Name: Transformation racinaire poilue du soja pour l’analyse de la fonction génique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Découvrez la transformation racinaire poilue du soja pour l'analyse de la fonction génique. Cette méthode permet d'étudier simultanément plusieurs gènes et réseaux polygéniques avant la transformation stable.

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Cette recherche a été financée par le numéro de subvention RGPIN-2020-06111 du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) et par un généreux don de Brad Lace. Nous tenons à remercier Wayne Parrott (Université de Géorgie) pour l’Agrobacterium K599 et le protocole préliminaire, et le laboratoire Nakagawa & Hachiya (Université de Shimane) pour les vecteurs vides pGWB2, pGWB6 et pANDA35HK.

REMARQUE : Il est recommandé que toutes les étapes de la procédure soient effectuées dans des conditions stériles.
1. Stérilisation des semences de soja
<ol><li>Dans une enceinte de biosécurité, placer 16 à 20 graines de soja Williams 82 rondes en parfait état (c.-à-d. sans fissures ni imperfections) dans un tube à centrifuger de 50 mL.</li>
	<li>Ajouter 30 mL d’alcool isopropylique à 70 %, agiter doucement pendant 30 s, puis décanter l’alcool.</li>
	<li>Agiter doucement les graines avec 30 ml d’eau de Javel à 10 % pendant 10 s et laisser reposer les graines dans la solution pendant 5 minutes à température ambiante (RT, 25 °C). Après 5 min, égoutter l’eau de Javel.</li>
	<li>Répéter l’agitation trois fois avec 30 mL deH2Oultrapur stérile pendant 1 min par rinçage et jeter le H2Oentre chaque rinçage.</li>
	<li>Placer les graines stérilisées sur du papier filtre saturé de 5 mL de milieu de germination et de coculture (GC) (liquide autoclave demi-concentré Murashige et milieu Skoog [MS] avec 1 % de saccharose [pH = 5,8], puis ajouter 2,5 mL/L de vitamines) dans des boîtes de Petri stériles.</li>
	<li>Placer les plaques dans l’obscurité à TA (25 °C) pendant 3 jours avant de transférer les plaques à 22 °C sous 16 h de lampes fluorescentes T5 blanc froid (100 μE m-2·s-1) pendant 4 jours pour permettre aux graines de germer. REMARQUE: Jetez les graines qui sont ridées ou craquelées. Les meilleures graines sont celles qui sont grandes et uniformément jaunes. Stérilisez au moins le double du nombre de graines nécessaires à l’expérience pour sélectionner des graines de bonne qualité, car certaines graines peuvent ne pas être optimales en raison de dommages, de maladies ou d’une absence de germination.</li>
</ol>2. Infection des cotylédons par K599
REMARQUE: Utilisez des vecteurs de la série pGWB, car leur double sélection assure l’intégration génomique de l’ensemble de la cassette d’ADN-T. L’électroporation a été utilisée pour transformer un vecteur binaire hébergeant le gène d’intérêt en A. rhizogenes pRi265918.
<ol><li>Sur la base de la séquence du plasmide18 de A. rhizogenes pRi2659, concevoir des amorces pour détecter le gène du plasmide Ti VirD2 (VirD2 avant: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; VirD2 inverse: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; Taille d’amplification prévue : 221 pb). Après transformation, tester les colonies d’Agrobacterium pour la rétention de VirD2 par amplification en chaîne de la polymérase (PCR) à l’aide d’un kit de PCR (voir le tableau des matériaux). Cycle PCR : 94 °C pendant 3 min ; 35 cycles (94 °C pendant 1 min, 58 °C pendant 30 sec, 72 °C pendant 1 min); et 72 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Après la sélection de la colonie d’A. rhizogenes qui contient à la fois VirD2 et le gène d’intérêt (GOI), en étaler sur des plaques moyennes de Luria-Bertani (LB) contenant les antibiotiques appropriés (50 mg/L) pour le plasmide d’intérêt et incuber pendant la nuit à 30 °C. Si vous utilisez la spectinomycine, ajouter une concentration de 100 mg/L.</li>
