Name: Conception et construction d’un microscope à fluorescence à feuillet de lumière personnalisable à objectif unique pour la visualisation des réseaux de cytosquelettes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Apprenez à construire un microscope à fluorescence à feuillet de lumière à objectif unique pour visualiser les réseaux de cytosquelettes en trois dimensions avec une photodégradation minimale.

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Ce travail a été soutenu par le prix RUI de la National Science Foundation (NSF) (DMR-2203791) à J.S. Nous sommes reconnaissants des conseils fournis par le Dr Bin Yang et le Dr Manish Kumar pendant le processus d’alignement. Nous remercions le Dr Jenny Ross et K. Alice Lindsay pour les instructions de préparation des moteurs à kinésine.

Microscope à fluorescence personnalisable pour visualiser les réseaux de cytosquelette

<ol><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light-sheet+microscopy+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Optics%22%5BJournal%5D)">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal Optics. 20 (5), 053002(2018).</li>
<li>You, R., McGorty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+illuminating+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter.</a> Frontiers in Physics. 9, 760834(2021).</li>
<li>Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. A., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+laser+light+sheet+microscope+for+microbial+oceanography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography.</a> Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Dunsby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+sectioned+imaging+by+oblique+plane+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy.</a> Optics Express. 16 (25), 20306-20316 (2008).</li>
<li>Bouchard, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+confocally-aligned+planar+excitation+%28SCAPE%29+microscopy+for+high-speed+volumetric+imaging+of+behaving+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li>
<li>Smith, C. W., Botcherby, E. J., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+oblique-plane+images+in+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy.</a> Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiview+capture+and+fusion+improves+spatial+resolution+in+wide-field+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy.</a> Optica. 3 (8), 897-910 (2016).</li>
<li>Sahasrabudhe, A., Vittal, V., Ghose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peeping+in+on+the+cytoskeleton%3A+Light+microscopy+approaches+to+actin+and+microtubule+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Science%22%5BJournal%5D)">Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization.</a> Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., Nasenbeny, J., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+one-+and+two-photon+scanned+oblique+plane+illumination+%28SOPi%29+microscopy+for+rapid+volumetric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging.</a> Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Sapoznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+oblique+plane+microscope+for+large-scale+and+high-resolution+imaging+of+subcellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics.</a> eLife. 9, e57681(2020).</li>
<li>Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+in+vivo+study+of+microtubule+dynamics+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).</li>
<li>Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+super+resolution+on+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Focusing super resolution on the cytoskeleton.</a> F1000Res. 5, F1000 Faculty Rev-998 (2016).</li>
<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology-dependent+anomalous+dynamics+of+ring+and+linear+DNA+are+sensitive+to+cytoskeleton+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking.</a> Science Advances. 5 (12), (2019).</li>
<li>Sheung, J. Y., Garamella, J., Kahl, S. K., Lee, B. Y., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+advection+competes+with+crowding+to+drive+spatiotemporally+heterogeneous+transport+in+cytoskeleton+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Motor-driven advection competes with crowding to drive spatiotemporally heterogeneous transport in cytoskeleton composites.</a> Frontiers in Physics. 10, 1055441(2022).</li>
<li>Zeiss Lightsheet 7. Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossbill%3A+An+open+access+single+objective+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+microscopy%3A+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Optics+and+Photonics%22%5BJournal%5D)">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).</li>
<li>Pitrone, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSPIM%3A+An+open-access+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).</li>
<li>Sheung Lab, Single Objective Light Sheet Microscope (SOLS) Guide. Sheung Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols">https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols</a> (2023).</li>
<li>Lamb, J. R., Ward, E. N., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+software+package+for+on-the-fly+deskewing+and+live+viewing+of+volumetric+lightsheet+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Open-source software package for on-the-fly deskewing and live viewing of volumetric lightsheet microscopy data.</a> Biomedical Optics Express. 14 (2), 834-845 (2023).</li>
<li>Harvard University. Mitchison Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mitchison.hms.harvard.edu/home">https://mitchison.hms.harvard.edu/home</a> (2023).</li>
<li>Research at Dogic Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/">http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/</a> (2023).</li>
<li>Watkins, S. C., St. Croix, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+imaging+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Light sheet imaging comes of age.</a> Journal of Cell Biology. 217 (5), 1567-1569 (2018).</li>
<li>Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+and+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules and motors.</a> Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li>
<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+motion+in+hierarchically+assembled+active+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter.</a> Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
<li>Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensile+to+contractile+transition+in+active+microtubule-actin+composites+generates+layered+asters+with+programmable+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119(2022).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isomorphic+coalescence+of+aster+cores+formed+in+vitro+from+microtubules+and+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors.</a> Physical Biology. 13 (5), 056002(2016).</li>
<li>Millett-Sikking, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMillett-Sikking%2C+A+%22High+NA+single-objective+lightsheet%22">High NA single-objective lightsheet</a>. , (2019).</li>
<li>Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+adaptive+optics+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">3D adaptive optics in a light sheet microscope.</a> Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).</li>
<li>Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+multimodal+platform+for+classical+and+high+throughput+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1969(2022).</li>
<li>Crombez, S., Leclerc, P., Ray, C., Ducros, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+hyperspectral+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Computational hyperspectral light-sheet microscopy.</a> Optics Express. 30 (4), 4856-4866 (2022).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer. Toutes les recherches ont été menées en l’absence de relations commerciales ou financières qui pourraient être interprétées comme un conflit d’intérêts.

