorescentes dans les...

Imagerie en accéléré de la division de cellules souches neurales de souris à l’aide de la microscopie confocale

Nous décrivons ici une procédure basée sur l’utilisation de particules lentivirales pour la modification génétique à long terme des cellules souches neurales et/ou de leurs cellules épendymaires adjacentes dans la niche neurogène ventriculaire-sous-ventriculaire adulte qui permet l’analyse séparée des effets autonomes et non autonomes des cellules dépendantes de la niche sur les cellules souches neurales.

Stable et efficace modification génétique de cellules dans le Adulte souris V-SVZ pour l&#39;analyse des cellules souches neurales autonome et effets non autonomes

Nous présentons ici un protocole afin d’isoler rapidement les noyaux de la haute qualité des tissus frais ou congelés pour aval séquençage massivement parallèle de RNA. Nous incluons détergent-mécanique et hypotonique-mécanique des tissus désorganisation cellulaire lyse options et, qui peuvent être utilisés pour l’isolement des noyaux.

Isolement des noyaux d’adultes de la moelle épinière pour séquençage massivement parallèle ARN simple-noyau

Nous fournissons un protocole pour l'isolement des microglies de différentes régions disséquées d'un hémisphère de cerveau de souris adulte, suivi de la préparation semi-automatisée de bibliothèque pour le séquençage profond d'ARN unicellulaire des transcriptomes pleine longueur. Cette méthode aidera à élucider l'hétérogénéité fonctionnelle des microglies dans la santé et la maladie.

Isolement des microglies spécifiques à la région de l'hémisphère cérébral d'une souris adulte pour le séquençage profond de l'ARN à une seule cellule

Ce protocole décrit la microdissection transillumination-aidée des segments des tubules séminifères adultes de souris représentant des étapes spécifiques du cycle épithélial séminifère, et des types de cellules là, et l’immunostaining suivant des préparations de courge et des segments intacts de tubule.

Dissection assistée par transillumination d’étapes spécifiques du cycle épithélial séminifique de la souris pour les analyses d’immunostaining en aval

Ici, nous présentons un protocole pour isoler des noyaux de haute qualité à partir de reins de souris congelés qui améliorent la représentation des types de cellules rénales médullaires et évitent les artefacts d’expression génique de la dissociation des tissus enzymatiques.

Isolement de noyaux à partir de reins de souris adultes pour le séquençage de l’ARN mononucléaire

Ce protocole décrit la préparation détaillée et à faible entrée de l’échantillon pour le séquençage à noyau unique, y compris la dissection des ganglions cervicaux et stellaires supérieurs de souris, la dissociation cellulaire, la cryoconservation, l’isolement du noyau et le codage à barres hashtag.

Isolement et multiplexage de noyaux à faible entrée avec des anticorps à code-barres de ganglions sympathiques de souris pour le séquençage de l’ARN à noyau unique

La capacité de marquer de façon permanente les cellules souches et leur descendance avec un fluorophore à l’aide d’une lignée transgénique inductible traçant la lignée de souris permet une analyse spatiale et temporelle de l’activation, de la prolifération, de la migration et / ou de la différenciation in vivo. Le traçage de la lignée peut révéler de nouvelles informations sur l’engagement de la lignée, la réponse aux interventions et la multipotence.

Traçage de la lignée des cellules souches inductibles marquées par fluorescence dans le cerveau de souris adulte

Présenté ici est une méthode pour séquencer des noyaux uniques isolés du gyrus denté de la souris qui exclut la plupart des neurones par tri des noyaux activés par fluorescence (FAN). Cette approche génère des profils d’expression de haute qualité et facilite l’étude de la plupart des autres types de cellules représentées dans la niche, y compris les populations rares telles que les cellules souches neurales.

Tri négatif des neurones par noyaux activés par fluorescence combiné au séquençage de l’ARN à noyau unique pour étudier la niche neurogène de l’hippocampe

La rétine présente une organisation spatiale complexe à travers sa structure laminaire. Les techniques modernes de transcriptomique spatiale et de séquençage nécessitent des coupes de tissus &lt; 20 μm d’épaisseur, ce qui limite leur applicabilité à la recherche rétinienne. Cette méthode de cryosectionnement fraîchement congelée produit de fines sections de la rétine de la souris tout en préservant les relations spatiales planes, permettant une cartographie moléculaire complète à travers les...

En face Cryosectionnement de la rétine de souris pour l’analyse moléculaire spatiale de haute dimension

Cet article fournit un protocole simplifié pour la dissection et la dissociation de l’épithélium olfactif murin à des fins de séquençage de l’ARN à noyau unique.

Dissection rapide et dissociation de l’épithélium olfactif de souris pour des suspensions à noyau unique

Découvrez la dissection de la strie vasculaire chez la souris adulte pour le séquençage mononucléaire et l'immunomarquage. Cette méthode permet d'explorer le paysage transcriptionnel et les mécanismes des troubles auditifs instables comme la maladie de Menière.

Dissection de la strie vasculaire de souris adulte pour le séquençage mononucléaire ou l’immunomarquage

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