Fabrication de grilles monocouches recouvertes de graphène pour la cryomicroscopie électronique
8 septembre 2023
Ici, nous décrivons un protocole pour l’application d’une seule monocouche de graphène sur des grilles de microscopie électronique et comment les préparer pour une utilisation dans la détermination de la structure cryoEM.
À l’heure actuelle, la conservation optimale des échantillons biologiques est un défi majeur dans l’obtention de structures CryoEM à haute résolution. Au cours du processus de préparation des échantillons, les échantillons sont exposés à une interface air-eau hydrophobe, ce qui a des effets dénaturants sur les échantillons et peut amener les échantillons stables à adopter une orientation préférentielle dans la glace, ce qui empêche la détermination de la structure à haute résolution. Le revêtement des grilles CryoEM avec une fine couche de carbone d’oxyde de graphène mou a été couramment utilisé pour résoudre les problèmes liés aux interactions avec l’interface air-eau.
Cependant, ces couches augmentent souvent le bruit de fond dans nos images, ce qui compromet les résolutions de notre structure. Le revêtement de la grille avec une monocouche de graphène permet d’obtenir une protection similaire sans introduire de bruit de fond important. L’utilisation de grilles CryoEM recouvertes de graphène peut aider à surmonter les problèmes liés aux interactions avec l’interface air-eau, cependant, les grilles de graphène commerciales sont coûteuses et de nombreux laboratoires considèrent que les grilles de graphène sont trop compliquées à préparer en interne.
Les chercheurs dans le domaine de la cryoEM peuvent désormais utiliser ce protocole étape par étape pour reproduire des dizaines de graphènes de haute qualité entièrement produits en une journée.
Aperçu
Cette étude aborde le défi de la préservation optimale des échantillons biologiques pour la microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) à haute résolution. Les auteurs présentent un protocole permettant de recouvrir les grilles de microscopie électronique (EM) d'une monocouche unique de graphène afin de minimiser le bruit de fond et d'améliorer l'intégrité de l'échantillon durant l'observation.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Microscopie électronique cryogénique
- Préservation des échantillons en imagerie biologique
- Applications du graphène en microscopie
Contexte
- La préservation des échantillons biologiques est cruciale pour l'obtention de structures cryo-ME de haute résolution.
- Les revêtements traditionnels en carbone peuvent augmenter le bruit de fond en imagerie.
- Le graphène fournit une couche protectrice sans compromettre la qualité de l'image.
Méthodes utilisées
- Application d'une monocouche de graphène sur des grilles de microscopie électronique
- Techniques d'imagerie cryo-microscopie électronique
- Utilisation de dispositifs de rotation maison et de divers agents de nettoyage
Résultats principaux
- Les grilles revêtues de graphène montrent une réduction du bruit de fond en imagerie.
- La méthode permet la production à grande échelle de graphène de haute qualité en un seul jour.
- Les grilles de ME démontrent une préservation et une concentration efficaces des échantillons biologiques.
Conclusions
- Le protocole fournit une approche simple permettant aux laboratoires de produire des grilles de ME recouvertes de graphène.
- Cette avancée renforce le potentiel d'amélioration de l'imagerie cryo-ME en recherche biologique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La cryoME à haute résolution joue un rôle essentiel en biologie structurale et en découverte de médicaments, mais la dénaturation des échantillons et les biais d'orientation à l'interface air-eau limitent la qualité des données et le débit. Les grilles recouvertes d'un monocouche de graphène permettent de surmonter ces obstacles en préservant l'intégrité des macromolécules et en réduisant le bruit de fond, ce qui a un impact direct sur la découverte précoce et la validation des cibles. La fabrication interne à grande échelle de grilles en graphène facilite une adoption plus large, soutient des études structurales à l'échelle du portefeuille et accélère la caractérisation mécanistique pour l'atténuation des risques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet une analyse structurale de haute fidélité des complexes macromoléculaires pour la validation des cibles.
- Réduit la dénaturation et l'agrégation, facilitant la réduction des risques mécanistiques en phase précoce de découverte.
- Améliore la diversité d'orientation, renforçant la fiabilité prédictive des modèles structuraux.
Développement de tests et criblage
- Facilite la préparation de grilles cryoME reproductibles et à faible bruit de fond pour le criblage en aval.
- Permet l'imagerie quantitative en minimisant le bruit et les artefacts de concentration.
- Permet une évaluation fiable des complexes protéiques à des concentrations d'échantillon plus faibles.
Recherche translationnelle et préclinique
- Améliore la continuité entre la découverte et la validation préclinique en permettant la génération de données structurales robustes.
- S'aligne sur le développement de biomarqueurs translationnels grâce à une résolution structurale améliorée.
- Réduit le risque d'échecs en phase avancée dus à des données structurales ambiguës ou altérées.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Les grilles revêtues de graphène en monocouche s'intègrent dans le flux de travail de cryo-ME, depuis la découverte précoce jusqu'à l'identification des candidats-médicaments et la recherche préclinique, en soutenant des études structurales guidées par des hypothèses et en permettant un imagerie reproductible et de haute qualité.
- Découverte en biologie : Facilite la vérification des hypothèses et la clarification des voies biologiques en préservant les conformations natives des macromolécules.
- Criblage : Fournit des grilles standardisées et reproductibles pour des essais quantitatifs de cryo-microscopie électronique.
- Analytique : Produit des images à faible bruit et haute résolution permettant des analyses comparatives rigoureuses.
- Recherche translationnelle : Améliore la continuité préclinique en permettant une caractérisation structurale fiable des candidats thérapeutiques.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme évolutible et rentable pour des études structurales répétées dans divers programmes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique en biologie structurale.
- Valeur opérationnelle : Normalise la préparation des grilles, améliore la reproductibilité et permet une montée en échelle par lots.
- Valeur stratégique : Accélère les décisions d'aller/arrêt et réduit les risques biologiques tardifs grâce à des données de meilleure qualité.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement ajustés au risque des cibles validées structuralement.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise dans la manipulation des grilles cryoME et du graphène.
- Nécessite un accès à des centrifugeuses, à des hottes de ventilation et à l'infrastructure standard de préparation des grilles de microscopie électronique.
- Exige une standardisation interéquipes pour garantir la reproductibilité de la qualité des grilles et des résultats d’imagerie.
- Des adaptations peuvent être nécessaires selon les classes de protéines ou les types d’échantillons.
- Les limites potentielles incluent la sensibilité lors de la manipulation et la formation initiale requise pour les étapes de transfert du graphène.