Deux détails importants concernant ce protocole sont le coût global du système et le temps de construction et d’alignement prévu. Bien que le coût exact soit variable, nous pouvons facilement estimer que le coût total de ce SOLS ou d’un système de bricolage similaire serait de l’ordre de 85 000 USD. Nous notons que cette estimation tient compte du prix de détail de tous les composants, de sorte que ce prix global peut être considérablement réduit en s’approvisionnant en composants usagés. En termes de temps de construction, il serait raisonnable de s’attendre à ce qu’un utilisateur ayant peu d’expérience en optique construise et aligne l’ensemble de ce système SOLS dans un délai de 1 à 2 mois, à condition que tous les composants soient disponibles et prêts. Malgré la longueur et la complexité du protocole, nous pensons que la quantité de détails dans le manuscrit écrit, associée au protocole vidéo, devrait rendre ce protocole simple et rapide à suivre.
Il y a deux étapes critiques dans ce protocole. Tout d’abord, l’emplacement du galvo détermine l’emplacement de nombreuses lentilles car il fait partie de trois paires de lentilles 4f distinctes. Il est crucial que le galvo soit à la fois conjugué avec les plans focaux arrière de O1 et O2 et centré correctement pour assurer un balayage invariant en inclinaison. Deuxièmement, la qualité de l’image est extrêmement sensible à l’alignement de O2 et O3 l’un par rapport à l’autre. Ici, il faut veiller à ce que, d’abord, l’angle d’alignement de O3 à O2 corresponde à l’inclinaison de la feuille de lumière d’excitation, fournissant ainsi un éclairage maximum plat sur le champ de vision incliné de la même manière. Deuxièmement, O3 doit être placé à la bonne distance axiale pour maintenir un champ de vision plat avec une surface aussi grande que possible. Troisièmement, O3 doit être placé à la bonne distance latérale de O2 pour maximiser le signal qui passe par l’interface O2-O3.

En termes de champ de vision utilisable, ce système a permis d’obtenir un champ plat et fiable avec un éclairage constant sur une zone de 80 μm x 80 μm. Cette zone est plus petite que le champ de vision maximal fourni par la caméra, de sorte que le champ de vision utilisable est indiqué par la case jaune de la figure 13. En termes de pouvoir de résolution, ce système a atteint une distance minimale résolvable de 432 nm le long de l’axe des x et de 421 nm le long de l’axe des y, qui a été mesurée en trouvant les sigma x et y moyens des ajustements gaussiens aux fonctions d’étalement ponctuel (PSF) dans le bon FoV et en multipliant par deux. Nous notons que ce système n’a pas été optimisé en termes de NA total, ce qui signifie qu’il y a place à une amélioration significative si les utilisateurs souhaitent un pouvoir de résolution supérieur à ce que ce système a atteint. Il existe une multitude d’options d’objectifs compatibles pour ce type de construction SOLS, dont beaucoup contribueraient à une résolution système plus élevée, mais avec les inconvénients d’un coût plus élevé, d’un champ de vision plus petit ou de techniques d’alignement plus compliquées à l’interface de relais 8,11,13,20. Par ailleurs, si les utilisateurs souhaitent un champ de vision plus grand, l’incorporation d’un deuxième galvo pour permettre la numérisation 2D permettrait d’atteindre cet objectif, mais nécessiterait l’intégration d’optiques et de mécanismes de contrôle supplémentaires dans la conception32. Nous avons fourni plus de détails concernant les modifications apportées au système sur la page de notre site Web, ainsi que des liens vers d’autres ressources utiles concernant le processus de conception23.

Au-delà de l’amélioration des composants spécifiques pour cette conception particulière, il serait tout à fait possible d’ajouter d’autres techniques ou modalités de microscopie à haute résolution à cette construction. L’une de ces améliorations consisterait à incorporer un éclairage multi-longueurs d’onde, ce qui impliquerait d’aligner des lasers d’excitation supplémentaires sur le chemin d’excitation d’origine8. De plus, comme ce type de conception SOLS laisse l’échantillon accessible, l’ajout de fonctions supplémentaires au microscope, y compris, mais sans s’y limiter, la pince optique, la microfluidique et la rhéométrie, est relativement simple 2,33.

Comparé à la myriade de guides de feuilles de lumière qui ont été publiés, ce protocole fournit des instructions à un niveau de compréhension qu’un utilisateur sans expérience significative de l’optique peut trouver utile. En rendant accessible à un public plus large une construction SOLS conviviale avec des capacités traditionnelles de montage de lames d’échantillons, nous espérons permettre une expansion encore plus importante des applications de la recherche basée sur SOLS dans tous les domaines dans lesquels l’instrument a été ou pourrait être utilisé. Même si les applications des instruments SOLS augmentent rapidement dans les numéros2, 34 et 35, nous pensons que de nombreux avantages et utilisations des instruments de type SOL restent encore inexplorés et exprimons notre enthousiasme quant aux possibilités de ce type d’instrument à l’avenir.

