Name: Analyse immunohistochimique multiplex du paysage cellulaire immunitaire spatial du microenvironnement tumoral (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Découvrez l'immunohistochimie multiplex pour caractériser les cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral. Cette méthode permet de visualiser plusieurs marqueurs simultanément et d'analyser la distribution spatiale des cellules immunitaires.

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Le PhenoImager HT a été acheté grâce à un financement fourni par le Centre médical de l’Université Radboud et le Centre technologique Radboud pour la microscopie. La mucoviscidose est soutenue financièrement par une bourse de la Société néerlandaise du cancer (10673) et une bourse ERC Adv ARTimmune (834618). JT est soutenu financièrement par une subvention de NWO Vidi (VI.Vidi.192.084). Les auteurs tiennent à remercier Eric van Dinther et Ankur Ankan pour leur aide dans la création de flux de travail pour stocker des données IHC multiplexes et Bengt Phung est remercié pour ses instructions sur la façon d’implémenter des données IHC multiplex dans QuPath pour le dessin du retour sur investissement.

Cartographie du paysage immunitaire tumoral : un protocole d’analyse IHC multiplex approfondi

<ol><li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+from+immunosurveillance+to+tumor+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape.</a> Nature Immunology. 3 (11), 991-998 (2002).</li>
<li>van der Woude, L. L., Gorris, M. A. J., Halilovic, A., Figdor, C. G., de Vries, I. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+into+the+tumor%3A+a+roadmap+for+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrating into the tumor: a roadmap for T cells.</a> Trends in Cancer. 3 (11), 797-808 (2017).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Fridman, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+of+human+tumors%3A+general+significance+and+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenvironment%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment of human tumors: general significance and clinical impact.</a> Cancer Microenvironment. 6 (2), 117-122 (2013).</li>
<li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer%3A+a+prognostic+and+accuracy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li>
<li>Angell, H. K., Bruni, D., Barrett, J. C., Herbst, R., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immunoscore%3A+colon+cancer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The Immunoscore: colon cancer and beyond.</a> Clinical Cancer Research. 26 (2), 332-339 (2020).</li>
<li>Angell, H., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+immune+contexture+to+the+Immunoscore%3A+the+role+of+prognostic+and+predictive+immune+markers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">From the immune contexture to the Immunoscore: the role of prognostic and predictive immune markers in cancer.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+classification+using+the+Immunoscore%3A+a+worldwide+task+force%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer classification using the Immunoscore: a worldwide task force.</a> Journal of Translational Medicine. 10, 205(2012).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World-wide+Immunoscore+Task+Force%3A+meeting+report+from+the+34%3BMelanoma+Bridge%26%2334%2C+Napoli%2C+November+30th-December+3rd%2C+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">World-wide Immunoscore Task Force: meeting report from the 34;Melanoma Bridge&#34, Napoli, November 30th-December 3rd, 2016.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 212(2017).</li>
<li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li>
<li>Creemers, J. H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tipping+point+in+cancer-immune+dynamics+leads+to+divergent+immunotherapy+responses+and+hampers+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A tipping point in cancer-immune dynamics leads to divergent immunotherapy responses and hampers biomarker discovery.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002032(2021).</li>
<li>Blank, C. U., Haanen, J. B., Ribas, A., Schumacher, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CANCER+IMMUNOLOGY.+The+%26%2334%3Bcancer+immunogram%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CANCER IMMUNOLOGY. The &#34;cancer immunogram&#34;.</a> Science. 352 (6286), 658-660 (2016).</li>
<li>Teruya-Feldstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunohistochemistry+laboratory+looking+at+molecules+and+preparing+for+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The immunohistochemistry laboratory looking at molecules and preparing for tomorrow.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (11), 1659-1665 (2010).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+tissue+antigens+and+antibodies+get+along%3A+revisiting+the+technical+aspects+of+immunohistochemistry--the+red%2C+brown%2C+and+blue+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Parra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+platforms+of+multiplexed+immunofluorescence+for+study+of+paraffin+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Treatment+and+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Novel platforms of multiplexed immunofluorescence for study of paraffin tumor tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight-color+multiplex+immunohistochemistry+for+simultaneous+detection+of+multiple+immune+checkpoint+molecules+within+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li>
<li>Roelofsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+regression+of+ovarian+carcinoma+after+septic+peritonitis%3B+a+unique+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous regression of ovarian carcinoma after septic peritonitis; a unique case report.</a> Frontiers in Oncology. 8, 562(2018).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+delivery+of+therapeutic+mRNA+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated delivery of therapeutic mRNA in ovarian cancer.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 141, 180-190 (2019).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-binding+DARPins+for+targeted+photodynamic+therapy+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">EpCAM-binding DARPins for targeted photodynamic therapy of ovarian cancer.</a> Cancers. 12 (7), 1762(2020).</li>
