Name: Biobanque de biopsies liquides aqueuses et vitrées humaines pour analyses moléculaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Découvrez la biobanque de biopsies liquides oculaires humaines pour analyses moléculaires. Ce protocole standardise la collecte de l'humeur aqueuse et du vitré pendant la chirurgie intraoculaire.

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VBM est soutenu par des subventions des NIH (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 et P30EY026877), le Stanford Center for Optic Disc Drusen et Research to Prevent Blindness, New York, États-Unis. JW et DR sont soutenus par la VitreoRetinal Surgery Foundation, États-Unis. DR est soutenu par la bourse DARE, parrainée par la Fondation Lundbeck.

Le protocole suit les directives de l’Institutional Review Board for Human Subjects Research (IRB) de l’Université de Stanford, aux États-Unis.
ATTENTION : Ce protocole est un guide pour les chirurgiens ophtalmologistes qualifiés. Dans le contexte des tumeurs malignes intraoculaires, l’ensemencement de tumeurs extraoculaires dans le cadre d’humeur aqueuse ou de biopsies liquides vitreuses ne peut être exclu. Cependant, le risque d’extension extraoculaire et d’atteinte orbitaire est extrêmement faible dans la biopsie transvitréenne de la tumeur choroïdienne, qui est effectuée de manière plus sûre et avec un examen attentif du site d’entrée6. Ce protocole ne couvre pas et peut être contre-indiqué en cas de rétinoblastome ou de tumeurs à haut risque métastatique.
1. Avant le prélèvement de l’échantillon
<ol><li>Approbation du comité d’examen institutionnel
	<ol><li>Obtenir les approbations de la CISR locale avant le début de l’expérience et effectuer le prélèvement d’échantillons en conséquence.</li>
	</ol></li>
	<li>Population à l’étude
	<ol><li>Critères d’inclusion : Inclure tous les patients (âgés de 0 à 99 ans) qui subissent une chirurgie intraoculaire à l’établissement qui fournira une quantité adéquate d’humeur aqueuse ou de liquide vitreux supérieure à celle requise pour les tests diagnostiques appropriés pour évaluer l’état du patient et les patients qui souhaitent participer.</li>
		<li>Critères d’exclusion : Exclure les patients qui refusent de participer et les femmes enceintes.</li>
	</ol></li>
</ol>
<ol start="3"><li>Consentement éclairé
	<ol><li>Obtenir le consentement éclairé écrit de chaque patient en suivant le protocole approuvé par la CISR.</li>
		<li>Archiver le consentement signé dans une base de données sécurisée.</li>
		<li>Former le personnel impliqué (chirurgiens, techniciens de laboratoire, personnel de salle d’opération, scientifiques) tel que décrit dans le présent protocole.</li>
		<li>Configurez un exemple de base de données de gestion. Utilisez REDCap comme exemple de base de données Web conforme à la loi HIPAA, conçue pour prendre en charge la capture de données pour les études de recherche5. Remarque : Cet article décrit l’utilisation de l’interface Web fournie par REDCap pour concevoir des formulaires, définir des champs, configurer une logique de branchement et appliquer des règles de validation de données sans avoir besoin de connaissances approfondies en programmation. Alternativement, d’autres logiciels, tels que les tableurs standard, peuvent également convenir.</li>
		<li>S’assurer de la disponibilité d’une boîte de refroidissement, de glace sèche, d’une seringue pour le prélèvement d’échantillons et de cryovials (voir le tableau des matériaux). Utilisez des cryovials avec des codes-barres gravés de façon permanente sur les flacons. Cela élimine la nécessité d’ajouter des identifiants de patient sur le flacon et la possibilité de perdre une étiquette dans des conditions de congélation.</li>
		<li>Avisez le chirurgien du cas et le technicien de laboratoire qui aidera au prélèvement de l’échantillon dans la salle d’opération au moins 24 heures avant la chirurgie prévue.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Acquisition d’échantillons chirurgicaux en salle d’opération
<ol><li>Interface de laboratoire mobile de salle d’opération (MORLI)