La microscopie à fluorescence à feuillet de lumière (LSFM) représente une famille de techniques d’imagerie par fluorescence à haute résolution dans lesquelles la lumière d’excitation est façonnée en une feuille 1,2, y compris la microscopie à éclairage plan sélectif (SPIM), l’excitation planaire alignée confocalement balayée (SCAPE) et la microscopie à plan oblique (OPM)3,4,5,6,7. Contrairement à d’autres modalités de microscopie telles que l’épifluorescence, la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRFM) ou la microscopie confocale, la phototoxicité est minime dans la LSFM et les échantillons peuvent être imagés sur des échelles de temps plus longues car seul le plan de l’échantillon activement imagé est éclairé 8,9,10. Par conséquent, les techniques LSFM sont extrêmement utiles pour l’imagerie d’échantillons 3D sur de longues périodes, notamment celles trop épaisses pour les techniques de microscopie confocale. Pour ces raisons, depuis son développement initial en 2004, le LSFM est devenu la technique d’imagerie de choix pour de nombreux physiologistes, biologistes du développement et neuroscientifiques pour la visualisation d’organismes entiers tels que les embryons vivants de poisson-zèbre et de drosophile 3,4,6,11 . Au cours de ces deux dernières décennies, les avantages de la LSFM ont été exploités pour visualiser la structure et la dynamique à des échelles de plus en plus petites, y compris les tissus11,12, les échelles cellulaires et subcellulaires, à la fois in vivo et in vitro 13,14,15,17.
Malgré les rapports de cas d’utilisation réussis dans la littérature, le coût élevé des systèmes LSFM commerciaux (~0,25 million USD au moment de la rédaction de cet article)18,19 empêche l’utilisation généralisée de la technique. Pour faire des constructions DIY une alternative réalisable pour les chercheurs, plusieurs guides de construction ont été publiés 8,13,20,21, y compris l’effort en libre accès OpenSPIM 22. Cependant, à ce jour, les chercheurs ayant une expérience minimale de l’optique ne peuvent utiliser que des modèles LSFM antérieurs, qui sont incompatibles avec les échantillons traditionnels montés sur lame (Figure 1A). La récente mise en œuvre d’un seul objectif et d’une feuille de lumière (SOLS) utilise un seul objectif pour l’excitation et la détection (Figure 1C), surmontant ainsi la limitation liée à la compatibilité 5,6,8,13,20. Cependant, le coût de la polyvalence de la conception SOLS est une augmentation substantielle de la complexité de la construction en raison de la nécessité de deux objectifs supplémentaires pour relayer, désincliner et réimager le plan de l’objet sur la caméra pour l’imagerie (Figure 1D). Pour faciliter l’accès aux configurations complexes de style SOLS, cet article présente un guide étape par étape sur la conception, la construction, le processus d’alignement et l’utilisation d’un système SOLS compatible avec les diapositives, qui serait utile aux chercheurs ne connaissant qu’un cours d’optique de niveau débutant.
Bien que le protocole lui-même soit succinct, les lecteurs doivent se référer à d’autres ressources pendant les étapes de préparation pour en savoir plus sur des parties particulières de la conception ou des considérations matérielles. Cependant, si un lecteur a l’intention de suivre les spécifications de cette conception, il peut ne pas être nécessaire de comprendre comment sélectionner des composants optiques particuliers.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig01.jpg"> Figure 1 : Caractéristiques des différentes configurations LSFM. (A) La configuration avec deux objectifs orthogonaux communs dans les premières conceptions LSFM. Dans cette configuration, un tube capillaire ou un cylindre de gel est utilisé pour contenir l’échantillon, ce qui n’est pas compatible avec les techniques traditionnelles de montage sur lame. (B) un schéma d’une feuille de lumière SOLS montrant les éléments suivants : (C) l’objectif unique utilisé pour l’excitation et la collecte d’émission au niveau du plan d’échantillonnage (O1) ; cela permet de monter une glissière traditionnelle sur le dessus, et (D) le système d’objectif de relais dans le trajet d’émission SOLS. O2 recueille la lumière d’émission et dégrossit l’image. O3 prend des images de l’avion avec le bon angle d’inclinaison sur le capteur de la caméra. Abréviations : LSFM = microscopie à fluorescence à feuillet de lumière ; SOLS = feuille de lumière à objectif unique ; O1-O3 = objectifs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Objectif plan-concave 1" f = -50 mm</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>LC1715-A-ML</td><td>Pour laser d’alignement Coût estimé : 49,5 $</td></tr><tr><td>Doublet achromatique 1 » f = 100 mm (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A-ML</td><td>L2, L4 et laser d’alignement Coût estimé : 342,42 $</td></tr><tr><td>Doublet achromatique 1 » f = 125 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-125-A-ML</td><td>SL2 Coût estimé : 114,14 $</td></tr><tr><td>Doublet achromatique 1 » f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L3 Coût estimé : 114,14 $</td></tr><tr><td>Doublet achromatique 1 » f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>TL2 Coût estimé : 114,14 $</td></tr><tr><td>Doublet achromatique 1 » f = 45 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-045-A-ML</td><td>L1 Coût estimé : 114,14 $</td></tr><tr><td>Doublet achromatique 1 » f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-075-A-ML</td><td>SL1 Coût estimé : 114,14 $</td></tr><tr><td>Lentille cylindrique 1 » f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1567RM</td><td>CL3 Coût estimé : 117,62 $</td></tr><tr><td>Lentille cylindrique 1 » f = 200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1653RM</td><td>CL2 Coût estimé : 111,22 $</td></tr><tr><td>Lentille cylindrique 1 » f = 50 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1695RM</td><td>CL1 Coût estimé : 117,62 $</td></tr><tr><td>Sténopé monté 1 » 30 & micro ; m Diamètre du sténopé</td><td>Thorlabs</td><td>P30K</td><td>Coût estimé : 77,08 $</td></tr><tr><td>Miroir argenté 1 » (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>M1, M2, un pour l’alignement Coût estimé : 168,78 $</td></tr><tr><td>Miroir elliptique 2 »</td><td>Thorlabs</td><td>PFE20-P01</td><td>M3 Coût estimé : 179,98 $</td></tr><tr><td>Support de poteau 2 » (x11)</td><td>Thorlabs</td><td>PH2</td><td>Pour un support laser personnalisé, une roue ND, des écrans de sécurité Coût estimé : 98,45 $</td></tr><tr><td>Poteaux 2 » (x47)</td><td>Thorlabs</td><td>TR2</td><td>Pour un support laser personnalisé et des composants optiques Coût estimé : 277,3 $</td></tr><tr><td>Poteaux 3 » (x4)&nbsp ;</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>TR3</td><td>Pour supports M3 et autres supports Coût estimé : 24,6 $</td></tr><tr><td>Support de poteau 3" (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>PH3</td><td>Coût estimé : 38,48 $</td></tr><tr><td>Adaptateur de cage de 30 à 60 mm&nbsp ;</td><td>Thorlabs</td><td>LCP33</td><td>Pour monter O1 Coût estimé : 45,42 $</td></tr><tr><td>Roue à filtres à cage de 30 mm</td><td>Thorlabs</td><td>CFW6</td><td>Pour monter des filtres ND Coût estimé : 172,36 $</td></tr><tr><td>Plaque de cage de 30 mm (x6)</td><td>Thorlabs</td><td>CP33</td><td>Pour construire une cage d’alignement et un laser d’alignement Coût estimé : 114,54 $</td></tr><tr><td>Monture de miroir cinématique à angle droit de 30 mm (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>Pour le montage de M1 et M2 et pour le laser d’alignement Coût estimé : 463,95 $</td></tr><tr><td>Support de poteau 4" (x30)</td><td>Thorlabs</td><td>PH4</td><td>Coût estimé : 320,1 $</td></tr><tr><td>Laser et alimentation 561 nm&nbsp ;</td><td>Opto Engine LLC</td><td>MGL-FN-561-100mW</td><td>Laser d’excitation Coût estimé : 6000 $</td></tr><tr><td>Plaque de cage de 60 mm (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01</td><td>Pour monter TL1 et M3 Coût estimé : 88,52 $</td></tr><tr><td>Monture de miroir cinématique à angle droit de 60 mm</td><td>Thorlabs</td><td>KCB2</td><td>Pour monter M3 Coût estimé : 187,26 $</td></tr><tr><td>90&deg ; Mont</td><td>Flip Thorlabs&nbsp ;</td><td>TRF90</td><td>Pour laser d’alignement Coût estimé : 95,5 $</td></tr><tr><td>Adaptateur avec filetages externes à monture C et filetages internes SM1</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>SM1A9</td><td>Pour connecter le tube d’objectif à l’appareil photo Coût estimé : 20,96 $</td></tr><tr><td>Adaptateur avec filetages externes SM1 et filetages internes à monture C</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>SM1A10</td><td>Pour connecter l’objectif du tube à la monture d’objectif Coût estimé : 21,82 $</td></tr><tr><td>Adaptateur avec filetages externes SM1 et filetages internes M25 (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A12</td><td>Pour monter O1 et O2 Coût estimé : 47,06 $</td></tr><tr><td>Adaptateur avec filetages externes SM1 et filetages internes M26</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A27</td><td>Pour monter O3 Coût estimé : $22.38</td></tr><tr><td>Disque d’alignement</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>SM1A7</td><td>Coût estimé : 20,45 $</td></tr><tr><td>Laser d’alignement</td><td>BISKEE</td><td></td><td>https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM Coût estimé : 16,98 $</td></tr><tr><td>Lame en plastique autoluorescente, rouge&nbsp ;</td><td>Chroma</td><td>92001</td><td>Coût estimé : 20 $</td></tr><tr><td>Obturateur de faisceau</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>SM1SH1</td><td>Pour bloquer la lumière laser Coût estimé : 65,8 $</td></tr><tr><td>Monture de rotation de cage (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1T</td><td>Pour monter CL1-3 Coût estimé : 282,15 $</td></tr><tr><td>Tiges de système de cage 1" (x8)</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>ER1</td><td>Pour monter M3 et O1 Coût estimé : 44,8 $</td></tr><tr><td>Système de cage Tiges 3" (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>ER3</td><td>Pour