<li>Di Blasio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumour+microenvironment+shapes+dendritic+cell+plasticity+in+a+human+organotypic+melanoma+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The tumour microenvironment shapes dendritic cell plasticity in a human organotypic melanoma culture.</a> Nature Communications. 11 (1), 2749(2020).</li>
<li>van Beek, J. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pDCs+are+superior+to+cDC2s+in+attracting+cytolytic+lymphocytes+in+melanoma+patients+receiving+DC+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human pDCs are superior to cDC2s in attracting cytolytic lymphocytes in melanoma patients receiving DC vaccination.</a> Cell Reports. 30 (4), 1027-1038 (2020).</li>
<li>Rodriguez-Rosales, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+aged+neutrophils+are+augmented+in+blood+and+skin+of+psoriasis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory aged neutrophils are augmented in blood and skin of psoriasis patients.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 1030-1040 (2021).</li>
<li>Hoeijmakers, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+composition+in+the+endometrium+of+patients+with+a+complete+molar+pregnancy%3A+Effects+on+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immune cell composition in the endometrium of patients with a complete molar pregnancy: Effects on outcome.</a> Gynecologic Oncology. 160 (2), 450-456 (2021).</li>
<li>van Ravensteijn, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+genomic+analysis+reveals+clinically+relevant+distinctions+between+angiosarcoma+subgroups%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Immunological and genomic analysis reveals clinically relevant distinctions between angiosarcoma subgroups.</a> Cancers. 14 (23), 5938(2022).</li>
<li>van der Woude, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+shows+an+immunological+abscopal+effect+in+patients+with+NSCLC+treated+with+pembrolizumab-radiotherapy+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment shows an immunological abscopal effect in patients with NSCLC treated with pembrolizumab-radiotherapy combination.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (10), e005248(2022).</li>
<li>Graham Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+landscape+shows+treatment-specific+differences+in+rectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment landscape shows treatment-specific differences in rectal cancer patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 1011498(2022).</li>
<li>Cortenbach, K. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+immune+cell+infiltration+in+different+stages+of+coronary+atherosclerosis+revealed+by+multiplex+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology.+Heart+%26+Vasculature%22%5BJournal%5D)">Topography of immune cell infiltration in different stages of coronary atherosclerosis revealed by multiplex immunohistochemistry.</a> International Journal of Cardiology. Heart & Vasculature. 44, 101111(2023).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+repair+deficient+prostate+cancer+represents+an+immunologically+distinct+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination repair deficient prostate cancer represents an immunologically distinct subtype.</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2094133(2022).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+primary+and+metastatic+lesions+of+patients+with+ipilimumab-treated+melanoma%3A+high+variation+in+lymphocyte+infiltration+and+HLA-ABC+expression+whereas+tumor+mutational+load+is+similar+and+correlates+with+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paired primary and metastatic lesions of patients with ipilimumab-treated melanoma: high variation in lymphocyte infiltration and HLA-ABC expression whereas tumor mutational load is similar and correlates with clinical outcome.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (5), e004329(2022).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+T+cell+depletion+following+neoadjuvant+chemotherapy+in+patients+with+muscle-invasive+bladder+cancer+is+associated+with+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Intratumoral T cell depletion following neoadjuvant chemotherapy in patients with muscle-invasive bladder cancer is associated with poor clinical outcome.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 72 (1), 137-149 (2023).</li>
<li>Sultan, S., Gorris, M. A. J., Buytenhuijs, F., Lvan de Woude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Segmentation-free+machine+learning+architecture+for+immune+land-scape+phenotyping+in+solid+tumors+by+multichannel+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A Segmentation-free machine learning architecture for immune land-scape phenotyping in solid tumors by multichannel imaging.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-profiling+and+cellular+spatial+analysis+using+five+immune+oncology+multiplex+immunofluorescence+panels+for+paraffin+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8511(2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Sun, Z., Nyberg, R., Wu, Y., Bernard, B., Redmond, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+an+enhanced+7-color+multiplex+IHC+protocol+to+dissect+immune+infiltration+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing an enhanced 7-color multiplex IHC protocol to dissect immune infiltration in human cancers.</a> PLoS One. 16 (2), e0247238(2021).</li>
<li>LeicaBiosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BOND+RX+Fully+Automated+Research+Stainer+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">BOND RX Fully Automated Research Stainer Protocols.</a> , https://www.leicabiosystems.com/en-nl/ihc-ish/ihc-ish-instruments/bond-rx/ (2022).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

