Conception et construction d’un microscope à fluorescence à feuillet de lumière personnalisable à objectif unique pour la visualisation des réseaux de cytosquelettes
26 janvier 2024
Ce protocole décrit en détail comment construire un microscope à fluorescence à feuillet de lumière à objectif unique et son utilisation pour visualiser les réseaux de cytosquelettes.
Notre travail vise à faire progresser les connaissances sur la relation entre la dynamique du travail trans, la structure locale et les propriétés mécaniques dans les matériaux loin de l’équilibre. La visualisation de matériaux loin de l’équilibre tels que les réseaux de cytosquelettes nécessite une capacité à imager des échantillons denses et tridimensionnels avec une qualité d’image comparable sur l’ensemble du volume de l’échantillon, tout en causant un minimum de dommages par photoblanchiment, une tâche techniquement difficile pour laquelle la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière est la mieux adaptée. Les systèmes de microscopes à fluorescence à feuillet de lumière offrent d’excellentes capacités de coupe optique, ce qui permet d’imager ces échantillons tridimensionnels épais sur de longues échelles de temps avec un photoblanchiment minimal.
En particulier, le système de feuille de lumière à objectif unique que nous présenterons est compatible avec les échantillons traditionnels montés sur lame, ce qui en fait un outil très polyvalent. L’écrasante majorité des guides à feuille de lumière à objectif unique sont écrits pour des utilisateurs ayant une grande expérience de l’optique. Pour rendre la configuration complexe de style feuille de lumière à objectif unique plus accessible, ce guide détaillé fournit des étapes qu’un utilisateur ayant un cours d’optique d’entrée de gamme peut suivre.
Aperçu
Cette étude vise à approfondir la compréhension des dynamiques de travail dans les matériaux éloignés de l'équilibre, en se concentrant spécifiquement sur les réseaux du cytosquelette. La recherche décrit la conception et l'application d'un microscope à feuillet de lumière monoculaire permettant une visualisation optimale de ces échantillons tridimensionnels denses.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Biologie cellulaire
- Microscopie
- Matériaux loin de l'équilibre
Contexte
- Difficultés liées à l'imagerie d'échantillons biologiques tridimensionnels denses
- Importance de minimiser le photoblanchiment lors de séances d'imagerie prolongées
- Avantages de la microscopie à feuillet de lumière pour la coupe optique
Méthodes utilisées
- Construction d'un microscope à feuillet lumineux à objectif unique
- Utilisation d'échantillons-tests de microtubules marqués au rhodamine
- Procédures d'alignement et d'étalonnage pour une imagerie optimale
Résultats principaux
- Visualisation réussie des réseaux du cytosquelette
- Démonstration de dommages minimes aux échantillons pendant l'imagerie
- Imagerie efficace à différentes profondeurs dans l'échantillon
Conclusions
- Le protocole présente une approche réalisable pour l'imagerie de structures biologiques complexes
- Cette méthode peut aider de manière significative les chercheurs dans l'étude de matériaux biologiques mécaniquement actifs
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La visualisation à haute résolution de réseaux denses du cytosquelette en trois dimensions est essentielle pour la découverte précoce et la réduction des risques mécanistiques dans le cadre de la découverte de médicaments fondée sur la biologie cellulaire. Le microscope à feuillet de lumière à objectif unique (SOLS), personnalisable, permet une imagerie reproductible avec un faible photoblanchiment des assemblages biologiques complexes, renforçant ainsi la confiance prédictive dans la validation des cibles et le criblage phénotypique. Cet instrument accessible comble le fossé entre l'optique d'illumination avancée et les flux de travail pratiques de recherche et développement, améliorant la prise de décision pour les portefeuilles au moment critique de la découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet une visualisation directe de la dynamique du cytosquelette dans des systèmes modèles reconstitués pour la vérification d'hypothèses.
- Permet de réduire les risques mécanistiques en fournissant une imagerie volumétrique fidèle de structures biologiques hors équilibre.
- Facilite la validation fonctionnelle des cibles grâce à des sorties d'imagerie quantitatives et reproductibles.
Développement de tests et criblage
- Prépare des systèmes biologiques tridimensionnels validés pour des flux de travail de criblage phénotypique en aval.
- Fournit des données quantitatives standardisées d'optiques en coupe pour la reproductibilité des tests.
- Permet une évaluation fiable des effets des composés sur l'architecture du cytosquelette dans des échantillons denses.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats d'imagerie avec les phénotypes cytosquelettiques pertinents pour la maladie dans les modèles translationnels.
- Assure la continuité du stade de découverte à la validation préclinique en permettant des études d'imagerie robustes et longitudinales.
- Réduit les risques liés au développement de candidats en clarifiant les mécanismes biologiques dans des systèmes complexes.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le microscope SOLS s'intègre dans la continuité découverte-préclinique en permettant l'imagerie quantitative de modèles cytosquelettiques 3D, soutenant à la fois la recherche fondée sur des hypothèses et le développement d'essais évolutifs.
- Biologie de la découverte : Fournit un sectionnement optique pour tester des hypothèses et clarifier des voies dans des assemblages biologiques denses.
- Criblage : Offre des images quantitatives reproductibles, adaptées à la standardisation des tests et au criblage de composés.
- Analytique : Génère des données volumétriques et des séries temporelles pour l'analyse comparative de conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Relie les phénotypes d'imagerie à des mécanismes pertinents pour les maladies lorsqu'elle est appliquée à des modèles appropriés.
- Réutilisation en entreprise : La conception modulaire permet une adaptation à divers systèmes biologiques et équipes de recherche.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les recherches ciblant le cytosquelette.
- Valeur opérationnelle : Favorise la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité des flux de travail d'imagerie.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go) et l'efficacité du capital en permettant la génération de données robustes et peu entachées d'artéfacts.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque et la progression des actifs en phase de découverte.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite des connaissances fondamentales en optique et un alignement précis des composants optiques.
- Suppose l'accès à un équipement microscopique standard et à des logiciels analytiques pour le traitement des images.
- Exige une standardisation entre équipes pour une imagerie reproductible et une interprétation fiable des données.
- Peut être adapté à divers systèmes modèles moyennant un étalonnage approprié et une préparation adéquate des échantillons.
- Les limites pratiques incluent la complexité de l'alignement et la nécessité d'une compatibilité des échantillons avec le montage sur lame.