	<ol><li>Établissez un MORLI dans la salle d’opération. MORLI comprend une surface plane de laboratoire, un ordinateur/tablette avec un lecteur de codes-barres avec accès à la base de données REDCap et une boîte de refroidissement avec de la glace sèche (voir le tableau des matériaux). ATTENTION : La glace sèche est extrêmement froide. Portez toujours des gants lorsque vous manipulez de la glace sèche et évitez de la toucher.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation du prélèvement d’échantillons dans la salle d’opération
	<ol><li>Connectez-vous à l’ordinateur/tablette sur MORLI et ouvrez la base de données REDCap.</li>
		<li>Vérifiez que le consentement éclairé a été signé par le patient et confirmez-le avec le chirurgien. Rappelez-lui qu’un échantillon non dilué est nécessaire.</li>
		<li>Portez des gants. Procurez-vous le nombre approprié de cryoflacons à code-barres (0,5 mL pour l’humeur aqueuse et 1,9 mL pour les échantillons vitreux) et placez-les là où ils sont facilement accessibles.</li>
	</ol></li>
	<li>Collecte de biopsies liquides de l’humeur aqueuse MISE EN GARDE : Considérez les échantillons de tissus humains comme des matières biologiques dangereuses, ce qui nécessite des précautions appropriées telles qu’une blouse de laboratoire et des gants pour assurer la sécurité du personnel impliqué. REMARQUE: Les étapes suivantes ne doivent être effectuées que par un chirurgien ophtalmologue qualifié. Des biopsies liquides de l’humeur aqueuse peuvent être obtenues, par exemple, au début de la chirurgie de la cataracte, l’une des chirurgies les plus fréquentes au monde. REMARQUE: Un champ stérile est maintenu conformément aux protocoles de soins standard dans la salle d’opération. Les procédures préopératoires liées à l’anesthésie du patient suivent les étapes standard de soins pour les chirurgies de la chambre antérieure et de la vitréo-rétine.<ol><li>Préparez et drapez l’œil pour la chirurgie et placez un spéculum de couvercle stérile pour une visualisation optimale du champ stérile.</li>
		<li>Utilisez un microscope opératoire pour effectuer une paracentèse de la chambre antérieure perpendiculaire au limbe à l’aide d’une aiguille de 30 à 32 G reliée à une seringue de 1 mL. Utilisez une pointe en coton ou une petite pince pour stabiliser l’œil pendant cette procédure. REMARQUE : Assurez-vous que l’aiguille et la seringue sont verrouillées et qu’il n’y a pas de pression dans la seringue (en déplaçant le piston). Assurez-vous que la pointe de l’aiguille reste au-dessus de l’iris périphérique dans la chambre médiane antérieure pour éviter d’endommager les structures intraoculaires. Dans le cas de la chirurgie de la cataracte, l’aiguille pour obtenir la biopsie liquide peut également entrer dans la chambre antérieure via l’un des paracentèses créés pour la chirurgie de la cataracte.</li>
		<li>Sous visualisation directe au microscope, aspirer manuellement environ 100 μL d’humeur aqueuse non diluée à l’aide d’une seringue de 1 mL. Déplacez le piston de la seringue avec la main non dominante du chirurgien ou par un assistant qualifié sans bouger l’aiguille. REMARQUE: Obtenez moins de 100 μL d’humeur aqueuse au cas où la chambre antérieure s’effondrerait.</li>
		<li>Retirez délicatement l’aiguille de la chambre antérieure. REMARQUE: Dans un œil phaque, gardez l’aiguille sur l’iris pour éviter de toucher la lentille. Une pression positive sur le globe peut augmenter le reflux. Libérer l’embout de coton avant le retrait de l’aiguille aide à réduire le reflux.</li>
		<li>Tirez le piston vers l’arrière et voyez comment l’air et le fluide recueilli se déplacent.</li>
		<li>Injectez la seringue dans le cryovial. L’air supplémentaire nettoie l’espace mort de la seringue.</li>
		<li>Utilisez le code-barres sur le cryovial pour numériser l’échantillon sur le formulaire REDCap sur un ordinateur de la salle d’opération (plus de détails aux étapes 3.1 à 3.9).</li>
		<li>Transférer immédiatement le cryovial dans de la glace sèche dans la boîte de refroidissement.</li>
		<li>Poursuivre la chirurgie prévue pour le patient (p. ex., une chirurgie de la cataracte telle que décrite précédemment7 ).</li>
	</ol></li>
