Name: Purification par affinité d’une enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Découvrez une méthode simple et efficace de purification par affinité d'enzymes fibrinolytiques à partir de Sipunculus nudus. Cette approche utilise l'arginine ou la lysine et offre une alternative économique aux techniques conventionnelles.

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Cette recherche a été financée par le Bureau de la science et de la technologie de la ville de Xiamen (3502Z20227197) et le Bureau de la science et de la technologie de la province du Fujian (n ° 2019J01070, n ° 2021Y0027).

1. Préparation
<ol><li>Traitement des échantillons<ol><li>Disséquer soigneusement S. nudus frais (100 g) et recueillir l’intestin et son liquide interne.</li>
		<li>Ajouter 300 mL de tampon Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) pour l’homogénéisation (1 000 tr/min, 60 s).</li>
		<li>Congeler-décongeler l’homogénat 3x.</li>
		<li>Centrifuger l’échantillon (10,956 × g, 0,5 h, 4 °C) et prélever le surnageant. Conserver l’échantillon à 4 °C jusqu’à nouvelle utilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Précipitation des protéines<ol><li>Mélanger le surnageant avec une solution saturée de sulfate d’ammonium (neuf volumes) et laisser reposer le mélange pendant 12 h à 4 °C. REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici et poursuivi plus tard.</li>
		<li>Centrifugeuse (10 956 × g, 0,5 h, 4 °C) pour obtenir le précipité protéique ; Conservez-le à 4 °C pour une utilisation ultérieure.</li>
	</ol></li>
	<li>Suspension protéique<ol><li>Resuspendre le précipité protéique avec 30 mL de tampon Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4). Conservez cette solution de protéines brutes à 4 °C pour une utilisation ultérieure.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Chromatographie d’affinité
<ol><li>Filtration en solution<ol><li>Filtrer la solution de protéines brutes à travers une membrane filtrante de 0,22 μm. Conserver cet échantillon à 4 °C pour une utilisation ultérieure.</li>
	</ol></li>
	<li>Garnissage de colonne<ol><li>Emballer la colonne de chromatographie matricielle arginine-agarose et la colonne de chromatographie matricielle lysine-agarose en chargeant une quantité appropriée de milieu matriciel lysine-agarose et de milieu matriciel arginine-agarose dans des colonnes de chromatographie vides de 5 mL. REMARQUE: La colonne peut être stockée à 2-8 °C, avec la matrice immergée dans le tampon de stockage (20% d’éthanol).</li>
	</ol></li>
	<li>Purification par affinité<ol><li>Équilibrer d’abord la colonne de chromatographie d’affinité avec ddH2O(1 mL/min, 10 volumes sur colonne), suivie d’un tampon Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/min, 5 volumes de colonne).</li>
		<li>Charger l’échantillon de solution protéique sur la colonne prééquilibrée (1 mL/min, 1/3 de volume de colonne). NOTE: Le volume de chargement de l’échantillon dépend de la concentration de sFE.</li>
		<li>Lavez la colonne avec un tampon Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, cinq volumes de colonne).</li>
		<li>Éluer successivement la colonne avec 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M et 0,65 M NaCl (1 mL/min, cinq volumes de colonne).</li>
		<li>Recherchez le pic d’élution qui devrait apparaître dans l’élution de NaCl de 0,15 M, puis recueillez les fractions dans des tubes de 5 mL.</li>
		<li>Concentrer l’échantillon d’élution à l’aide d’un filtre ultracentrifuge de 3 kD (3 944 × g, 1,5 h, 4 °C). Conservez cet échantillon à -80 °C pour une utilisation ultérieure.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Évaluation de la pureté
<ol><li>Préparation de gel d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE)<ol><li>Préparer le gel SDS-PAGE selon la méthode de Laemmli en utilisant 5% de gel concentré et 12% de gel de séparation13.</li>
	</ol></li>
	<li>Électrophorèse<ol><li>Mélanger l’échantillon (15 μL) avec 5x tampon de charge protéique SDS-PAGE (1/4 de volume), chauffer dans de l’eau bouillante pendant 5 min, charger sur le gel SDS-PAGE et faire fonctionner le gel à 80 V, 60 mA pendant 1,5 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse<ol><li>Après l’électrophorèse, colorez le gel avec un kit de coloration d’argent, selon le protocole du fabricant, et observez le gel coloré à l’aide d’un système d’imagerie chimiluminescent.</li>
		<li>Analysez la pureté de la protéine cible à l’aide de la formule suivante : pureté de la protéine cible = valeur d’intensité de la protéine cible/valeur d’intensité de la protéine totale.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Évaluation de l’activité fibrinolytique
<ol><li>Préparation de plaque de fibrine<ol><li>Préparer la solution de fibrinogène en mélangeant 25 mg de fibrinogène avec 1,25 mL de solution saline physiologique.</li>
		<li>Préparer la solution de thrombine en mélangeant complètement 100 U de thrombine avec 1,05 mL de solution saline physiologique.</li>
		<li>Préparer la solution d’agarose en ajoutant 0,5 g d’agarose à 22,5 mL de tampon Tris-HCl (0,02 mol/L, pH 7,4). Mélanger et chauffer la solution d’agarose à 100 °C jusqu’à dissolution complète.</li>
		<li>Refroidir la solution d’agarose jusqu’à environ 50 °C et ajouter la solution de fibrinogène. Ensuite, ajoutez immédiatement la solution de thrombine, mélangez-les rapidement et versez-les dans un plat de culture de 60 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Chargement<ol><li>Poinçonner des puits de 3 mm sur les plaques de fibrine préparées à l’aide d’un foreur stérile et remplir les puits avec des échantillons de 10 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse<ol><li>Après 18 h d’incubation à 37 °C, mesurer l’activité fibrinolytique en calculant la taille de leurs zones de dégradation. Activité fibrinolytique = (taille de la zone de l’échantillon / taille de la zone de l’urokinase) x 100 U. Taille de la zone = diamètre x diamètre. REMARQUE : Un tampon physiologique salin, une protéine brute (échantillon obtenu à l’étape 1.3.1 du protocole) et l’urokinase ont été utilisés respectivement pour le témoin blanc, le témoin négatif et le témoin positif. Par rapport à l’urokinase, nous avons constaté que l’activité fibrinolytique de la sFE purifiée était de ~19 200 U/mL.</li>
	</ol></li>
</ol>

