Name: Fabrication de grilles monocouches recouvertes de graphène pour la cryomicroscopie électronique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Apprenez à fabriquer des grilles monocouches recouvertes de graphène pour la cryomicroscopie électronique. Cette méthode réduit le bruit de fond et améliore la préservation des échantillons biologiques.

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Nous remercions le Dr Xiao Fan pour les discussions utiles lors de la mise en place de ces méthodes chez Scripps Research. B.B. a bénéficié d’une bourse de recherche postdoctorale de la Fondation Hewitt pour la recherche médicale. W.C. est soutenu par une bourse prédoctorale de la National Science Foundation. D.E.P est soutenu par les NS095892 de subvention des National Institutes of Health (NIH) à G.C.L. Ce projet a également été soutenu par des subventions du NIH GM142196, GM143805 et S10OD032467 à G.C.L.

Revêtement de grilles TEM avec une monocouche de graphène

<ol><li>Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+electron+dose+rate+on+electron+counting+images+recorded+with+the+K2+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 1-22 (2018).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSPARC%3A+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li>
<li>Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+individual+atoms+of+protein+complex+by+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy.</a> Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).</li>
<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li>
<li>Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins%2C+interfaces%2C+and+cryo-em+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Proteins, interfaces, and cryo-em grids.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).</li>
<li>Glaeser, R. M., Han, B. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion%3A+hazards+faced+by+macromolecules+when+confined+to+thin+aqueous+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films.</a> Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).</li>
<li>Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer-crystal+streptavidin+support+films+provide+an+internal+standard+of+cryo-EM+image+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality.</a> Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, 1-42 (2018).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li>
<li>Liu, N., Wang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+cryo-EM+specimen+preparation%3A+how+to+deal+with+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface.</a> Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926(2022).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).</li>
<li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+carbon+films+with+%7E500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li>
<li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%3A+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li>
<li>Pantelic, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene%3A+substrate+preparation+and+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene: substrate preparation and introduction.</a> Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+an+optimal+specimen+support+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high-resolution cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+monolayer+graphene+grids+for+near-atomic+resolution+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+ultraclean+atomically+thin+membranes+for+atomic-resolution+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 541(2020).</li>
<li>Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhn%2C+E+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. (Cvd), (2021).</li>
<li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li>
<li>Fan, H., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+graphene+grids+for+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Developing graphene grids for cryoelectron microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253(2022).</li>
<li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> eLife. 8, e42747(2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+copper+step+beams+during+graphene+growth+by+CVD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method.</a> Applied Surface Science. 610, 155518(2023).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+thin+ice+on+ultraflat+graphene+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM.</a> Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).</li>
<li>Fujita, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxidized+graphene+grid+for+highly+efficient+high-resolution+cryoEM+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis.</a> Scientific Reports. 13, 2279(2023).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+graphene+grids+with+various+charges+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM.</a> Nature Communications. 13, 6718(2022).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