	<li>Utiliser un embout de pipette P200 pour gratter une longueur de ~1,5 cm de l’agrobactérie K599 des plaques LB et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de tampon phosphate (PB; 0,01 M Na2HPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,5).</li>
	<li>Diluer l’Agrobacterium dans duH2Oultrapur stérilisé (v/v = 1:1) et de l’acétosyringone (AS; 100 mM de stock dans du diméthylsulfoxyde [DMSO], v/v = 1:1000). Mesurer l’absorbance à l’aide d’un tube cuvette à une densité optique de 600 nm (OD600). La plage optimale attendue se situe entre 0,5 et 0,8.</li>
	<li>Dans une enceinte de biosécurité, tremper un scalpel stérilisé dans la solution K599 Agrobacterium et effectuer plusieurs coupes de 1 mm de profondeur le long de la surface interne (adaxiale, côté plat) du cotylédon. Pendant l’inoculation, utilisez des pinces stérilisées pour stabiliser le cotylédon.</li>
	<li>Placer environ 6 à 8 cotylédons coupés sur une boîte de Petri contenant du papier filtre saturé de milieu GC avec AS. NOTE: Pour préparer 6 plaques, 50 mL de milieu GC et 50 μL de 100 mM AS pour atteindre une concentration finale de 100 μM est suffisant.</li>
	<li>Incuber les plaques à TA (25 °C) pendant 3 jours sous une photopériode de 16 h (~65 μE).</li>
	<li>Transférer les cotylédons infectés sur des plaques de croissance racinaire velue (MS demi-concentrée autoclave avec 3 % de saccharose [pH = 5,8] et 2,6 g/L de Gelzan, puis ajouter 2,5 mL/L de mélange de vitamines et 500 mg/L de timentine). REMARQUE: Il y a eu quelques problèmes avec timentin de certains fournisseurs alternatifs, dont le K599 n’a pas été éliminé. Il est recommandé d’utiliser des plaques de Pétri plus hautes (100 mm x 25 mm) pour le milieu HRG.</li>
	<li>Incuber les plaques HRG à 22 °C dans une chambre de croissance avec les paramètres réglés sur 100 μE de lumière sur une photopériode de 16 h jusqu’à ce que les racines primaires avec des racines secondaires de 2-3 cm de longueur soient observées (~3-4 semaines).</li>
</ol>3. Sélection et récolte des RH
<ol><li>Récoltez les racines primaires (5-7 cm de longueur) qui poussent à partir du cal et contiennent des racines secondaires (2-3 cm de longueur) à l’aide d’un scalpel stérile et de forceps. Transférer dans des plaques HRG de sélection contenant les antibiotiques appropriés. Laissez les HRs pousser pendant 5 jours de plus sur les plaques HRG de sélection. REMARQUE : La kanamycine (50 mg/L), l’hygromycine (50 mg/L) ou la phosphinothricine (10 mg/L) sont généralement utilisées pour la sélection. Pour les vecteurs d’expression, pGWB2 est utilisé pour la surexpression, pANDA35HK est utilisé pour le silençage de l’ARNi, pGWB6 est utilisé pour la localisation subcellulaire et pMDC7 est utilisé pour l’expression inductible.</li>
	<li>Le jour 5, récoltez des HRs transgéniques avec des racines secondaires de 3 à 6 cm de longueur. Si l’on observe des protéines fluorescentes, les racines secondaires ont peu d’autofluorescence. Si vous effectuez des traitements éliminatoires ou chimiques, coupez les racines secondaires en morceaux de 1 cm et placez ~ 100 mg sur gélose HRG en tas. Ensuite, saturer les piles avec 80 μL du traitement approprié et laisser les plaques incuber à TA (25 °C).</li>
	<li>Après le temps de traitement souhaité, procéder à des extractions d’ARN ou de métabolites.</li>
	<li>Pour l’ARN, tamponnez rapidement les racines sèches sur une serviette en papier stérilisée et récoltez-les directement dans un tube microcentrifuge de 2 mL.</li>
	<li>Scellez immédiatement le haut du tube à l’aide d’un parafilm, faites deux petits trous à l’aide de pinces pointues et immergez les tubes dans de l’azote liquide. Lyophiliser pendant 3 jours, puis conserver les échantillons à -80 °C. REMARQUE: Il est essentiel de sélectionner des HRs qui sont blancs. Après 5 jours de croissance sur la plaque sélective, les HR transgéniques resteront blanches, mais les racines non transgéniques bruniront.</li>
</ol>