	<li>Collecte de biopsies liquides vitreuses REMARQUE: Les étapes suivantes ne doivent être effectuées que par un chirurgien vitréo-rétinien qualifié. Des biopsies liquides vitrées peuvent être obtenues au début d’une vitrectomie8. Puisque l’objectif est de prélever un échantillon vitré non dilué, le coupe-vitrectomie ne sera pas amorcé avec le liquide1. REMARQUE: Un champ stérile est maintenu conformément aux protocoles de soins standard dans la salle d’opération. Les procédures préopératoires liées à l’anesthésie du patient suivent les étapes standard de soins pour les chirurgies de la chambre antérieure et de la vitréo-rétine.<ol><li>Préparez et drapez l’œil pour la chirurgie et placez un spéculum de couvercle stérile pour une visualisation optimale du champ stérile.</li>
		<li>Créez des sclérotomies avec une canule trocart 23, 25 ou 27 G, en suivant les procédures de soins standard. Insérez la canule de perfusion et confirmez visuellement le placement approprié dans la cavité vitrée.</li>
		<li>Dans la cavité vitrée, activer le coupe-vitré sans perfusion pour prélever un échantillon vitreux non dilué. Aspirer manuellement 0,5 à 1,0 mL de vitré à l’aide d’une seringue connectée à la canule d’extrusion vitreuse1.</li>
		<li>Retirez la coupe vitrée de l’œil et allumez la perfusion de liquide.</li>
		<li>Aspirer le liquide restant dans le tube dans la seringue.</li>
		<li>Débranchez la seringue.</li>
		<li>Traiter l’échantillon comme décrit pour un échantillon d’humeur aqueuse à la section 2.3 (étapes 2.3.5 à 2.3.9).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Traitement des échantillons dans la salle d’opération et ajout d’échantillons à la base de données
<ol><li>Demandez au technicien de laboratoire de prendre le cryovial préparé (0,5 mL pour l’humeur aqueuse et 1,9 mL pour les échantillons vitrés) et de marcher jusqu’au chirurgien sans toucher aucun équipement stérile OU.</li>
	<li>Demandez au technicien de laboratoire d’ouvrir le cryovial.</li>
	<li>Déchargez la seringue directement dans le cryovial.</li>
	<li>Demandez au technicien de laboratoire de reboucher immédiatement le cryovial.</li>
	<li>Demandez au technicien de laboratoire de retourner au MORLI et de transférer immédiatement l’échantillon sur de la glace sèche dans la boîte de refroidissement (-80 °C). Fermez le couvercle de la boîte.</li>
	<li>Ouvrez un nouveau formulaire de prélèvement d’échantillons. Entrez les informations suivantes dans le champ respectif du formulaire: chirurgien de cas, lieu et date de prélèvement, numéro d’identification du patient et autres informations de base, telles que l’âge, le sexe, l’œil droit ou gauche, le diagnostic, les antécédents préopératoires (texte libre), informations sur la procédure (par exemple, le type de chirurgie), ainsi que des informations sur les échantillons, telles que le nombre d’échantillons prélevés, Type d’échantillons (humeur aqueuse, vitré) et autres détails tels que les volumes. Ajoutez le code-barres du tube à l’aide du lecteur de codes-barres.</li>
	<li>Cliquez sur Soumettre/Suivant.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.1 à 3.7 si des échantillons supplémentaires sont prélevés.</li>
	<li>Lorsque tous les échantillons sont sécurisés, cliquez sur Enregistrer et soumettre sur le formulaire de prélèvement d’échantillons REDCap. Déconnectez-vous ensuite de la base de données et de l’ordinateur/tablette.</li>
</ol>4. Transfert des cryoviales au stockage
<ol><li>Transportez les échantillons sur de la glace sèche dans la boîte de refroidissement de la salle d’opération au laboratoire et placez-les sur une paillasse de laboratoire à côté d’un ordinateur de laboratoire.</li>
	<li>Connectez-vous à REDCap sur l’ordinateur du laboratoire à l’aide de votre identifiant de connexion et de votre mot de passe.</li>
	<li>Portez des gants. Prélevez l’un des échantillons prélevés et scannez le code-barres du cryovial dans la base de données (plus de détails dans la section 5). Replacez immédiatement l’échantillon sur de la glace sèche.</li>
	<li>Procurez-vous un deuxième récipient rempli de glace sèche.</li>
	<li>Procurez-vous une grille pour les cryovials du congélateur à -80 °C. Placez-le dans le deuxième récipient sur de la glace sèche. REMARQUE : Un support de format 96 sera nécessaire pour les tubes à humeur aqueuse de 0,5 ml et un support de 48 pour les tubes vitreux de 1,9 ml.</li>
	<li>Scannez le code-barres du rack dans la base de données (plus de détails dans la section 5).</li>