La conservation d’échantillons biologiques dans une fine couche de glace vitreuse est une étape cruciale pour la détermination de la structure cryoEM à haute résolution. Cependant, les chercheurs rencontrent souvent des problèmes découlant des interactions avec l’AWI, qui introduit l’orientation préférée, le désassemblage complexe, la dénaturation et l’agrégation. De plus, les échantillons ne peuvent pas toujours être suffisamment concentrés pour peupler la mince glace en suspension dans les trous d’une pellicule fenêtrée. Plusieurs groupes de recherche ont mis au point des méthodes pour recouvrir les grilles EM d’une monocouche de graphène afin d’aider à surmonter certaines de ces limitations 24,25,26,27,28,29,30, et les grilles de graphène ont été utilisées avec beaucoup de succès. Ici, nous fournissons des instructions étape par étape pour préparer efficacement des lots de grilles de graphène en interne et examiner la qualité des grilles de graphène par MET. Nous insistons sur le fait qu’une attention particulière doit être exercée lors de certaines des étapes critiques, que nous décrivons ci-dessous.
Le graphène a une forte tendance à attirer les contaminants en suspension dans l’air. Par conséquent, pendant le processus de fabrication de la grille de graphène, il est important de s’assurer que tous les outils qui entrent en contact avec la feuille de graphène/Cu ou les grilles sont propres et exempts de poussière. Les lamelles en verre utilisées pour transférer le graphène peuvent être nettoyées en les rinçant à l’éthanol et à l’eau déminéralisée ou en utilisant un dépoussiéreur à air. Il est également conseillé de travailler sous une hotte et de garder les feuilles et les grilles de graphène recouvertes de papier d’aluminium ou d’une plaque de verre propre à tout moment. La poussière ou les contaminants sur les grilles peuvent empêcher le graphène d’adhérer complètement aux grilles EM. Lors de la manipulation de graphène ou de grilles recouvertes de graphène, il est important d’être mis à la terre électriquement pour éviter d’endommager le film de graphène en raison d’une décharge statique. Les décharges électrostatiques peuvent être évitées en utilisant une sangle de mise à la terre au poignet, en touchant un objet métallique mis à la terre chaque fois que des grilles en graphène ou en graphène sont manipulées, et/ou en ne portant pas de gant sur la main tenant la pince à épiler24.
Étant donné qu’une monocouche de graphène est très mince (la largeur d’un atome de carbone), il est important de soutenir le graphène avec une couche organique telle que le MMA ou le poly-MMA (PMMA) lors du transfert du graphène sur les grilles. Le PMMA est le matériau le plus utilisé pour le transfert de graphène. Cependant, le PMMA a une forte affinité avec le graphène et peut souvent entraîner une contamination du polymère sur le film de graphène. Le MMA est utilisé dans ce protocole, car il laisse moins de contamination résiduelle25. Cependant, le PMMA et le MMA ont tous deux l’inconvénient de former des rides et des fissures qui peuvent être observées dans certaines zones du film de graphène (Figure 3B). Il peut être difficile d’éviter ces rides car elles se produisent généralement lors de la croissance du graphène par la méthode CVD31. Une méthode a été récemment mise au point pour faire pousser du graphène ultra-plat sans plis, dans laquelle la feuille de cuivre est remplacée par une plaquette de Cu(111)/saphir comme substrat de croissance32.
Sur la base de notre expérience, il est préférable d’acheter des feuilles de graphène/Cu et de soutenir le graphène avec du MMA en interne plutôt que d’acheter des feuilles de Cu-graphène recouvertes de polymère auprès de fabricants, qui deviennent cassantes après la gravure sur cuivre et sont difficiles à manipuler dans les étapes ultérieures. La machine de revêtement par centrifugation que nous avons utilisée pour le revêtement MMA peut être construite à moindre coût à l’aide de pièces provenant d’un magasin d’informatique ou de quincaillerie local, comme décrit précédemment25.
Lors de l’étape du revêtement MMA, il est important de recouvrir l’intégralité de la surface du graphène sur la feuille de Cu-graphène avec du MMA. Une fois que le Cu a été gravé, le MMA-graphène deviendra semi-transparent et les zones dépourvues de couverture MMA ressembleront à des trous vides. Pour éviter le revêtement MMA du côté du cuivre, il est important de placer un petit morceau de papier buvard en dessous pendant le revêtement afin qu’il absorbe tout excès de MMA qui s’échappe du film CVD.
Après la gravure et le rinçage, la feuille de MMA/graphène est prête à être transférée sur les grilles EM en utilisant un système d’auge commercial ou fait maison avec une seringue ou une pompe péristaltique pour contrôler le niveau d’eau. Avant l’étape de transfert, il est important de bien prérincer les grilles dans des bains successifs de chloroforme, d’acétone et d’IPA. La cuisson des grilles recouvertes de graphène à 65 °C permet de préserver l’intégrité du graphène et favorise l’adsorption du graphène sur les grilles. Enfin, pour éviter la contamination par le MMA sur les grilles, il est important de bien retirer le MMA dans un bain d’acétone et de nettoyer les grilles dans de l’IPA. Tout résidu de MMA non lavé sera observé sur les grilles EM et diminuera le rapport signal/bruit des images (Figure 3C). Le processus de lavage à l’acétone-IPA peut être répété pour nettoyer davantage les surfaces en graphène.
Pour rendre les grilles de graphène hydrophiles, nous les avons exposées aux UV/Ozone. Différents modèles de nettoyants UV/ozone peuvent nécessiter une optimisation pour oxygéner suffisamment la couche de graphène pour la préparation d’échantillons cryoEM sans endommager le graphène. Quel que soit le système, il est essentiel d’utiliser ces grilles pour l’application d’échantillons cryoEM immédiatement après le traitement UV/Ozone. Des méthodes alternatives pour rendre les grilles de graphène hydrophiles sont décrites dans d’autres études33,34.