monter O3 Coût estimé : 14,28 $</td></tr><tr><td>Système de cage Tiges 4" (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>ER4</td><td>Pour monter slit Coût estimé : 30,76 $</td></tr><tr><td>Tiges du système de cage 8" (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>ER8</td><td>Pour l’alignement de l’objectif du tube Coût estimé : 25,3 $</td></tr><tr><td>Tiges du système de cage 12" (x8)</td><td>Thorlabs</td><td>ER12</td><td>Pour l’alignement de la cage Coût estimé : 145,36 $</td></tr><tr><td>Caméra</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 sCMOS</td><td>Coût estimé : ~14 000 $</td></tr><tr><td>Fourche de serrage (x35)</td><td>Thorlabs</td><td>CF125</td><td>Pour fixer les supports de poteau Coût estimé : 338,8 $</td></tr><tr><td>Verre de protection, 22 x 22 mm&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td>Pour les échantillons de lames Coût estimé : 265 $</td></tr><tr><td>Dichroic&nbsp ;</td><td>AVR</td><td>DI01-R405/488/561/635-25x36</td><td>Pour diviser les chemins d’exciation/émission Coût estimé : 965 $</td></tr><tr><td>Platine de translation en queue d’aronde</td><td>Thorlabs</td><td>DT12</td><td>Pour traduire le sténopé Coût estimé : 90,55 $</td></tr><tr><td>Filtre d’émission</td><td>Thorlabs</td><td>FELHO600</td><td>Coût estimé : 140,99 $</td></tr><tr><td>Disque d’alignement en verre dépoli (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1</td><td>Pour l’alignement, la cage et le plan intermédiaire Coût estimé : 75,14 $</td></tr><tr><td>Générateur de fonction</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP 33120A 15 MHz</td><td>Pour contrôler galvo Coût estimé : 900 $</td></tr><tr><td>Galvanomètre - Système 1D de grand diamètre de faisceau</td><td>Thorlabs</td><td>GVS011</td><td>Coût estimé : 1715,78</td></tr><tr><td>$ Alimentation du galvanomètre</td><td>Siglent</td><td>SPD3303C</td><td>Coût estimé : 300 $</td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Research Products International</td><td>G35020-100.0</td><td>Gomme gellane pour échantillon de perles 3D Coût estimé : 68,25 $</td></tr><tr><td>FIJI Software</td><td>Open-source</td><td></td><td>Télécharger depuis https://imagej.net/software/fiji/downloads Coût estimé :</td></tr><tr><td>Plaque chauffante/agitateur</td> gratuit <td>Corning</td><td>6795-220</td><td>Pour la préparation de solutions d’échantillons Coût estimé : 550 $</td></tr><tr><td>Contrôleur de moteur à balais K-Cube</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>Drives Z825B Coût estimé : 757,51 $</td></tr><tr><td>Monture cinématique</td><td>Thorlabs</td><td>KM100S</td><td>Pour monter dichroic Coût estimé : 92,01 $</td></tr><tr><td>Kinesis Software</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td></td><td>Télécharger depuis https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 Coût estimé :</td></tr><tr><td>bloqueur de lumière laser gratuit&nbsp ;</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>LB1</td><td>Pour les réflexions du filtre ND Coût estimé : 57,65 $</td></tr><tr><td>Monture laser</td><td>imprimée</td><td></td> en <td>3D sur mesure Coût estimé : N/A</td></tr><tr><td>Écran de sécurité laser (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>TPS4</td><td>Pour bloquer la lumière laser parasite Coût estimé : 92,02 $</td></tr><tr><td>Lentille de tube à balayage laser</td><td>Thorlabs</td><td>TTL200MP</td><td>TL1 Coût estimé : 1491 $</td></tr><tr><td>Monture d’objectif (x10)&nbsp ;</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td>Pour monter tous les objectifs et miroir d’alignement supplémentaire. Coût estimé : 164,7 $</td></tr><tr><td>Règle magnétique</td><td>Thorlabs</td><td>BHM4</td><td>Pour vérifier l’alignement Coût estimé : 52,74 $</td></tr><tr><td>Micro-Manager Software&nbsp ;</td><td>Téléchargement open-source</td><td></td><td>sur https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release Coût estimé :</td></tr><tr><td>Lames de microscope</td> gratuites <td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>12550400</td><td>Pour les échantillons de lames Coût estimé : 123,9 $</td></tr><tr><td>Platine de microscope</td><td>ASI</td><td>FTP-2000 avec pièces personnalisées</td><td>Pour traduire finement les échantillons Coût estimé : ~16 000 $</td></tr><tr><td>Mini Vortex Mixer&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>10153-688</td><td>Pour la préparation des échantillons Coût estimé : 152,64 $</td></tr><tr><td>Actionneur motorisé</td><td>Thorlabs</td><td>Z825B</td><td>Pour la traduction fine M1 Coût estimé : 729,07</td></tr><tr><td>$ Iris standard monté (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>ID20</td><td>Au moins 2 pour l’alignement Coût estimé : 118,02 $</td></tr><tr><td>Ensemble de filtres ND&nbsp ;</td><td>Thorlabs</td><td>NDK01&nbsp ;</td><td>Pour réduire l’intensité de l’excitation Coût estimé : 726,73 $</td></tr><tr><td>Objectif 1</td><td>Nikon </td>;<td>Plan Apo 60X/ 1.20 WI</td><td>O1 Coût estimé : ~15 000 $</td></tr><tr><td>Objectif 2</td><td>Nikon</td><td>TU Plan Fluor 100X/0.90&nbsp ;</td><td>O2 Coût estimé : ~6 000 $</td></tr><tr><td>Objectif Objectif 3</td><td>Mitutoyo</td><td>Plan Apo HR 50X/0.75</td><td>O3 Coût estimé : ~6 800 $</td></tr><tr><td>OPM Logiciel de redressement</td><td>Open-source</td><td></td><td>Pour le traitement d’image. Télécharger depuis https://github.com/QI2lab/OPM Coût estimé :</td></tr><tr><td>Capteur de puissance à photodiode</td> gratuit <td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>S121C</td><td>Pour la mesure de l’intensité laser Coût estimé : 379,68 $</td></tr><tr><td>Cible de distorsion positive de la grille</td><td>Thorlabs</td><td>R1L3S3P</td><td>Alignement en fond clair Coût estimé : 267,87</td></tr><tr><td>$ Console numérique du wattmètre</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>PM100D</td><td>Pour la mesure de l’intensité laser Coût estimé : 1245,48 $</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>J62315.14</td><td>Pour un échantillon de lame à revêtement fluorescent Coût estimé : 27,7 $</td></tr><tr><td>Pince à angle droit pour tenons</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>RA90</td><td>Pour support M3 et miroir rabattable Coût estimé : 32,46 $</td></tr><tr><td>Plaque de cage filetée RMS (x2)&nbsp ;</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>CP42</td><td>Pour laser d’alignement Coût estimé : 70,56 $</td></tr><tr><td>Plaque de cisaillement 2,5-5,0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI050P&nbsp ;</td><td>Coût estimé : 182,85 $</td></tr><tr><td>Plaque de cisaillement 5,0-10,0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI100P</td><td>Coût estimé : 201,47 $</td></tr><tr><td>Plaque de cisaillement 10,0-25,4 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI254P</td><td>Coût estimé : 236,42 $</td></tr><tr><td>Écran de visualisation de la plaque de cisaillement</td><td>Thorlabs</td><td>SIVS</td><td>Coût estimé : 337,74 $</td></tr><tr><td>Interféromètre de cisaillement avec plaque de 1 à 3 mm Thorlabs</td><td></td><td>SI035</td><td>Pour vérifier la collimation Coût estimé : 465,85 $</td></tr><tr><td>Collier à enfiler (x35)</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>R2</td><td>Pour maintenir la hauteur du poteau Coût estimé : 208,25 $</td></tr><tr><td>Fente</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td>Coût estimé : 294,64 $</td></tr><tr><td>Tube d’objectif fendu, 3"</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>SM1L30C</td><td>Pour laser d’alignement Coût estimé : 77,45 $</td></tr><tr><td>Miroir carré, 1 x 1"</td><td></td><td></td><td>https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069& hvpos=& hvne tw=g& hvrand=1336734911900437 4691& hvpone=& hvptwo=& hvqmt= & hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint=& hvlocphy=9031212& hvtargid=pla-1 943952718742& gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB& th=1 Coût estimé : 14,76 $</td></tr><tr><td>Tube d’objectif empilable 1/2 » (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td>Pour monter CL1-3 Coût estimé : 40,86 $</td></tr><tr><td>Tube d’objectif empilable 1"</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L10</td><td>Pour monter O3 Coût estimé : 15,41 $</td></tr><tr><td>Tube d’objectif empilable 2 » (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td><td>Pour la trajectoire de caméra Coût estimé : $35.7</td></tr><tr><td>Adaptateur de base de piédestal clouté (x37)</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>BE1</td><td>Pour fixer les supports de poteau à table Coût estimé : 400,71 $</td></tr><tr><td>Monture d’objectif de translation (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY</td><td>Pour la traduction fine du sténopé, de l’O2 et de l’O3 Coût estimé : 441 $</td></tr><tr><td>Platine de traduction avec micromètre standard (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>TS1-2 Coût estimé : 647,54 $</td></tr><tr><td>Manuel de voyage Étape de traduction</td><td>Thorlabs</td><td>CT1A</td><td>Monture de translation de cage O3 Coût estimé : 497,3 $</td></tr><tr><td>Objectif tube</td><td>Nikon</td><td>MXA20696</td><td>TL3 Coût estimé : 359 $</td></tr><tr><td>LED montées en blanc</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>MNWHL4</td><td>Source lumineuse à fond clair Coût estimé : 171,28 $</td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>COÛT ESTIMATIF TOTAL : 84 858,98 $</td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Les auteurs notent que de nombreuses pièces ont été achetées d’occasion. Ici, nous avons essayé de refléter le prix de détail de tous les articles, de sorte que le coût total peut être considérablement réduit en achetant des articles particuliers utilisés, en particulier les plus chers.</td></tr><tr><td>COMPOSANTS OPTIONNELS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grasshopper3 USB3</td><td>FLIR</td><td>&nbsp ; GS3-U3-23S6C-C</td><td>Pour les contrôles de diagnostic lors de l’alignement. La caméra Acquisiton peut être utilisée à la place, mais nécessite un réalignement par la suite. Coût estimé : 1089 $</td></tr></tbody></table>