Purification d’une enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus par chromatographie d’affinité

<ol><li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-brief+report%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li>
<li>Schultz, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis+and+thrombocytopenia+after+ChAdOx1+nCoV-19+vaccination.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England.</a> Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).</li>
<li>von Kaulla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urokinase-induced+fibrinolysis+of+human+standard+clots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots.</a> Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).</li>
<li>Van de Werf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+thrombolysis+with+tissue-type+plasminogen+activator+in+patients+with+evolving+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).</li>
<li>Schaller, J., Gerber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmin-antiplasmin+system%3A+structural+and+functional+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).</li>
<li>Ge, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+novel+fibrinolytic+enzyme+from+culture+supernatant+of+Pleurotus+ostreatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).</li>
<li>Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starase%3A+A+bi-functional+fibrinolytic+protease+from+hepatic+caeca+of+Asterina+pectinifera+displays+antithrombotic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential.</a> Biochimie. 105, 45-57 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fibrinolytic+protein+From+Pheretima+vulgaris%3A+purification%2C+identification%2C+antithrombotic+evaluation%2C+and+mechanisms+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419(2022).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant%2C+hypolipidemic+and+hepatic+protective+activities+of+polysaccharides+from+Phascolosoma+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta.</a> Marine Drugs. 18 (3), 158(2020).</li>
<li>Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en">https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en</a> (2019).</li>
<li>Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+expressed+differentially+in+female+and+male+gametes+of+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus.</a> Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).</li>
<li>Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+renature+DNA-binding+proteins+separated+by+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).</li>
<li>Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+reveals+cryptic+diversity+in+the+peanut+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+I.+Purification+and+properties+of+human+plasminogen%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+II.+Purification+and+properties+of+human+plasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).</li>
<li>Wiman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-chromatographic+purification+of+human+%CE%B12-antiplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin.</a> The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).</li>
<li>Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+and+characterization+of+a+new+fast-acting+plasmin+inhibitor+from+human+platelets.+Evidence+for+non-identity+with+the+known+plasma+proteinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors.</a> The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).</li>
<li>Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+plasma%2Fcellular+fibronectin+and+fibronectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments.</a> Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).</li>
<li>Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+and+purification+of+human+recombinant+tissue+type+plasminogen+activator+%28rt-PA%29+from+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Preparative+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants.</a> Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).</li>
<li>Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+abnormalities+of+human+plasminogen+isolated+from+synovial+fluid+of+rheumatoid+arthritis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients.</a> Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

En raison de l’indisponibilité de la séquence génétique exacte de la sFE, la sFE actuellement utilisée a été extraite de S. nudus14 frais. De plus, les procédures de purification de la sFE rapportées dans la littérature étaient compliquées et coûteuses, car elles étaient basées sur certaines caractéristiques générales de la sFE, telles que le poids moléculaire, le point isoélectrique, la force ionique et la polarité15,16. Aucun pr...