L’analyse spatiale de l’EUT est une technique recherchée pour en savoir plus sur le compartiment cellulaire immunitaire et découvrir de nouveaux biomarqueurs pronostiques et prédictifs, notamment dans le domaine de l’immuno-oncologie16. De nombreuses techniques différentes sont en cours de développement à cet effet, impliquant la détection de protéines, de transcrits d’ARNm ou d’une combinaison des deux, avec des estimations allant jusqu’à 100 à 1 000 cibles. Cependant, un multiplexage plus élevé se fait au prix d’une réduction du nombre d’expériences à haut débit, de coûts expérimentaux plus élevés et de défis techniques, et souvent, seule une petite partie du TME peut être analysée. L’IHC multiplexe utilisant la méthode basée sur la TSA que nous décrivons ici, détecte simultanément six marqueurs différents + DAPI, est relativement moins coûteux à réaliser et des coupes de tissus entiers sont imagées en moins de 20 minutes, prêtes à être entièrement analysées. Cette technique est devenue moins complexe avec l’automatisation de la procédure de coloration. Les améliorations apportées au microscope multispectral, qui comprennent l’ajout de deux filtres supplémentaires, ont considérablement amélioré les temps de démélange et de balayage spectrals. Il est possible de détecter jusqu’à huit marqueurs différents + DAPI simultanément. Cependant, en étendant le multiplexage avec plus de marqueurs, les avantages susmentionnés disparaissent à mesure que le démixage spectral devient plus difficile et que les temps de balayage de lames entières augmentent considérablement. Des efforts sont entrepris pour normaliser les CSI multiplexes entre les différents établissements afin de faciliter la mise en œuvre dans le cadre du diagnostic. Pour cette standardisation de l’IHC multiplex, nous conseillons aux utilisateurs d’adhérer au protocole plus accessible avec six marqueurs différents + DAPI. Néanmoins, un certain savoir-faire technique est encore nécessaire et l’analyse en aval peut être difficile, pour laquelle nous avons développé des méthodologies qui sont décrites dans ce protocole.
La normalisation commence par le développement de panels IHC multiplex. L’importance du choix des anticorps primaires détectant des cibles protéiques particulières a été soulignée avant17. Nos panels IHC multiplex sont principalement développés avec des clones d’anticorps primaires qui sont également utilisés et validés pour l’IHC dans notre service de diagnostic. Cependant, dans le cas du panel IHC multiplexe de cellules dendritiques, la plupart des anticorps n’ont pas été utilisés dans le cadre du diagnostic (van der Hoorn et al., manuscrit en cours de soumission). Pour garantir la spécificité et minimiser les différences de lot, nous avons choisi d’utiliser des anticorps monoclonaux plutôt que des anticorps polyclonaux et avons également validé la plupart des anticorps en utilisant des lignées cellulaires transfectées et des cellules primaires. Au fil des ans, différentes versions de panels IHC multiplexes ont été utilisées dans de nombreuses études utilisant le système Vectra 3 18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Pour mettre en œuvre ces panels IHC multiplex de manière optimale sur le système PhenoImager HT, certains ajustements ont dû être effectués dans les combinaisons d’anticorps primaires et de fluorophores. Pour bénéficier d’un meilleur démélange spectral et de temps de balayage plus rapides de coupes de tissus entiers, il est nécessaire de mettre en œuvre les derniers fluorophores Opal480 et Opal780 et d’éviter l’utilisation de fluorophores Opal540 et Opal650 dans des panels IHC multiplexes à sept couleurs. Les temps de balayage sont ~3 à 10 fois plus rapides selon la taille de la section de tissu. Les ajustements de panel IHC multiplex ont été assez faciles à réaliser, mais certaines considérations doivent être gardées à l’esprit. Le spectre fluorescent de l’Opal480 chevauche beaucoup le spectre de l’autofluorescence et, par conséquent, interfère avec le démélange spectral des érythrocytes et d’autres structures autofluorescentes. L’utilisation d’une concentration accrue de l’anticorps primaire associé à Opal480 a résolu ce problème dans la plupart des cas. La mise en œuvre du filtre propriétaire Sample AF sur le PhenoImager HT facilite le démélange de l’Opal480 et de l’autofluorescence. Cependant, il est préférable d’utiliser un anticorps primaire qui donne un signal clair lorsqu’il est utilisé avec Opal480 afin que son signal soit supérieur à l’autofluorescence.
Même si ces panels IHC multiplex sont établis, la variation d’un lot à l’autre est quelque chose qui doit être pris en compte. En effectuant des contrôles IHC monoplexes avant de commencer l’expérience IHC multiplex complète, nous avons parfois observé que les anticorps primaires se comportent plus ou moins bien d’une expérience à l’autre. Les raisons peuvent être des erreurs de pipetage, des conditions de stockage des réactifs non optimales et une durée de conservation. Nous avons résolu ce problème en ajustant la solution d’anticorps primaires sur la base de notre expérience. Même lorsqu’aucun des ajustements susmentionnés n’a dû être effectué, pour chaque expérience de lot multiplex IHC, il est important de définir les temps d’exposition en fonction des lames de contrôle monoplex colorées à l’IHC.