Production à haut rendement de racines poilues de soja transgénique

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Au cours de la dernière décennie, la méthode HR du soja a été développée comme un outil puissant pour étudier les gènes impliqués dans la fixation de l’azote 22,23, la tolérance au stress biotique et abiotique 24,25 et les voies de biosynthèse des métabolites 26,27. La connaissance de la façon dont les plantes produisent des métabolites présente u...

Le soja (Glycine max) est l’une des cultures les plus précieuses en agriculture. Il a des milliers d’utilisations commerciales et industrielles, telles que l’alimentation, l’alimentation animale, l’huile et comme source de matières premières pour la fabrication1. Sa capacité à former une relation symbiotique avec les microorganismes fixateurs d’azote du sol, à savoir les rhizobiums, accroît encore l’importance de l’étude de la génétique du soja2. Par exemple, le réglage fin des propriétés de fixation de l’azote dans les racines de soja peut entraîner une réduction des émissions de carbone et réduire considérablement les besoins en engrais azoté3. Ainsi, la compréhension de la génétique qui contrôle certains aspects de la biologie des racines du soja, en particulier, a de nombreuses applications dans l’agriculture et l’industrie. Compte tenu de ces avantages, il est important de disposer d’un protocole fiable pour analyser la fonction des gènes du soja.
Agrobacterium tumefaciens est peut-être l’outil le plus couramment utilisé pour la transformation phytogénétique, car il a la capacité d’intégrer l’ADN de transfert (ADN-T) dans le génome nucléaire de nombreuses espèces végétales. Lorsque Agrobacterium infecte une plante, il transfère le plasmide induisant la tumeur (Ti) dans le chromosome hôte, conduisant à la formation d’une tumeur sur le site d’infection. La transformation médiée par Agrobacterium est largement utilisée depuis des décennies pour l’analyse fonctionnelle des gènes et pour modifier les caractères des cultures4. Bien que tout gène d’intérêt puisse être facilement transféré dans les cellules végétales hôtes par transformation médiée par A. tumefaciens, cette méthode présente plusieurs inconvénients; Il prend du temps, coûte cher et nécessite une expertise approfondie pour de nombreuses espèces végétales, telles que le soja. Bien que quelques variétés de soja puissent être transformées par l’approche des ganglions cotylédonaires à l’aide d’A. tumefaciens, l’inefficacité de cette approche nécessite une autre technologie de transformation génétique rapide et très efficace 4,5. Même un non-expert peut utiliser cette méthode de transformation de racine velue médiée par Agrobacterium rhizogenes pour surmonter ces inconvénients.
La transformation HR est un outil relativement rapide, non seulement pour analyser la fonction des gènes, mais aussi pour des applications biotechnologiques, telles que la production de métabolites spécialisés et de produits chimiques fins, et de glycoprotéines bioactives complexes6. La production de HRs de soja ne nécessite pas une expertise approfondie, car ils peuvent être générés en blessant la surface des cotylédons, suivi d’une inoculation avec Agrobacterium rhizogenes7. A. rhizogenes exprime des gènes de virulence (Vir) codés par son plasmide Ti qui transfèrent, transportent et intègrent son segment d’ADN-T dans le génome des cellules végétales tout en stimulant simultanément la croissance des racines ectopiques8.
Comparé à d’autres systèmes d’expression génique du soja, tels que la biolistique ou la transformation à base d’A. tumefaciens de la culture tissulaire, cellulaire et organique, le système d’expression HR présente plusieurs avantages. Premièrement, les HR sont génétiquement stables et produites rapidement sur des milieux sans hormones 1,9,10. De plus, les HRs peuvent produire des métabolites spécialisés en quantités équivalentes ou supérieures à celles des racines indigènes11,12. Ces avantages font des HRs un outil biotechnologique souhaitable pour les espèces végétales qui sont incompatibles avec A. tumefaciens ou qui nécessitent des conditions spéciales de culture tissulaire pour former des tissus compatibles. La méthode HR est une approche efficace pour analyser les interactions protéine-protéine, la localisation subcellulaire des protéines, la production de protéines recombinantes, la phytoremédiation, la mutagénèse et les effets à l’échelle du génome en utilisant le séquençage de l’ARN13,14,15. Il peut également être utilisé pour étudier la production de métabolites spécialisés qui ont une valeur dans l’industrie, y compris les glycéollines, qui médicamentent la défense du soja contre l’important agent pathogène microbien Phytophthora sojae et ont des activités anticancéreuses et neuroprotectrices impressionnantes chez l’homme16,17.
Ce rapport démontre un protocole simple et efficace pour produire des HRs de soja. Par rapport aux méthodes précédentes de transformation HR, ce protocole fournit une amélioration significative (33%-50%) du taux de formation HR en présélectionnant les transformateurs A. rhizogenes pour la présence du plasmide Ti avant l’inoculation des cotylédons de soja. Nous démontrons l’applicabilité de ce protocole en transformant plusieurs vecteurs binaires qui surexpriment ou réduisent au silence les gènes du facteur de transcription du soja.