La thrombose est une menace majeure pour la santé publique, en particulier suite à la pandémie mondiale de Covid-19 1,2. Cliniquement, de nombreux activateurs du plasminogène (AP), tels que l’activateur du plasminogène de type tissulaire (tPA) et l’urokinase (Royaume-Uni), ont été largement utilisés comme médicaments thrombolytiques. Les AP peuvent activer le plasminogène des patients en plasmine active pour dégrader la fibrine. Ainsi, leur efficacité thrombolytique est fortement limitée par le statut plasminogènedes patients 3,4. Les agents fibrinolytiques, tels que la plasmine métalloprotéinase et la sérine plasmine, sont un autre type de médicament thrombolytique clinique qui comprend également des enzymes fibrinolytiques (FE) telles que la plasmine, qui peuvent dissoudre directement les caillots mais sont rapidement inactivées par divers inhibiteurs de la plasmine5. Par la suite, un nouveau type d’agent fibrinolytique a été signalé qui peut dissoudre le thrombus non seulement en activant le plasminogène en plasmine, mais aussi en dégradant directement la fibrine 6-l’enzyme fibrinolytique de l’ancien ver d’arachide Sipunculus nudus (sFE)6. Cette bifonction confère à la sFE d’autres avantages par rapport aux médicaments thrombolytiques traditionnels, en particulier en termes de statut plasminogène anormal. Par rapport à d’autres agents fibrinolytiques bifonctionnels 7,8,9, la sFE présente plusieurs avantages, y compris la sécurité, par rapport aux agents dérivés non alimentaires pour le développement de médicaments, en particulier pour les médicaments oraux. En effet, la biosécurité et la biocompatibilité de Sipunculus nudus ont été bien établies10.
Semblable aux autres agents fibrinolytiques naturels isolés à partir de micro-organismes, de vers de terre et de champignons, la purification de la sFE de S. nudus est très compliquée et comprend plusieurs étapes, telles que l’homogénéisation des tissus, la précipitation du sulfate d’ammonium, le dessalement, la chromatographie par échange d’anions, la chromatographie d’interaction hydrophobe et le tamisage moléculaire10,11,12. Un tel système de purification dépend non seulement de compétences compétentes et de matériaux coûteux, mais nécessite également plusieurs jours pour terminer l’ensemble de la procédure. Par conséquent, un programme de purification simple de la sFE est d’une grande importance pour le développement ultérieur de la sFE. Heureusement, deux cristaux de sFE (PDB: 8HZP; PDB : 8HZO) ont été obtenus avec succès (voir Fichier supplémentaire 1 et Fichier supplémentaire 2). Grâce à des analyses structurelles et à des expériences d’amarrage moléculaire, nous avons constaté que le noyau catalytique de la sFE pouvait spécifiquement se lier à des cibles contenant des résidus d’arginine ou de lysine.
Ici, un système de purification par affinité a été proposé pour la première fois, basé sur la structure cristalline de la sFE. En suivant ce protocole, la sFE hautement pure et hautement active pourrait être purifiée à partir des extraits bruts en une seule étape de purification par affinité. Le protocole développé ici est non seulement important pour la préparation à grande échelle de sFE, mais peut également être appliqué pour la purification d’autres agents fibrinolytiques.