Étant donné que notre recherche s’est initialement concentrée sur différents types de carcinomes et de mélanomes, les panels IHC multiplex devaient être interchangeables entre les types de tumeurs avec un minimum d’ajustements. Par conséquent, nous avons toujours inclus plusieurs types de tissus (tumoraux) dans le processus d’optimisation et observé que les dilutions des anticorps primaires pour les marqueurs de cellules immunitaires peuvent être maintenues similaires entre différents types de tumeurs. Cependant, la détection du tissu tumoral entre les carcinomes et le mélanome nécessite des marqueurs tumoraux différents. En conséquence, le marqueur tumoral a toujours été optimisé pour fonctionner à la fin de chaque panel IHC multiplex et est actuellement toujours utilisé en conjonction avec Opal780, qui, par coïncidence, doit également être au dernier fluorophore dans une procédure de coloration IHC multiplex. En utilisant le marqueur tumoral par conséquent à la fin de l’IHC multiplex, ces panels IHC multiplex peuvent être facilement échangés contre d’autres types de tumeurs, tels que le glioblastome (c’est-à-dire GFAP) et le lymphome hodgkinien (c’est-à-dire CD30). Pour l’angiosarcome, nous avons utilisé ce panel IHC multiplexe de lymphocytes avec le gène lié à la transformation de l’érythroblaste (ERG) comme marqueur tumoral avec seulement deux expériences d’optimisation25. L’optimisation comprenait le titrage de l’anticorps primaire ERG et le test du panel IHC multiplex avec ERG à la fin.
D’autres ajustements à ces panels IHC multiplex peuvent également être effectués en échangeant un certain marqueur de cellules immunitaires contre un autre marqueur immunitaire ou fonctionnel. Chaque changement nécessite une optimisation. Le protocole d’optimisation pourrait être suivi comme décrit précédemment17. Certaines modifications apportées aux panneaux multiplexes IHC proposés interféreront avec les algorithmes ImmuNet que nous avons créés. Il faut générer suffisamment de données et consacrer du temps à la mise en œuvre de ces modifications dans l’algorithme (au moins 750 annotations pour chaque nouveau marqueur et/ou phénotype cellulaire, et 150 annotations pour la validation des marqueurs précédemment formés). Les panels présentés ici ne contiennent pas de marqueurs fonctionnels, bien que l’implémentation de marqueurs de point de contrôle immunitaire tels que-1 et-L1 dans des panels IHC multiplex soit réalisée dans notre laboratoire. Cependant, l’analyse de marqueurs moins binaires dans les signaux négatifs et positifs s’est avérée plus difficile et constitue un domaine de recherche actif dans notre groupe.
Le nombre de marqueurs pouvant être évalués simultanément avec l’IHC multiplex est limité par rapport à d’autres nouvelles techniques. Bien que cela puisse être contourné en analysant différents panneaux sur des tranches consécutives d’un bloc FFPE, il sera difficile de comparer ces tranches spatialement. L’orientation et les artefacts pliés ne sont probablement pas les mêmes après la préparation des diapositives. Néanmoins, l’IHC multiplex est assez accessible, ce qui en fait un outil attrayant pour davantage d’institutions et de chercheurs et donc, plus adapté à une mise en œuvre future dans un cadre de diagnostic. Avec la normalisation des panels de cellules immunitaires IHC multiplex pour plusieurs types de tumeurs et les pipelines d’analyse en aval, davantage de connaissances pourraient être acquises sur les différences de TME entre les patients et les types de tumeurs. Cela peut, par exemple, conduire à plus de connaissances sur le rôle de l’EUT dans la réponse antitumorale à des traitements spécifiques. Cela pourrait même donner naissance à de nouveaux biomarqueurs pour prédire des facteurs tels que la réponse au traitement et la survie attendue. Dans l’ensemble, cela peut permettre à l’IHC multiplex de devenir un outil clinique d’aide à la prise de décision clinique, dans une approche de médecine personnalisée. Certes, davantage d’étapes de la procédure d’analyse devraient probablement être automatisées et standardisées pour qu’elle puisse être utilisée dans un cadre de diagnostic quotidien, de sorte qu’il s’agit pour l’instant d’une perspective principalement futuriste.
L’analyse de plusieurs marqueurs sur une seule lame d’échantillon peut être un outil très puissant malgré ses défis techniques. Avec des protocoles expérimentaux standardisés et une méthode d’analyse robuste, comme nous l’avons décrit ici à l’aide d’ImmuNet, la quantification de plusieurs marqueurs la rend plus informative que l’IHC classique, tandis que l’IHC multiplex reste relativement à haut débit par rapport aux nouvelles méthodes expérimentales à haut plex.

