Système de pseudo-îlots humains pour l’évaluation synchrone de la dynamique des biocapteurs fluorescents et des profils de sécrétion hormonale
3 novembre 2023
Ce protocole décrit une méthode d’acquisition synchrone et de co-enregistrement d’événements de signalisation intracellulaire et de sécrétion d’insuline et de glucagon par des pseudo-îlots humains primaires en utilisant l’administration adénovirale d’un biocapteur d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc), d’un détecteur de différence d’AMPc in situ (cADDis) et d’un système de micropérifusion.
Notre laboratoire s’efforce de comprendre, de prévenir et d’inverser le dysfonctionnement des cellules bêta et d’autres anomalies des paupières dans le diabète de type 1 et de type 2. Nos études se concentrent sur la pathogenèse du diabète humain en intégrant des études de la biologie du pancréas et des paupières humaines ainsi que de la santé et de la maladie. Les œillets humains sont des structures sphériques 3D, et l’accès aux cellules dans l’ensemble de l’œillet présente certains défis expérimentaux.
Par exemple, lorsque nous essayons d’introduire des biocapteurs pour comprendre la signalisation des cellules de l’œillet, notre protocole de pseudo-paupière surmonte ce défi en effectuant des manipulations génétiques à l’état de cellule unique et en agrégeant ces cellules humaines transduites en pseudo-paupières pour des études en aval. Notre système de pseudo-paupières nous permet d’exprimer des biocapteurs sur l’ensemble de l’œillet, plutôt que sur la surface de la paupière. Combiné à notre système d’imagerie des cellules vivantes et de microperfusion, nous pouvons à la fois mesurer et co-enregistrer les processus intracellulaires dynamiques avec la sécrétion hormonale en aval.
Ce protocole pourrait être appliqué pour répondre à une variété de questions scientifiques importantes. Par exemple, les stratégies de silençage génique pourraient être combinées à cette approche pour comprendre l’impact d’un gène d’intérêt sur la fonction des paupières et les voies de signalisation associées, soit globalement, soit de manière auto-spécifique.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cette étude aborde la dysfonction des cellules bêta et les anomalies des îlots dans le diabète, en utilisant un système de modèle de pseudo-îlots pour l'acquisition synchrone des signaux cellulaires et de la sécrétion hormonale. La méthode utilise une livraison adénovirale d'un biocapteur d'AMPc et un système de microperméation pour permettre l'analyse dynamique des réponses en insuline et en glucagon.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Diabète de type 1 et de type 2
- Biologie des îlots humains
- Dynamique de la signalisation cellulaire
Contexte
- Les îlots humains sont des structures sphériques qui posent des défis expérimentaux.
- Le protocole des pseudo-îlots résout ces défis pour une introduction efficace des biocapteurs.
- La compréhension de la signalisation des îlots est essentielle pour la recherche sur le diabète.
Méthodes utilisées
- Délivrance par adénovirus pour l'expression du biocapteur
- Modèle primaire d'îlots pseudo-humains
- Système de microperméation pour la mesure de la sécrétion d'hormones
Résultats principaux
- Co-enregistrement réussi des signaux intracellulaires et de la libération d'hormones.
- Analyse des effets du silençage génique sur la fonction des îlots.
- Surveillance dynamique des réponses sécrétoires en temps réel.
Conclusions
- Cette étude fournit un protocole rigoureux pour examiner la signalisation hormonale des îlots.
- Elle a des implications importantes pour la compréhension de la biologie des îlots dans le diabète.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle exécutive
Le système d'îlots pseudo-humains permet une évaluation synchronisée et quantitative de la signalisation intracellulaire et de la sécrétion d'hormones dans les cellules d'îlots humains primaires, répondant ainsi à un goulot d'étranglement critique dans la validation des cibles du diabète. En permettant la manipulation génétique et l'intégration de biocapteurs dans toute la structure tridimensionnelle de l'îlot, cette plateforme renforce la fiabilité prédictive des études mécanistiques et soutient les décisions de portefeuille ajustées au risque dans la recherche sur les maladies métaboliques. L'intégration de l'imagerie en temps réel sur cellules vivantes et des flux de micro-périfusion fait de cette plateforme une ressource réutilisable pour les phases précoces de la découverte et les recherches translationnelles.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en reliant la signalisation intracellulaire à la sécrétion hormonale dans les cellules des îlots humains.
- Facilite la dé-risquisation biologique par extinction génique ou clarification du voie à l'aide de biocapteurs dans un contexte tridimensionnel physiologiquement pertinent.
- Renforce la confiance prédictive et la validation fonctionnelle des cibles pour les programmes relatifs au diabète et aux maladies métaboliques.
Développement de criblages et de tests
- Prépare des systèmes de pseudo-îlots validés pour le criblage de composés et les dosages mécanistiques en aval.
- Standardise les conditions de dosage afin d'obtenir des mesures reproductibles et quantitatives de la sécrétion hormonale et de la dynamique des biocapteurs.
- Permet une évaluation multiplexée et évolutive d'interventions candidates dans un modèle pertinent pour l'humain.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats in vitro avec la biologie des îlots humains pertinents pour la maladie, afin de développer des biomarqueurs translationnels.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en permettant une détection mécanistique des risques dans des tissus humains primaires.
- Facilite les décisions d'avancement ajustées au risque en intégrant des mesures fonctionnelles et de signalisation.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce système fait le lien entre la découverte précoce, la validation de cibles et la recherche préclinique en permettant l'interrogation fondée sur des hypothèses des voies de signalisation et de la fonction des îlots dans un seul flux opérationnel.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses mécanistiques et de clarifier les voies biologiques grâce à des lectures synchronisées de biocapteurs et d'hormones.
- Écrans de sélection : Fournit des modèles de pseudo-îlots prêts à l'emploi et reproductibles pour l'évaluation quantitative d'interventions.
- Analytique : Offre des mesures dynamiques et quantitatives de la signalisation de l'AMPc et de la sécrétion hormonale afin de comparer solidement différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les découvertes mécanistiques in vitro et la biologie des maladies humaines, facilitant l'alignement des biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Propose une plateforme standardisée et adaptable, utilisable de manière répétée dans divers programmes de découverte de maladies métaboliques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles du diabète.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité des tests fonctionnels des îlots.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions de poursuite ou d'abandon et l'efficacité du capital en intégrant des données fonctionnelles et de signalisation.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation et un développement adaptés au risque des actifs contre les maladies métaboliques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en isolement d'îlots humains, en manipulation génétique et en imagerie de cellules vivantes.
- Exige un accès à la microscopie confocale, aux systèmes de microperméation et à des analyses quantitatives des hormones.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de préparation des pseudo-îlots et des tests.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les sources de donneurs ou les modèles de maladie.
- Le débit et l'évolutivité sont limités par la disponibilité du tissu primaire et la complexité technique.