<table><tbody><tr><td>Acétosyringone</td><td>Caïman</td><td>23224</td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel</td><td>lavo</td><td>21124</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Bioréactifs Fisher</td><td>195679</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan</td><td>Phytotech</td><td>HYY3251089A</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycine</td><td>Phytotech</td><td>HHA0397050B</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropylique</td><td>Fisher</td><td>206462</td><td></td></tr> <tr>chimique<td>Kanamycin</td><td>Phytotech</td><td>SQS0378007G</td><td></td></tr><tr><td>LB poudre</td><td>Bioréactifs Fisher</td><td>200318</td><td></td></tr><tr><td>poudre MS Laboratoires</td><td>Caisson</td><td>2210001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher bioréactifs</td><td>194171</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher 192946</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chimique Boîtes de Pétri</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-11</td><td>100 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>Phosphinothricine</td><td>Cedarlane</td><td>P034-250MG</td><td></td></tr><tr><td>REDExtract-N-Amp Kit PCR</td><td>Sigma</td><td>R4775</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Bioshop</td><td>2D76475</td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>Caisson labs</td><td>12222002</td><td></td></tr><tr><td>Vitamins</td><td>Caisson</td><td>labs 2211010</td><td></td></tr></tbody></table>

transformation racinaire poilue du soja pour l’analyse de la fonction génique

Soybean Hairy Root Transformation for the Analysis of Gene Function

Le soja (Glycine max) est une culture précieuse en agriculture qui a des milliers d’utilisations industrielles. Les racines de soja sont le principal site d’interaction avec les microbes du sol qui forment une symbiose pour fixer l’azote et les agents pathogènes, ce qui rend la recherche sur la génétique des racines de soja d’une importance primordiale pour améliorer sa production agricole. La transformation génétique des racines velues du soja (HR) est médiée par la souche Agrobacterium rhizogenes NCPPB2659 (K599) et constitue un outil efficace pour étudier la fonction des gènes dans les racines de soja, ne prenant que 2 mois du début à la fin. Ici, nous fournissons un protocole détaillé qui décrit la méthode pour surexprimer et réduire au silence un gène d’intérêt dans les HRs de soja. Cette méthodologie comprend la stérilisation des graines de soja, l’infection des cotylédons par K599, ainsi que la sélection et la récolte de RR génétiquement transformés pour l’isolement de l’ARN et, s’il y a lieu, l’analyse des métabolites. Le débit de l’approche est suffisant pour étudier simultanément plusieurs gènes ou réseaux et pourrait déterminer les stratégies d’ingénierie optimales avant de s’engager dans des approches de transformation stables à long terme.