Les cellules immunitaires jouent un rôle crucial dans la protection contre les agents pathogènes tels que les virus et les bactéries, mais aussi contre les cellules cancéreuses1. Par conséquent, le système immunitaire au sein du microenvironnement tumoral (TME) est très prometteur pour la découverte de biomarqueurs pronostiques et prédictifs2. Les infiltrats des cellules immunitaires ont été corrélés au pronostic dans divers types de cancer, bien que cela n’ait pas encore été mis en œuvre dans les soins cliniques 3,4. Dans la plupart des types de tumeurs, un nombre élevé de lymphocytes T cytotoxiques et de lymphocytes T auxiliaires 1 et/ou un faible nombre de lymphocytes T régulateurs sont liés à de bons pronostics. Des efforts sont en cours pour intégrer ce qu’on appelle un « immunoscore » dans la stadification TNM du cancer colorectal, en la transformant en stadification TNM-I 5,6. L’immunoscore est dérivé du nombre total de lymphocytes T (détectés avec CD3) et de lymphocytes T cytotoxiques (détectés avec CD8) dans deux régions tumorales différentes : le noyau tumoral par rapport à la marge invasive (IM) des tumeurs. Il a également été proposé que l’immunoscore ait une valeur pronostique dans d’autres types de cancer, tels que le mélanome, le cancer du poumon et le cancer du sein 6,7,8,9. De plus, les infiltrats des cellules immunitaires peuvent également être corrélés à la réponse à l’immunothérapie par blocage de point de contrôle10. Cependant, ces biomarqueurs prédictifs doivent être validés dans des études prospectives avant de pouvoir être systématiquement mis en œuvre dans la pratique clinique. De plus, il a également été proposé qu’un seul biomarqueur soit insuffisant pour une prédiction significative11. Par conséquent, la création d’une carte complète d’un échantillon de patient en combinant différents biomarqueurs a été proposée comme un biomarqueur prédictif plus complet dans ce que l’on appelle « l’immunogramme du cancer »12.
Parmi les méthodes d’étude des cellules immunitaires au sein de l’EUT, la technique la plus ancienne et la plus connue est l’immunohistochimie (IHC), couramment utilisée pour les tests de diagnostic dans plusieurs maladies, en particulier le cancer13. Cette technique a longtemps été limitée à l’utilisation d’un ou de quelques marqueurs14 et a donc été supplantée dans le cadre de la recherche par d’autres techniques telles que la cytométrie en flux et le profilage d’expression génique (GEP). Cependant, les tissus tumoraux fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) généralement utilisés dans les diagnostics et la recherche de routine ne sont pas (de manière optimale) adaptés à la cytométrie en flux et à la GEP. De plus, bien que la GEP et la cytométrie en flux fournissent beaucoup d’informations sur le phénotype et la fonction cellulaires, le manque d’informations spatiales est un inconvénient majeur. Par conséquent, l’hétérogénéité au sein d’un échantillon, telle que les différences entre les zones infiltrées par les cellules immunitaires et les zones exclues des cellules immunitaires d’une tumeur, pourrait passer inaperçue15. De nouvelles plateformes ont été développées pour l’analyse multiplex des tissus FFPE, telles que l’IHC multiplex, la cytométrie de masse par imagerie et la détection de CO par indEXing (CODEX) qui peuvent être utilisées pour détecter plusieurs marqueurs simultanément dans une section de tissu16. Les cellules immunitaires de l’EUT font l’objet d’études approfondies afin de trouver les meilleurs biomarqueurs pour l’immunothérapie. Cependant, les techniques de multiplexage et l’analyse automatisée des images posent leurs propres obstacles.
Notre laboratoire possède une vaste expérience de la coloration IHC multiplex à l’aide de la méthode d’amplification du signal Opal/Tyramide (TSA) et l’a automatisée sur une plate-forme IHC (voir le tableau des matériaux)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31. Nous avons optimisé les panels de cellules immunitaires pour la détection de différents sous-ensembles de lymphocytes, de cellules myéloïdes et de cellules dendritiques (DC). Les tissus qui contiennent des zones de cellules immunitaires denses - pour les lymphocytes ou les morphologies cellulaires complexes (c’est-à-dire les cellules myéloïdes et les DC) - sont particulièrement difficiles à analyser, avec un risque de sur- ou de sous-estimer le nombre de cellules immunitaires présentes. Pour pallier à ce problème, le logiciel d’analyse ImmuNet a été développé par notre groupe32, et ce pipeline d’apprentissage automatique a considérablement amélioré la qualité de la détection de ces différents types de cellules immunitaires. Un protocole détaillé allant de l’obtention du matériel FFPE à l’analyse des densités de cellules immunitaires dans différents compartiments tissulaires et des distances entre les types de cellules immunitaires est décrit ici.
Ce protocole décrit la manière dont les panels IHC multiplexes sont réalisés au Centre médical de l’Université Radboud depuis la mise en œuvre de l’imageur numérique de pathologie en 2022. Les panels IHC multiplexes décrits peuvent être utilisés pour différents carcinomes (par exemple, poumon, prostate, colorectal, vessie, sein) avec l’utilisation d’un anticorps pan-cytokératine comme marqueur tumoral ou pour le mélanome avec l’utilisation d’anticorps associés aux mélanocytes comme marqueurs tumoraux. Ces protocoles IHC multiplex ont été soigneusement optimisés en termes de concentration d’anticorps primaires, de combinaisons de fluorophores et de séquence de la procédure de coloration. Nous et d’autres avons décrit l’optimisation du panel IHC multiplex plus tôt 17,33,34,35. Les panneaux IHC multiplex peuvent être adaptés, mais les pipelines d’analyse décrits doivent être évalués et éventuellement ajustés ou réentraînés en conséquence. Les protocoles IHC multiplexes à sept couleurs décrits utilisent les fluorophores Opal Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780 et 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), de sorte qu’un démélange facile et un balayage rapide sur l’imageur sont activés avec l’immunofluorescence multispectrale à une touche (MOTiF). La coloration et le balayage en neuf couleurs ne sont pas décrits dans ce protocole car cela nécessite encore plus de réglage précis de la configuration expérimentale et un autre mode de balayage sur l’imageur qui utilise le filtre accordable à cristaux liquides.