conception et construction d’un microscope à fluorescence à feuillet de lumière personnalisable à objectif unique pour la visualisation des réseaux de cytosquelettes

Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks

Les composites de cytosquelettes reconstitués sont apparus comme un système modèle précieux pour l’étude de la matière molle hors équilibre. La capture fidèle de la dynamique de ces réseaux denses en 3D nécessite un sectionnement optique, souvent associé aux microscopes confocaux à fluorescence. Cependant, les développements récents de la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière (LSFM) l’ont établie comme une alternative rentable et, parfois, supérieure. Pour rendre le LSFM accessible aux chercheurs en cytosquelette moins familiers avec l’optique, nous présentons un guide du débutant étape par étape pour construire un microscope à fluorescence à feuillet de lumière polyvalent à partir de composants prêts à l’emploi. Pour permettre le montage d’échantillons avec des échantillons de lames traditionnels, ce LSFM suit la conception à feuille de lumière à objectif unique (SOLS), qui utilise un seul objectif pour l’excitation et la collecte d’émission. Nous décrivons la fonction de chaque composant du SOLS avec suffisamment de détails pour permettre aux lecteurs de modifier l’instrumentation et de la concevoir en fonction de leurs besoins spécifiques. Enfin, nous démontrons l’utilisation de cet instrument SOLS personnalisé en visualisant les asters dans des réseaux de microtubules pilotés par la kinésine.

Nous avons effectué des scans volumétriques de billes de 1 μm incrustées dans de la gomme gellane. La figure 14 montre les projections d’intensité maximale des balayages volumétriques redressés le long des directions x, y et z.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig14.jpg"> Figure 14 : Imagerie volumétrique de billes fluorescentes de 1 μm dans de la gomme gellane. Les projections d’intensité maximale des balayages volumétriques redressés sont montrées. Barres d’échelle = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig14large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Nous avons démontré l’utilisation du microscope à feuillet de lumière à objectif unique pour caractériser les réseaux de cytosquelettes reconstitués en effectuant des balayages volumétriques d’échantillons d’asters microtubulaires. En bref, des microtubules marqués à la rhodamine et stabilisés au taxol ont été polymérisés à partir de dimères reconstitués par GTP ; puis, après polymérisation, des grappes de moteurs kinésines à base de streptavidine ont été mélangées à des échantillons avec de l’ATP pour des concentrations finales de microtubules de 6 μM, de dimères de kinésine de 0,5 μM et d’ATP de 10 mM. Des protocoles et des guides complets pour la préparation de microtubules stabilisés au taxol et de groupes moteurs de kinésine sont disponibles sur les sites Web du laboratoire Mitchson et du laboratoire Dogic25,26. Les échantillons ont été pipetés doucement dans des lames de microscope, scellés et laissés reposer pendant 8 heures avant l’imagerie pour permettre à l’activité motrice de cesser afin que les échantillons atteignent un état structurel stable qui ressemble à des asters.
Les études sur les systèmes de cytosquelettes reconstitués utilisent le plus souvent la microscopie confocale ou l’épifluorescence pour imager les filaments marqués. Cependant, ces deux techniques sont limitées dans leur capacité à imager des échantillons 3D denses27. Alors que de nombreux progrès ont été réalisés dans la recherche in vitro sur la matière active basée sur le cytosquelette en contraignant les échantillons à être quasi2D 28,29, les réseaux de cytosquelettes sont intrinsèquement 3D, et de nombreux efforts actuels consistent à comprendre les effets qui ne peuvent survenir que dans les échantillons 3D29,30, créant ainsi un besoin d’imagerie 3D haute résolution.
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig15.jpg"> Figure 15 : Facilitation de la visualisation 3D d’échantillons de cytosquelette reconstitués par microscopie à feuillet de lumière à objectif unique. (A) Images d’asters microtubules fluorescents acquises sur un microscope confocal à balayage laser Leica DMi8. Les images montrent différents plans d’un z-scan. Barre d’échelle = 30 μm. (B) Images redressées déconvoluées d’un balayage volumétrique effectué sur la configuration de la feuille de lumière à objectif unique du même échantillon. Barre d’échelle = 30 μm. La zone d’image redressée correspond ici au champ de vision utilisable (boîte jaune) illustré à la figure 13B. Alors que le confocal excelle dans l’imagerie de plans uniques près de la lamelle, la densité de l’échantillon fluorescent introduit des complications lors de l’imagerie à des plans plus élevés en raison du signal supplémentaire provenant du dessous du plan d’imagerie. La feuille de lumière contourne ce problème en éclairant uniquement le plan d’imagerie, permettant ainsi une imagerie uniformément nette à différents plans en z. Abréviations : SOLS = feuille de lumière à objectif unique ; FoV = champ de vision. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig15large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Dans la figure 15, nous démontrons l’imagerie volumétrique d’un réseau de microtubules reconstitués contractés en structures de type aster par des clusters moteurs de kinésine. Comme l’ont montré des recherches antérieures28,31, ces structures 3D ont tendance à se densifier vers le centre, ce qui donne des régions de fluorescence brillantes qui sont prédominantes dans le signal. Dans les plans d’imagerie près de la lamelle (faible niveau z), la microscopie confocale (Figure 15A) peut résoudre des filaments uniques autour de la périphérie de l’aster, avec un bruit de fond supplémentaire vers le centre en raison de signaux de fluorescence flous provenant d’en haut. Cependant, le déplacement de quelques microns en z réduit rapidement la qualité des images en raison de la prédominance des sections denses floues de l’aster dans le signal dans le plan d’imagerie. L’éclairage à plan unique de la feuille de lumière (figure 15B) élimine les signaux flous des parties denses de l’aster au-dessus et au-dessous du plan d’imagerie, permettant ainsi une qualité d’image comparable entre les plans. La capacité de la feuille de lumière à produire des données de balayage volumétrique fiables et de haute qualité ouvre la possibilité de visualiser et de caractériser des phénomènes 3D dans des systèmes de cytosquelettes reconstitués.