<table><tbody><tr><td>30 % Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)</td><td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose G-10</td><td>Biowest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfate d’ammonium</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arginine-Sepharose 4B</td><td>Solarbio</td><td>Matrice arginine-agarose</td><td></td></tr><tr><td>Bleu Bromoxylenol (BPB)</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de teinture Fast Silver</td><td>Beyotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogène</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kinase</td><td>RHAWN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysine-Sepharose 4B</td><td>Solarbio</td> Matrice <td></td>de <td>lysine-agarose</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)</td>Marqueur de protéine de couleur pré-coloré <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10-170 kD)</td><td>Chlorure de sodium Beyotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dodécyl sulfonate de sodium (SDS)</td><td>Hydroxyde de sodium Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Meilunbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane</td><td>Hydrochloride Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKT Aprotein Purification System pure</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stérilisateur automatique à vapeur à pression verticale MLS-3750</td> Système d’imagerie par chimiluminescence <td>SANYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompe à débit constant GE</td><td></td> BT-100 QITE <td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à température constante</td><td>JINGHONG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée de bureau 3-30KS</td><td>SIGMA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> DHG Series Four de chauffage et de séchage <td></td><td></td></tr><tr><td> DGG-9140AD</td> Homogénéisateur de verre électrique <td>SENXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DY89-II</td> Balance analytique électronique <td>SCIENTZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie électro-thermostatique DENVER</td><td></td> DK-S12 Shaker de décoloration horizontal SENXIN <td></td><td></td></tr> Machine à glaçons <tr><td></td><td>Kylin-Bell</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> AF 103 Scotsman <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur à ultrasons KQ-500E Agitateur</td> magnétique <td>ShuMei</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée Zhi wei</td><td></td> Micro Centrifugeuse H1650-W Cence <td></td><td></td></tr><tr><td>Four à micro-ondes</td><td>Galanz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Référence</td><td>Pipette Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-mètre de bureau de précision</td><td>Sartorious</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oscillateur vortex de petite taille</td> Système d’électrophorèse <td>verticale Kylin-Bell</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consumable Material&nbsp ; </td>200 & <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro ; L Tube PCR (200 &micro ; L)</td>Tube à centrifuger <td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1,5 ml)</td>Tube à <td>centrifuger Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5 ml)</td>Tube à centrifuger <td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(50 ml)</td>Tube à centrifuger <td>NEST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(7 ml)</td>Plat de culture <td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(60 mm)</td>Membrane filtrante <td>NEST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(0,22 & micro ; m)</td>Pointe de pipette <td>Millex GP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1 mL</td>)Pointe de pipette <td>KIRGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10 &micro ; L)</td> Pointe de pipette <td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(200 & micro ; L)</td><td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Special Indicator Paper</td> Unité de filtration <td>ultra centrifuge TZAKZY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(15 mL 3 KDa)</td>Unité de filtration ultra centrifuge <td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(4 mL 3 KDa)</td><td>Indicateur</td> de pH universel Millipore <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Réactif</td><td></td><td></td> SSS</tr></tbody></table>

purification par affinité d’une enzyme fibrinolytique de sipunculus nudus

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

L’enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus (sFE) est un nouvel agent fibrinolytique qui peut à la fois activer le plasminogène en plasmine et dégrader directement la fibrine, montrant de grands avantages par rapport aux agents thrombolytiques traditionnels. Cependant, en raison du manque d’informations structurelles, tous les programmes de purification de la sFE sont basés sur des purifications chromatographiques en plusieurs étapes, trop compliquées et coûteuses. Ici, un protocole de purification d’affinité de sFE est développé pour la première fois basé sur une structure cristalline de sFE; il comprend la préparation de l’échantillon brut et de la colonne de chromatographie d’affinité matricielle lysine/arginine-agarose, la purification par affinité et la caractérisation de la sFE purifiée. En suivant ce protocole, un lot de sFE peut être purifié en 1 jour. De plus, la pureté et l’activité de la sFE purifiée augmentent à 92% et 19 200 U/mL, respectivement. Il s’agit donc d’une approche simple, peu coûteuse et efficace pour la purification de la sFE. Le développement de ce protocole est d’une grande importance pour l’utilisation ultérieure de la sFE et d’autres agents similaires.

À la suite de ce protocole, des lysats tissulaires bruts ont été extraits, des colonnes de chromatographie de chromatographie matricielle arginine-agarose et lysine-agarose ont été construites, du sFE purifié a été obtenu et la pureté et l’activité fibrinolytique de la sFE purifiée ont été mesurées par SDS-PAGE et des plaques de fibrine, respectivement.
Après centrifugation, le surnageant recueilli était un liquide visqueux transparent bronzé. Les précipitations ont commencé lorsque ce surnage...

Ici, nous présentons une méthode de purification par affinité d’une enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus qui est simple, peu coûteuse et efficace.

Purification par affinité d’une enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

Nos recherches portent principalement sur la purification de l’enzyme fibrinolytique. Ce travail tente d’établir une méthode de purification simple de l’enzyme fibrinolytique. Dans ce travail, nous rapportons pour la première fois un système de purification de l’arginine ou de la lysine de l’enzyme fibrinolytique.Par rapport aux méthodes de purification conventionnelles, il s’agit d’une approche simple, peu coûteuse et efficace pour la purification des enzymes fibrinolytiques de Sipunculus nudus. Le développement de ce protocole est d’une plus grande importance pour l’utilisation ultérieure des enzymes fibrinolytiques de Sipunculus nudus et d’autres agents similaires.