<table><tbody><tr><td>Marque cellulaire anti-CD14</td><td>&nbsp ;</td><td>114R-16</td><td>section 3, clone EPR3653</td></tr><tr><td>marque cellulaire</td> <td>anti-CD163</td><td>163M-15</td><td>section 3, clone MRQ-26</td></tr><tr><td>anti-CD19</td><td>Abcam</td><td>ab134114</td><td>section 3, clone EPR5906</td></tr><tr><td>anti-CD1c (BDCA1)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TA505411</td><td>section 3, clone OTI2F4</td></tr><tr><td>anti-CD20</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-340-S</td><td>section 3, clone L26</td></tr><tr><td>anti-CD3</td><td>Thermo Scientific</td><td>RM-9107</td><td>section 3, clone sp7</td></tr><tr><td>anti-CD303/ </td><td>Dendritiques BDCA2 via Enzo Lifesciences/Axxora</td><td>DDX0043</td><td>section 3, clone 124B3.13</td></tr><tr><td>anti-CD56</td><td>Cell Marque&nbsp ;</td><td>156R-94</td><td>section 3, clone MRQ-42</td></tr><tr><td>anti-CD66b</td><td>BD Biosciences</td><td>555723</td><td>section 3, clone G10F5</td></tr><tr><td>anti-CD68</td><td>Dako Agilent</td><td>M087601</td><td>section 3, clone PG-M1</td></tr><tr><td>anti-CD8</td><td>Dako Agilent</td><td>M7103</td><td>section 3, clone C8/144B</td></tr><tr><td>anti-Foxp3</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-4777</td><td>section 3, clone 236A/E7</td></tr><tr><td>anti-Gp100</td><td>Dako Agilent</td><td>M063401</td><td>section 3, clone HMB45</td></tr><tr><td>anti-HLA-DR, DP, DQ</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53302</td><td>section 3, clone CR3/43</td></tr><tr><td>anti-MART-1</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-799</td><td>section 3, clone A103</td></tr><tr><td>anti-pancytokératine</td><td>Abcam</td><td>ab86734</td><td>section 3, clone AE1/AE3 + 5D3</td></tr><tr><td>anti-SOX10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>383R</td><td>section 3, clone EP268</td></tr><tr><td>anti-Tyrosinase</td><td>Sanbio</td><td>MONX10591</td><td>section 3, clonage T311</td></tr><tr><td>anti-XCR1</td><td>Cell Signaling Technologies via Biok&eacute ;</td><td>44665S</td><td>section 3, clone D2F8T</td></tr><tr><td>diluant d’anticorps</td><td>Akoya BioSciences</td><td>SKU&nbsp ; ARD1001EA</td><td>section 3, à partir de la diapositive Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 (peut également être remplacée en option par TBST avec 10 % de BSA)</td></tr><tr><td>Sonde d’aspiration Bond</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.0605</td><td>section 3</td></tr><tr><td>Sonde d’aspiration Bond Nettoyage Leica</td><td>Biosciences</td><td>CS9100</td><td>section 3</td></tr><tr><td>Solution de daffart Bond</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9222</td><td>section 3</td></tr><tr><td>Étiquette Bond Objectverre + peluches d’impression</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4564.A</td><td>section 3</td></tr><tr><td>Système de détection de recherche Bond 2</td><td>Leica Biosciences</td><td>DS9777</td><td>section 3</td></tr><tr><td>Bond RX autostainer&nbsp ;</td><td>Leica Biosciences-section</td><td></td> <td>3, plate-forme automatisée</td></tr><tr><td>Bond TM Epitope Retrieval 1 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9961</td><td>section 3</td></tr><tr><td>Bond TM Epitope Retrieval 2 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9640</td><td>section 3</td></tr><tr><td>Bond TM Wash Solution 10x - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9590</td><td>section 3</td></tr><tr><td>BOND Universal Covertile</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4611</td><td>section 3</td></tr><tr><td>Kit de titrage Bond(TM) Leica</td><td>Biosciences</td><td>OPT9049</td><td>section 3</td></tr><tr><td>Coverslip 24 x 32 mm #1 (0,13-0,16 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15717592</td><td>section 2</td></tr><tr><td>lamelle 24 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td>section 2</td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-20</td><td>section 3, chaque fois que les lames de monoplex doivent être vérifiées rapidement, pas pour une analyse officielle, alors le DAPI est coloré séparément pour de meilleurs résultats</td></tr><tr><td>Eosine</td><td></td><td></td><td>section 2, éthanol fait maison</td></tr><tr><td>99,5 %</td> <td>VWR</td><td>4099.9005</td><td>section 2</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-01</td><td>section 3&nbsp ;</td></tr><tr><td>haematoxyline-section</td><td></td><td></td> <td>2, pipeline maison de</td></tr> <tr><td></td><td>détection et de phénotypage des cellules immunitaires</td><td>ImmuNet</td><td></td></tr> <tr><td>logiciel inForm 2.4.10</td><td>Akoya BioSciences-section</td><td></td> <td>4 & 6</td></tr><tr><td>Pack de réactifs OPAL 480 Akoya</td><td>BioSciences</td><td>FP1500001KT</td><td>section 3</td></tr><tr><td>Pack de réactifs OPAL 520 Akoya</td><td>BioSciences</td><td>FP1487001KT</td><td>section 3</td></tr><tr><td>pack de réactifs OPAL 570</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1488001KT</td><td>section 3</td></tr><tr><td>pack de réactifs OPAL 620 Akoya</td><td>BioSciences</td><td>FP1495001KT</td><td>section 3</td></tr><tr><td>pack de réactifs OPAL 690 Akoya</td><td>BioSciences</td><td>FP1497001KT</td><td>section 3</td></tr><tr><td>pack de réactifs OPAL 780</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1501001KT</td><td>section 3</td></tr><tr><td>Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 diapositive</td><td>Akoya BioSciences</td><td>NEL821001KT</td><td>section 3</td></tr><tr><td>PhenoChart 1.1.0</td><td>Akoya BioSciences-section</td><td></td> <td>5</td></tr><tr><td>PhenoImagerHT</td><td>Akoya BioSciences</td><td>CLS143455</td><td>section 4, imageur de pathologie numérique avec visionneuse de diapositives et logiciel d’imagerie (anciennement connu sous le nom de Vectra Polaris)</td></tr><tr><td>Support de montage rapide</td><td>Klinipath</td><td>7280</td><td>section 2</td></tr><tr><td>QuPath 0.3.2</td><td></td><td></td><td>plate-forme logicielle d’analyse d’images de lames entières</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de diapositives</td><td>VWR</td><td>631-0737</td><td>section 1</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>Thermo Scientific via VWR</td><td>631-9483</td><td>section 1</td></tr><tr><td>Logiciel Vectra Polaris 1.0.13</td><td>Akoya BioSciences-section</td><td></td> <td>4</td></tr><tr><td>Xylène</td><td>VWR</td><td>4055-9005</td><td>Chapitre 2</td></tr></tbody></table>