La microscopie électronique cryogénique monopartite (cryoEM) est une technologie de plus en plus utilisée pour étudier les structures 3D des biomacromolécules. Les progrès technologiques réalisés au cours de la dernière décennie dans le domaine de l’optique du microscope électronique, de la détection directe d’électrons1 et des algorithmes informatiques 2,3,4 ont permis aux utilisateurs de cryoEM de déterminer les structures de complexes macromoléculaires biochimiquement stables avec une résolution proche de l’atome 5,6,7,8 . Malgré ces avancées, il subsiste des obstacles notables à la préservation des échantillons pour l’imagerie cryoEM, ce qui empêche la majorité des échantillons biologiques d’être résolus à des résolutions aussi élevées.
La préparation d’échantillons pour l’analyse cryoEM à haute résolution consiste à piéger des macromolécules qui sont uniformément réparties dans une large gamme d’orientations dans une fine couche de glace vitrifiée. Les méthodes de congélation « blot and plunge » sont les méthodes les plus utilisées pour générer des films minces d’échantillons biologiques sur des grilles pour les études cryoEM 9,10. Ces méthodes consistent à appliquer quelques microlitres de solution d’échantillon sur une grille EM contenant un film fenêtré qui a été rendu hydrophile, puis à éponger la majorité de l’échantillon avec du papier filtre avant de plonger rapidement la grille dans un cryogène d’éthane liquide ou d’un mélange éthane-propane9.
Bien que cette méthode ait été utilisée avec succès pour déterminer les structures d’un large éventail d’échantillons biologiques, toutes les méthodes de préparation d’échantillons cryoEM couramment utilisées exposent les échantillons à l’interface air-eau (AWI) hydrophobe, ce qui introduit souvent des problèmes qui limitent la détermination de la structure à haute résolution. Il est établi que les spécimens biologiques ont une forte propension à se dénaturer lorsqu’ils sont exposés à l’AWI, ce qui peut conduire à une agrégation et à un désassemblage complexes11,12,13,14. De plus, les taches hydrophobes à la surface des échantillons biologiques font que les particules adoptent des orientations préférentielles dans la glace12. Dans de nombreux scénarios, une seule région hydrophobe de l’échantillon force toutes les particules à adopter une orientation singulière dans la glace, abolissant ainsi la capacité de générer une reconstruction fiable. En plus des problèmes liés à l’AWI, les échantillons peuvent démontrer une affinité pour la surface de la couche de film fenêtrée, ce qui limite le nombre de particules en suspension dans la glace à l’intérieur des trous15.
Plusieurs solutions méthodologiques et technologiques ont été développées pour diminuer ces problèmes découlant des interactions avec l’AWI ou les films16,17. Une approche populaire consiste à recouvrir le film fenêtré des grilles EM d’une fine couche (de dizaines de nanomètres) de carbone amorphe. Ce revêtement fournit une surface continue à travers les trous sur laquelle les particules peuvent s’adsorber, avec l’avantage de protéger partiellement l’échantillon des interactions avec l’AWI15,18,19,20. Cependant, la couche de carbone supplémentaire augmente la quantité de signal de fond dans les régions photographiées, introduisant un bruit qui peut compromettre la résolution atteignable, en particulier pour les petits spécimens (<150 kDa). Ces dernières années, l’utilisation de flocons d’oxyde de graphène (GO) pour produire des films de support sur des grilles cryoEM s’est avérée présenter des avantages par rapport au carbone amorphe traditionnel. Les flocons de GO sont produits par l’oxydation de couches de graphite, ce qui donne des feuilles pseudo-cristallines de graphite monocouche qui sont hydrophiles en raison de leur teneur substantielle en oxygène sous forme de groupes carboxyle, hydroxyle et époxy sur les surfaces et les bords. Les flocons de GO commerciaux en suspensions aqueuses sont peu coûteux, et il existe de nombreuses méthodes publiées pour appliquer les flocons de GO sur les grilles EM18,21. Cependant, ces méthodes aboutissent souvent à des grilles qui ne sont que partiellement recouvertes de flocons GO, ainsi qu’à des régions qui contiennent plusieurs couches de flocons GO. De plus, les flocons GO contribuent à un signal de fond notable aux images cryoEM qui est proche de celui observé avec le carbone amorphe mince22,23.
Le graphène monocouche vierge, qui se compose d’un seul réseau cristallin 2D d’atomes de carbone, se distingue du GO en ce qu’il ne produit pas de contraste de phase au microscope électronique. Le graphène monocouche peut ainsi être utilisé pour générer une couche de support invisible pour l’imagerie d’échantillons biologiques. Le graphène monocouche est également plus résistant que le GO et peut être appliqué en tant que monocouche unique sur une grille EM, et les progrès récents dans la fabrication de grilles EM recouvertes de graphène ont permis de préparer des grilles de graphène monocouche à haute couverture en interne 24,25,26,27,28,29,30 . Cependant, malgré les avantages de l’utilisation de grilles recouvertes de graphène pour la détermination de la structure cryoEM, elles ne sont pas largement utilisées en raison du coût prohibitif des options commerciales et de la complexité de la production interne. Nous décrivons ici un guide étape par étape pour produire efficacement des grilles EM recouvertes d’une monocouche de graphène pour la détermination de la structure cryoEM d’échantillons biologiques (Figure 1). En suivant ce protocole détaillé, les chercheurs de cryoEM peuvent préparer de manière reproductible des dizaines de grilles de support en graphène de haute qualité en une seule journée. La qualité des grilles recouvertes de graphène peut être facilement examinée à l’aide d’un microscope électronique à transmission (MET) bas de gamme équipé d’un filament LaB6.