Les résultats représentatifs proviennent des données publiées 19,20. Les résultats de la PCR (cPCR) de la colonie K599 Agrobacterium transformée sont présentés à la figure 1. Comme l’indiquent les colonies positives de la figure 1, le gène d’intérêt a été détecté par PCR (figure 1A). Cependant, un tiers à la moitié des colonies étaient négatives pour le criblage du ...

Nous présentons ici un protocole pour la production à haute efficacité de racines velues de soja transgéniques.

Transformation racinaire poilue du soja pour l’analyse de la fonction génique

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with ...

Notre méthode de transformation des racines velues du soja est suffisante pour étudier simultanément les fonctions de plusieurs gènes ou réseaux, et pourrait déterminer les stratégies d’ingénierie optimales avant de s’engager dans des approches de transformation stables à long terme. La transformation des racines velues du soja est un outil utile pour l’analyse de la fonction des gènes chez les plants de soja. Les technologies actuellement utilisées comprennent l’édition du génome CRISPR-Cas9, l’interférence ARN, la transcriptomique et la protéomique, ainsi que les technologies d’imagerie.Le défi majeur à l’ère des modèles de la génomique fonctionnelle est suffisant pour analyser la fonction de nombreux gènes. La plupart des gènes sont polygéniques, étant obtenus par l’interaction de nombreux gènes. Notre protocole de racine velue facilitera l’analyse de la fonction des gènes avec un débit suffisant, afin que les réseaux polygéniques puissent commencer à être compris.Nous avons établi l’importance du plasmide Ti dans les souches d’agrobacterium rhizogène. Nous avons constaté que sans dépistage du plasmide Ti, cela augmentait le risque pour le cotylédon de soja transformé, de ne pas produire de colorants. En conséquence, le dépistage du plasmide est devenu une étape vitale avant la transformation.Comparé à d’autres techniques d’expression génique, notre système d’expression des racines des cheveux est facile à manipuler, prend moins de temps et est rentable. De plus, notre nouveau protocole a amélioré le taux de transformation des racines velues jusqu’à 50% en vérifiant le plasmide Ti et l’agrobactérie avant la transformation du cotylédon. En caractérisant la fonction de plus d’une douzaine de gènes de facteurs de transcription, nos résultats récents ont ouvert la voie à des études d’ingénierie multigéniques, visant à déverrouiller la biosynthèse de métabolites phytoalexines précieux dans les plantes.À l’avenir, nous utiliserons cette méthode de transformation des racines velues pour disséquer les réseaux de gènes de facteurs de transcription qui régulent la biosynthèse des phytoalexines. L’approche pourrait être utilisée pour améliorer la production de ces métabolites spécialisés pour les industries pharmaceutiques et agricoles.

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Analyses d’expression promoteur sont essentielles pour améliorer la compréhension de la régulation des gènes et de l’expression spatio-temporelle des gènes cibles. Ici, nous présentons un protocole visant à identifier, isoler et cloner un promoteur de la plante. En outre, les auteurs décrivent la caractérisation du nodule spécifique promoteur dans les racines velues de haricot commun.

Analyse de végétaux de promoteur : Identification et caractérisation de racine Nodule promoteur spécifique chez le haricot commun

Nous avons développé un protocole simple et efficace pour la préparation de grandes quantités de protoplastes de soja afin d’étudier les mécanismes réglementaires et signalisation complexes dans des cellules vivantes.