analyse immunohistochimique multiplex du paysage cellulaire immunitaire spatial du microenvironnement tumoral

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

Le paysage cellulaire immunitaire du microenvironnement tumoral contient potentiellement des informations pour la découverte de biomarqueurs pronostiques et prédictifs. L’immunohistochimie multiplex est un outil précieux pour visualiser et identifier différents types de cellules immunitaires dans les tissus tumoraux tout en conservant ses informations spatiales. Nous fournissons ici des protocoles détaillés pour analyser les populations de cellules lymphocytaires, myéloïdes et dendritiques dans des coupes de tissus. De la découpe de sections fixées au formol et noyées en paraffine, des procédures de coloration multiplex automatique sur une plate-forme automatisée, du balayage des lames sur un microscope d’imagerie multispectrale, à l’analyse d’images à l’aide d’un algorithme d’apprentissage automatique développé en interne, ImmuNet. Ces protocoles peuvent être appliqués à une variété d’échantillons tumoraux en changeant simplement de marqueurs tumoraux pour analyser les cellules immunitaires dans différents compartiments de l’échantillon (tumeur ou marge invasive) et appliquer une analyse du voisin le plus proche. Cette analyse ne se limite pas aux échantillons tumoraux mais peut également être appliquée à d’autres tissus (non-)pathogènes. Les améliorations apportées à l’équipement et au flux de travail au cours des dernières années ont considérablement réduit les délais de traitement, ce qui facilite l’application future de cette procédure dans le cadre du diagnostic.

Ce protocole décrit en détail comment la caractérisation des cellules immunitaires du microenvironnement tumoral à l’aide de l’immunohistochimie multiplex est effectuée.

Analyse immunohistochimique multiplex du paysage cellulaire immunitaire spatial du microenvironnement tumoral

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...

Notre objectif est d’identifier la quantité, le type et l’emplacement des cellules immunitaires dans les microenvironnements tumoraux. Dans le domaine de l’immunochimie, il y a eu des progrès technologiques majeurs ces dernières années. Les progrès de la technologie d’immunochimie multiplex permettent d’étudier de manière fiable davantage de marqueurs.Les défis expérimentaux actuels consistent à visualiser des types spécifiques de cellules immunitaires dans des échantillons tumoraux, qui ont été surmontés en utilisant les méthodes d’immunochimie multiplexe. Cependant, l’analyse automatique précise de ces images reste un défi sur lequel nous travaillons. Les différences entre le paysage cellulaire immunitaire entre les tumeurs primaires et métastatiques soulèvent des questions telles que : quelles propriétés intrinsèques de la tumeur sont à l’origine de ces différences et que signifient ces différences pour les thérapies qui ciblent le système immunitaire ?En plus de nos travaux exploratoires, nous nous concentrerons également sur des questions cliniquement pertinentes telles que la façon dont le paysage cellulaire immunitaire de la tumeur est affecté par différents types de thérapies anticancéreuses et si le paysage cellulaire immunitaire pourrait prédire le résultat de la thérapie.