<table><tbody><tr><td>70 % EtOH</td><td>Pharmco (190 pf EtOH)</td><td>241000190CSGL</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501-4L</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium (APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215589-500g</td><td>Dangereux ; soyez extrêmement prudent</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>Serrage TEM Bloc porte-grille pour 45 grilles</td><td>PELCO</td><td>16830-45</td><td></td></tr><tr><td>Ventilateur d’ordinateur</td><td>Amazon (Noctua)</td><td>B07CG2PGY6</td><td></td></tr><tr><td>Housse</td><td>Bellco Glass</td><td>1203J71</td><td>Housse standard Plat</td></tr><tr><td>de cristallisation</td><td>Pyrex</td><td>3140-100</td><td></td></tr><tr><td>Plumeau électronique</td><td>Falcon Safety Products</td><td>75-37-6</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Dust-off Air Duster</td><td>Agrafes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Papiers filtres</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler à pointe fine</td><td>Dumont</td><td>0508-L4-PO</td><td></td></tr><tr><td>Flacon</td><td>Pyrex</td><td>4980-500</td><td></td></tr><tr><td>Fourchette</td><td>Supermarché</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pipette en verre pasteur</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Graphene/Cu</td><td>Graphenea</td><td>N/A</td><td>CVD monocouche graphène cu</td></tr><tr><td>Grid Coating Trough</td><td>Ladd Research Industries</td><td>10840</td><td></td></tr><tr><td>Fragile Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Kapton Tape</td><td>Amazon (MYJOR)</td><td>MY-RZY001</td><td>Ruban polyimide</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Long twzeer</td><td>Cole Parmer Essentials</td><td>UX-07387-15</td><td></td></tr><tr><td>Support de grille en métal</td><td>Ted Pella</td><td>16820-81</td><td></td></tr><tr><td>MMA(8.5)MMA EL 6</td><td>KAYAKU Advanced Materials</td><td>M31006 0500L 1GL</td><td>Inflammable</td></tr><tr><td>Modèle 10 Four de laboratoire</td><td>Quincy Lab, Inc.</td><td></td><td></td>FO19013</tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Pyrex</td><td>3610-102</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma (Solarus 950)</td><td>Gatan, Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Fiskars</td><td>194813-1010</td><td></td></tr><tr><td>Standard Analog Orbital Shaker</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300</td><td>Quantifoil</td><td>N/A</td><td>Holey gold grids</td></tr><tr><td>Ultraviolet Ozone Cleaning Systems</td><td>UVOCS</td><td>modèle T10X10/OES</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication de grilles monocouches recouvertes de graphène pour la cryomicroscopie électronique

Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy

La microscopie électronique cryogénique (cryoEM) est apparue comme une technique puissante pour sonder la structure atomique des complexes macromoléculaires. La préparation des échantillons pour la cryoEM nécessite la conservation des échantillons dans une fine couche de glace vitreuse, généralement suspendue dans les trous d’un film de support fenêtré. Cependant, toutes les approches de préparation d’échantillons couramment utilisées pour les études cryoEM exposent l’échantillon à l’interface air-eau, introduisant un fort effet hydrophobe sur l’échantillon qui entraîne souvent une dénaturation, une agrégation et une dissociation complexe. De plus, les interactions hydrophobes privilégiées entre les régions de l’échantillon et l’interface air-eau ont un impact sur les orientations adoptées par les macromolécules, ce qui donne lieu à des reconstructions 3D avec une résolution directionnelle anisotrope. 
Il a été démontré que l’adsorption d’échantillons cryoEM sur une monocouche de graphène aide à atténuer les interactions avec l’interface air-eau tout en minimisant l’introduction de bruit de fond. Les supports en graphène offrent également l’avantage de réduire considérablement la concentration requise de protéines requises pour l’imagerie cryoEM. Malgré les avantages de ces supports, les grilles revêtues de graphène ne sont pas largement utilisées par la communauté cryoEM en raison du coût prohibitif des options commerciales et des défis associés à la production interne à grande échelle. Cet article décrit une méthode efficace pour préparer des lots de grilles cryoEM qui ont une couverture presque complète de graphène monocouche.

L’exécution réussie du protocole de fabrication de grilles de graphène décrit ici se traduira par des grilles EM entièrement recouvertes d’une seule monocouche de graphène. La couverture en graphène des grilles peut être vérifiée à l’aide de n’importe quel MET. Étant donné qu’une monocouche de graphène propre est presque invisible dans le MET, il faut l’examiner en utilisant le mode de diffraction du microscope et observer les taches de Bragg correspondant à l’organisation hexagonale des atomes de carbone qui composent le graphène (Figure 3A). Il est normal d’observer occasionnellement des plis de graphène monocouche, qui sont introduits lors du revêtement MMA (Figure 3B). On peut également vérifier le niveau de contamination présent sur le graphène en acquérant une image à fort grossissement au centre de l’un des trous recouverts de graphène (Figure 3C). Si elle est acquise avec un détecteur à haute résolution, une transformée de Fourier de cette image devrait contenir des taches de Bragg correspondant à un espacement carbone-carbone à 2,14 Å (Figure 4C). Une monocouche d’atomes de carbone ne produit pas une diffusion d’électrons suffisante pour générer un contraste de phase, et donc une image de graphène propre ne présentera pas d’anneaux de Thon associés à la fonction de transfert de contraste dans une transformée de Fourier de l’image. Cependant, il est très difficile d’empêcher la contamination des grilles de graphène après leur production, et un lavage insuffisant des grilles EM ou l’élimination du MMA après le revêtement de graphène entraînera des contaminants notables sur les grilles qui sont visibles dans les images de l’espace réel (Figure 3C). Comme le montre la figure 4, les grilles de graphène ont un effet de concentration sur un échantillon, comme on l’observe lorsque l’on compare 0,5 mg/mL d’apoferritine appliqué à des grilles d’or trouées avec (figure 4A) et sans le support de graphène (figure 4B). Des protocoles similaires de fabrication de graphène ont déjà été décrits pour résoudre les structures cryoEM de protéines telles que l’apoferritine à haute résolution25,27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma de préparation des grilles cryoEM recouvertes de graphène. Les étapes clés du processus de fabrication d’une grille de graphène sont illustrées. Abréviations : cryoEM = microscopie électronique cryogénique ; MMA = méthacrylate de méthyle ; APS = persulfate d’ammonium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig02.jpg"> Figure 2 : Matériaux requis pour la fabrication de grilles en graphène. (A) Les matériaux nécessaires au revêtement des grilles cryo-EM sont étiquetés en conséquence. (B) Vue rapprochée de l’enduiseur avec une feuille de graphène/Cu collée sur un papier buvard sur une lame de verre. L’enrobeuse par centrifugation peut être assemblée en achetant des pièces dans un magasin d’informatique ou de quincaillerie local. (C) Vue rapprochée de l’auge de revêtement de la grille fixée à une seringue qui peut être utilisée pour contrôler le niveau d’eau. Les grilles sont placées au-dessus d’un papier buvard sur un treillis en acier inoxydable. Le papier buvard aide à manœuvrer l’emplacement des grilles afin que la feuille de graphène puisse y être adaptée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig03.jpg"> Figure 3 : Image représentative d’un motif de diffraction et images en fond clair d’une grille de graphène montrant des rides ou une contamination par le MMA. (A) Les grilles EM recouvertes d’une monocouche de graphène montreront des pics de Bragg correspondant au réseau hexagonal du graphène lorsqu’elles sont imagées dans un MET en mode diffraction. Le pic de Bragg correspondant à l’espacement carbone-carbone de 2,14 Å est encerclé et indiqué par une flèche. (B) Une image en fond clair d’une grille de graphène monocouche avec quelques rides (indiquées par une flèche) dans la monocouche de graphène. (C) Une image en fond clair de graphène monocouche contaminé par le MMA (indiqué par une flèche). Barres d’échelle = 100 nm (B,C). Abréviations : EM = microscopie électronique ; MMA = méthacrylate de méthyle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig04.jpg"> Figure 4 : Apoferritine sur des grilles d’or recouvertes de graphène : (A) Micrographie CryoEM de 0,5 mg/mL d’apoferritine sur des grilles d’or recouvertes de graphène. (B) L’apoferritine imagée à la même concentration est visible à une concentration nettement plus faible lorsqu’elle est préparée à l’aide de grilles d’or trouées sans graphène. (C) FFT de la micrographie cryoEM de 0,5 mg/mL d’apoferritine sur des grilles d’or recouvertes de graphène, les pics de Bragg correspondant au réseau hexagonal de graphène indiqué. Barres d’échelle = 100 nm (A,B). Abréviations : cryoEM = microscopie électronique cryogénique ; FFT = transformée de Fourier rapide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ici, nous décrivons un protocole pour l’application d’une seule monocouche de graphène sur des grilles de microscopie électronique et comment les préparer pour une utilisation dans la détermination de la structure cryoEM.