Une méthode Simple pour l’isolement de protoplastes de soja et Application aux Analyses d’Expression génétique transitoire

Nous décrivons une méthode d’induire des racines poilues par Agrobacterium rhizogenes-transformation négociée dans le sarrasin tartarinaire (Fagopyrum tataricum). Ceci peut être employé pour étudier des fonctions de gène et la production des métabolites secondaires dans le sarrasin de tartari, être adopté pour n’importe quelle transformation génétique, ou employé pour d’autres usines médicinales après amélioration.

Induire Hairy Roots par Agrobacterium rhizogenes-Transformation médiatisée dans le sarrasin tartarié (Fagopyrum tataricum)

Ici, nous fournissons le protocole détaillé d’une méthode de transformation en une étape médiée par Agrobacterium tumefaciens pour produire des plantes composites.

Procédé efficace et reproductible de production de plantes composites par transformation racinaire velue basée sur Agrobacterium rhizogenes

Le protocole décrit l’induction des racines poilues à l’aide de tiges d’inflorescence primaires d’Arabidopsis et d’hypocotyles de Brassica napus . Les racines velues peuvent être cultivées et utilisées comme explants pour régénérer les plantes transgéniques.

Transformation et régénération des racines velues chez Arabidopsis thaliana et Brassica napus

Ceci est une étape-par étape indiquant l'objet, l'exploitation et des résultats représentatifs du spectromètre force gravitationnelle roman.

Démonstration des utilisations du spectromètre force gravitationnelle roman de s&#39;étirer et de mesurer les protéines fibreuses

Cet article fournit un protocole pour la culture de jeunes plants d'Arabidopsis dans le RootChip, une plate-forme d'imagerie qui combine microfluidique de contrôle automatisé des conditions de croissance avec un suivi racine microscopique et FRET basée sur la mesure de niveaux intracellulaires de métabolites.

Time-lapse d&#39;imagerie par fluorescence de la croissance racinaire d&#39;Arabidopsis avec la manipulation rapide de l&#39;environnement root en utilisant le RootChip

Un protocole d'analyse de suivi de nanoparticules (NTA) et cytométrie de flux à haut débit afin d'évaluer polymères nanoparticules de transfert de gènes est décrite. NTA est utilisé pour caractériser la distribution des tailles de particules des nanoparticules et la distribution de particules de plasmide par. Cytométrie en flux à haut débit permet l'évaluation quantitative efficacité de transfection pour une bibliothèque de biomatériaux de transfert de gènes.

Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d&#39;analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

Ce protocole d'évaluations Cell-substrat électrique impédance de détection, un procédé pour enregistrer et analyser le spectre de cellules adhérentes d'impédance pour la quantification de la fixation cellulaire, la prolifération, la motilité et la réponse cellulaire aux stimuli pharmacologiques et toxiques. La détection de la perméabilité endothéliale et l'évaluation des contacts cellule-cellule et cellule-substrat sont mis en évidence.

Électrique Cell-substrat Impedance Sensing pour la quantification de la prolifération endothéliale, de la fonction barrière, et la motilité

Un double interférence ARN brin (dsRNAi) technique est employée pour réguler à la baisse la coenzyme maïs cinnamoyl A réductase (ZmCCR1) gène à faible teneur en lignine des plantes. La lignine régulation à la baisse à partir de la paroi cellulaire est visualisée par des analyses microscopiques et quantifiée par la méthode Klason. Changements dans la composition de l'hémicellulose et la cellulose cristalline sont analysés.

Lignine régulation à la baisse de<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi et Klason lignine analyse

Découvrez la transformation racinaire poilue du soja pour l'analyse de la fonction génique. Cette méthode permet d'étudier simultanément plusieurs gènes et réseaux polygéniques avant la transformation stable.

Transformation racinaire poilue du soja pour l’analyse de la fonction génique

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