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Cette vidéo présente une technique d’imagerie multispectrale de fluorescence in situ pour analyser différentes sous-populations de lymphocytes T infiltrants dans le tissu tumoral. La cryosection tissulaire d’un carcinome rénal est traitée à l’aide d’anticorps afin de marquer les lymphocytes T CD8+ qui expriment des récepteurs inhibiteurs spécifiques et présentent un phénotype résistant à l’immunothérapie. La coupe marquée est visualisée à l’aide d’un microscope multispectral afin d’identifier...

Imagerie par immunofluorescence multiplexée pour analyser les sous-populations de lymphocytes T résistants à l’immunothérapie

Étudier le microenvironnement tumoral peut identifier des biomarqueurs pronostiques ou prédictifs de la réponse clinique à l’immunothérapie. Présentée ici, une méthode innovatrice repose sur in situ par fluorescence multispectrale d’imagerie permettant d’analyser et de compter automatiquement différentes sous-populations de CD8+ T des cellules. Cette technique fiable et reproductible est adaptée pour les analyses de cohorte importante.

Multiplexés Immunofluorescence analyse et Quantification d’intratumorale PD-1+ + Tim-3 CD8+ T Cells

Ici, nous décrivons une stratégie simple et accessible pour visualiser, quantifier, et cartographier les cellules immunitaires dans les sections formelles de tissu tumoral paraffin-intégré. Cette méthodologie combine les techniques d’imagerie et d’analyse numérique existantes dans le but d’élargir la capacité de multiplexage et l’analyse multiparameter des essais d’imagerie.

Visualisation, quantification et cartographie des populations de cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral

L’analyse d’images de codes à barres multiplexés a récemment amélioré la caractérisation du microenvironnement tumoral, permettant des études approfondies de la composition cellulaire, de l’état fonctionnel et des interactions cellule-cellule. Nous décrivons ici un protocole de coloration et d’imagerie utilisant le codage à barres d’anticorps conjugués oligonucléotidiques et l’imagerie cyclique, qui permet l’utilisation d’une technique d’analyse d’images de haute dimension.

Analyse d’images de codes à barres multiplexés pour l’immunoprofilage et la caractérisation de la cartographie spatiale dans l’analyse unicellulaire d’échantillons de tissus de paraffine

Dans cet article, un protocole d’immunofluorescence multiplex (mIF) manuelle d’amplification du signal tyramide (TSA) combiné à l’analyse d’images et à l’analyse spatiale est décrit. Ce protocole peut être utilisé avec des coupes de paraffine fixées au formol (FFPE) pour la coloration de deux à six antigènes par lame selon le scanner de lames disponible en laboratoire.

Immunofluorescence multiplex combinée à l’analyse d’images spatiales pour l’évaluation clinique et biologique du microenvironnement tumoral

L’immunohistochimie cyclique multiplex permet la détection in situ de plusieurs marqueurs simultanément en utilisant l’incubation répétée d’antigène-anticorps, le balayage d’images et l’alignement et l’intégration d’images. Nous présentons ici le protocole opératoire pour identifier les substrats des cellules immunitaires avec cette technologie dans des échantillons de cancer du poumon et de métastases cérébrales appariées.

Immunohistochimie par fluorescence cyclique multiplex

Nous avons adapté un insert de membrane microporeuse perméable pour imiter le microenvironnement tumoral (TME). Le modèle consiste en une culture cellulaire mixte, permet la génération simplifiée de populations cellulaires individuelles hautement enrichies sans utiliser le marquage fluorescent ou le tri cellulaire, et permet d’étudier la communication intercellulaire au sein du TME dans des conditions normales ou de stress.

A Mimic du microenvironnement de la tumeur: Une méthode simple pour générer des populations de cellules enrichies et enquête intercellulaire Communication

Ce protocole sert un régime pour la mise en place d’un système fonctionnel de Tet-ON dans les lignées cellulaires cancéreuses et leur utilisation ultérieure, en particulier pour étudier le rôle des protéines de culture cellulaire tumorale dans le recrutement des monocytes/macrophages pour le microenvironnement tumoral.

Knockdown conditionnel de l’Expression génique dans les lignées de cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des Monocytes/Macrophages pour le microenvironnement tumoral

La résonance paramagnétique électronique champ faible (bande L, 1,2 GHz) à l’aide des sondes nitroxyles et trityle solubles est démontrée pour l’évaluation des paramètres physiologiques importants dans le microenvironnement tumoral dans des modèles murins de cancer du sein.

In Vivo Évaluation des EPR du pH, pO2, statut Redox et les Concentrations de Phosphate et de glutathion dans le microenvironnement tumoral

Obtention de l’ADN génomique de haute qualité provenant de tissus de la tumeur est une première étape essentielle pour l’analyse des altérations génétiques à l’aide de séquençage de la génération suivant. Dans cet article, nous présentons une méthode simple et rapide pour enrichir les cellules tumorales et obtenir des ADN intact de toucher les échantillons de cytologie mentions légales.

Méthode simple et rapide d’obtenir qualité tumeur ADN provenant d’échantillons cliniques pathologiques à l’aide de la cytologie mentions légales contact

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Analyse immunohistochimique multiplex du paysage cellulaire immunitaire spatial du microenvironnement tumoral

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