Fabrication de grilles monocouches recouvertes de graphène pour la cryomicroscopie électronique

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has emerged as a powerful technique for probing the atomic structure of macromolecular complexes. Sample ...

À l’heure actuelle, la conservation optimale des échantillons biologiques est un défi majeur dans l’obtention de structures CryoEM à haute résolution. Au cours du processus de préparation des échantillons, les échantillons sont exposés à une interface air-eau hydrophobe, ce qui a des effets dénaturants sur les échantillons et peut amener les échantillons stables à adopter une orientation préférentielle dans la glace, ce qui empêche la détermination de la structure à haute résolution. Le revêtement des grilles CryoEM avec une fine couche de carbone d’oxyde de graphène mou a été couramment utilisé pour résoudre les problèmes liés aux interactions avec l’interface air-eau.Cependant, ces couches augmentent souvent le bruit de fond dans nos images, ce qui compromet les résolutions de notre structure. Le revêtement de la grille avec une monocouche de graphène permet d’obtenir une protection similaire sans introduire de bruit de fond important. L’utilisation de grilles CryoEM recouvertes de graphène peut aider à surmonter les problèmes liés aux interactions avec l’interface air-eau, cependant, les grilles de graphène commerciales sont coûteuses et de nombreux laboratoires considèrent que les grilles de graphène sont trop compliquées à préparer en interne.Les chercheurs dans le domaine de la cryoEM peuvent désormais utiliser ce protocole étape par étape pour reproduire des dizaines de graphènes de haute qualité entièrement produits en une journée.

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L’application de couches de support aux grilles de microscopie électronique cryogénique (cryoEM) permet d’augmenter la densité des particules, de limiter les interactions avec l’interface air-eau, de réduire les mouvements induits par les faisceaux et d’améliorer la distribution des orientations des particules. Cet article décrit un protocole robuste pour le revêtement des grilles cryoEM avec une monocouche de graphène afin d’améliorer la préparation des échantillons cryogéniques.

Application du graphène monocouche aux grilles de cryo-microscopie électronique pour la détermination de la structure à haute résolution

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