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Mama est un unique protéines associées magnétosome qui a été montré pour être impliqués dans l'activation magnétosome. Nous présentons ici le protocole de purification de Mama mutant de délétion (MamAΔ41)...

Purification de la M. magneticum Strain AMB-1 Protein magnétosome Associated MamAΔ41

Tandem Affinity Purification est une approche robuste pour l'identification de partenaires de liaison aux protéines. Comme preuve de concept, cette méthodologie a été appliquée à la eIF4E facteur d'initiation de traduction bien caractérisé à la co-précipité les facteurs cellulaires de l'hôte impliqués dans l'initiation de la traduction. Cette méthode est facilement adaptable à n'importe quelle protéine cellulaire ou virale.

Identification des partenaires protéine interagissant Utilisation Tandem Affinity Purification

Protéine de l’intégrase spumavirus prototype recombinante est souvent contaminée par une nucléase bactérienne pendant la purification. Cette méthode identifie la contamination nucléase et le supprime de la préparation finale de l’enzyme.

Détection et suppression de nucléase Contamination durant la Purification de l’intégrase du Virus spumeux Prototype Recombinant

Ce protocole décrit comment extraire la protéine 1 contenant le domaine de l’hydrolase fumarylacétoacétate (FAHD1) du rein et du foie de souris. Les méthodes énumérées peuvent être adaptées à d’autres protéines d’intérêt et modifiées pour d’autres tissus.

Extraction et purification de la protéine FAHD1 du rein de porc et du foie de souris

Cet article fournit une procédure pour la purification d’affinité d’une protéine recombinante humaine, l’endonucléase de lambeau 1 (FEN1), qui a été marquée avec un marqueur 6X-histidine. Le protocole implique l’utilisation de deux colonnes d’ions métalliques immobilisées distinctes pour la purification de la protéine marquée.

Purification d’affinité d’une protéine marquée 6X-His à l’aide d’un système de chromatographie liquide à protéines rapides 

Ici, nous présentons un protocole d’électrophorèse sur gel fibrinogène-polyacrylamide (PAGE) pour séparer et afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques de Sipunculus nudus.

Séparation et affichage rapides d’agents fibrinogénolytiques actifs chez Sipunculus nudus par électrophorèse sur gel fibrinogène-polyacrylamide

Cet article décrit une méthodologie de surexpression de Nsp15 recombinant, une nucléase toxique, dans un système d’expression C41(DE3), suivie d’une purification de la protéine marquée à l’aide de la chromatographie d’affinité et d’exclusion stérique. Ces protocoles peuvent être adaptés à d’autres protéines toxiques difficiles.

Surexpression et purification d’une nucléase toxique d’Escherichia coli

Un protocole pour la production, la purification et l’utilisation de vésicules de membrane externe emballées d’enzymes (OMV) offrant une stabilité enzymatique améliorée pour une mise en œuvre dans diverses applications est présenté.

Réalisé Conditionnement des protéines dans la membrane externe de vésicules<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Conception, production et purification

Nous décrivons ici les protocoles pour perturber les cellules de mammifères par fraisage à l'état solide à une température cryogénique, produire un extrait de cellule à partir de la poudre cellulaire résultante, et isoler des complexes de protéines d'intérêt par capture par affinité sur anticorps couplé micrométriques billes paramagnétiques.

Protein Complex Affinity Capture à partir de cellules de mammifères Cryomilled

Nous décrivons ici une méthode de purification par affinité en tandem (TAP) nouvelle, robuste et efficace pour l’expression, l’isolement et la caractérisation de complexes protéiques à partir de cellules eucaryotes. Ce protocole pourrait être utilisé pour la caractérisation biochimique de complexes discrets ainsi que pour l’identification de nouveaux interacteurs et de modifications post-traductionnelles qui régulent leur fonction.

La purification d&#39;affinité en tandem de complexes protéiques à partir des cellules eucaryotes

Découvrez une méthode simple et efficace de purification par affinité d'enzymes fibrinolytiques à partir de Sipunculus nudus. Cette approche utilise l'arginine ou la lysine et offre une alternative économique aux techniques conventionnelles.

Purification par affinité d’une enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus

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