Ce protocole décrit en détail comment construire un microscope à fluorescence à feuillet de lumière à objectif unique et son utilisation pour visualiser les réseaux de cytosquelettes.

Conception et construction d’un microscope à fluorescence à feuillet de lumière personnalisable à objectif unique pour la visualisation des réseaux de cytosquelettes

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the ...

Notre travail vise à faire progresser les connaissances sur la relation entre la dynamique du travail trans, la structure locale et les propriétés mécaniques dans les matériaux loin de l’équilibre. La visualisation de matériaux loin de l’équilibre tels que les réseaux de cytosquelettes nécessite une capacité à imager des échantillons denses et tridimensionnels avec une qualité d’image comparable sur l’ensemble du volume de l’échantillon, tout en causant un minimum de dommages par photoblanchiment, une tâche techniquement difficile pour laquelle la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière est la mieux adaptée. Les systèmes de microscopes à fluorescence à feuillet de lumière offrent d’excellentes capacités de coupe optique, ce qui permet d’imager ces échantillons tridimensionnels épais sur de longues échelles de temps avec un photoblanchiment minimal.En particulier, le système de feuille de lumière à objectif unique que nous présenterons est compatible avec les échantillons traditionnels montés sur lame, ce qui en fait un outil très polyvalent. L’écrasante majorité des guides à feuille de lumière à objectif unique sont écrits pour des utilisateurs ayant une grande expérience de l’optique. Pour rendre la configuration complexe de style feuille de lumière à objectif unique plus accessible, ce guide détaillé fournit des étapes qu’un utilisateur ayant un cours d’optique d’entrée de gamme peut suivre.

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Visualisation quantitative de l&#39;infiltration de leucocytes dans un modèle murin de myocardite fulminante par microscopie à feuilles lumineuses

L'imagerie de la morphogenèse des embryons d'insectes avec la microscopie de fluorescence à base de feuille de lumière est devenu état de la technique. Ce protocole décrit et compare trois techniques de montage appropriées pour les embryons Tribolium castaneum, introduit deux nouvelles lignées transgéniques sur mesure bien adapté pour l' imagerie en direct, discute des contrôles de qualité essentiels et indique les limites expérimentales actuelles.

Feuille à base de lumière de la vie Microscopie Fluorescence ou fixe et Stained<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; embryons

Nous décrivons ici un protocole pour la visualisation de projection des motoneurones et arborisation axone dans des embryons de souris transgéniques Hb9::GFP . Après immunostaining des neurones moteurs, nous avons utilisé la microscopie de fluorescence nappe de lumière aux embryons d’image analyse quantitative. Le présent Protocole s’applique à d’autres processus de navigation neurone du système nerveux central.

Visualisation de l’axone moteur Navigation et la Quantification de ces axones dans des embryons de souris à l’aide de la microscopie de Fluorescence nappe de lumière

Cette étude utilise une technique de microscopie (LSFM) de fluorescence lumière-feuille recto-verso illumination combinée avec compensation optique pour étudier le coeur murin.

Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour l’étude du coeur murin

Une instruction détaillée est décrit comment construire un très inclinée a balayé le microscope de tuile (HIST) et son utilisation pour l’imagerie de la molécule unique.

Un Guide pour construire un très inclinée a balayé la tuile Microscope pour l’imagerie de molécule unique champ de vision étendu

La microscopie à fluorescence à base de feuilles de lumière est l’outil le plus précieux en biologie du développement. Un problème majeur dans les études comparatives est la variance ambiante. Notre protocole décrit un cadre expérimental pour l’imagerie en direct simultanée de plusieurs spécimens et, par conséquent, aborde cette question de manière proactive.

Imagerie en direct simultanée d’embryons d’insectes multiples dans des microscopes à fluorescence à feuille de lumière à base de chambre d’échantillonnage

Apprenez à construire un microscope à fluorescence à feuillet de lumière à objectif unique pour visualiser les réseaux de cytosquelettes en trois dimensions avec une photodégradation minimale.

Conception et construction d’un microscope à fluorescence à feuillet de lumière personnalisable à objectif unique pour la visualisation des réseaux de cytosquelettes (Vidéo) | JoVE Journal

Conception et construction d’un microscope à fluorescence à feuillet de lumière personnalisable à objectif unique pour la visualisation des réseaux de cytosquelettes

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