	<li>Transférez l’échantillon sur le rack.</li>
	<li>Ajoutez la position des flacons dans le rack à la base de données (plus de détails dans la section 5).</li>
	<li>Cliquez sur Enregistrer et envoyer.</li>
	<li>Transportez la grille avec les flacons sur glace sèche au réfrigérateur pour la conserver à -80 °C. Ajoutez le rack à une position spécifique dans le réfrigérateur à l’aide d’un système de coordonnées. Cela permettra plus tard de récupérer facilement des échantillons pour une analyse en aval.</li>
</ol>5. Formulaire de stockage d’échantillons
<ol><li>Remplissez un formulaire d’entreposage pour chaque échantillon prélevé au cours de la phase de formulaire d’inscription. Cliquez sur le cercle vide ou sur le « + » sous Sample Storage pour créer et ouvrir un nouveau formulaire de stockage.</li>
	<li>Inscrivez la date à laquelle ce formulaire a été rempli sous Date d’archivage des documents.</li>
	<li>Scannez ou tapez le code-barres du tube sous Code à barres du tube spécimen. Replacez immédiatement l’échantillon sur de la glace sèche.</li>
	<li>Indiquez si un échantillon est transféré ou s’il est stocké dans un bioréférentiel interne.</li>
	<li>Vérifiez que le consentement éclairé écrit a été obtenu du patient et cochez la case sous Vérifier la conformité au consentement et entrez votre nom sous Consentement vérifié par.</li>
	<li>Sélectionnez un emplacement libre et approprié pour le cryovial dans le rack. Transférer le cryovial à cette position dans le rack (par exemple, position A1). Gardez la grille sur de la glace sèche.</li>
	<li>Dans la phase Emplacement , entrez les informations suivantes : l’emplacement du congélateur sous Congélateur, le numéro d’étagère où l’échantillon sera stocké sous Étagère, le code-barres de la boîte sous Code à barres de la boîte, la position du tube dans la boîte par rangée (Position du tube (ligne)) et la colonne (Position du tube (Colonne)). REMARQUE: En option, une étiquette de boîte peut également être entrée sous Étiquette de boîte, ce qui peut faciliter la recherche de la boîte dans le congélateur.</li>
	<li>Dans la section Utilisation , entrez les informations suivantes : le nom du projet pour lequel l’échantillon est utilisé (Nom du projet), le volume d’échantillon dans l’une des catégories suivantes : complet, partiel, presque vide ou vide (volume d’échantillon) et les notes de stockage, le cas échéant, sous Notes de stockage. REMARQUE : La date, l’heure et l’utilisateur qui a accédé au formulaire pour la dernière fois sont remplis automatiquement pour assurer une chaîne de traçabilité qui peut être examinée et auditée au besoin.</li>
	<li>Vérifiez que le formulaire est rempli en cliquant sur Terminer sous Terminé ?.</li>
	<li>Cliquez sur Enregistrer et quitter le formulaire. Cela vous ramènera à la vue d’ensemble du patient.</li>
	<li>Pour chaque tube prélevé, générez un autre formulaire de prélèvement d’échantillons en cliquant sur le « + » sous Stockage des échantillons. Répétez ensuite les étapes 5.1 à 5.10.</li>
	<li>Cliquez sur Enregistrer et quitter pour remplir le formulaire et vous déconnecter de la base de données et de l’ordinateur/tablette.</li>
	<li>Transférer la grille à échantillons (sur de la glace sèche) au réfrigérateur à la position prédéfinie.</li>
</ol>6. Prélèvement d’échantillons chirurgicaux pour analyse en aval
REMARQUE : Les spécimens sont souvent archivés pendant plusieurs années avant d’être analysés. Les cryoflacons à code-barres et le système de base de données REDCap interrogeable permettent de trouver et de localiser facilement chaque échantillon pour une analyse en aval.
<ol><li>Identifiez les échantillons d’intérêt pour l’expérience à l’aide de la fonction de recherche de la base de données. Cela permettra de trouver, par exemple, tous les échantillons d’humeur aqueuse de patients âgés de 20 à 40 ans atteints de rétinopathie diabétique.</li>
	<li>Obtenir l’emplacement des cryoflacons d’intérêt (congélateur, étagère/rack, rack à échantillons, coordonnées dans le rack). Écrivez-les, imprimez-les ou mettez-les à disposition sur un ordinateur mobile ou une tablette pour faciliter la recherche des échantillons dans le congélateur.</li>
	<li>Marquez les exemples tels qu’utilisés dans la base de données.</li>
	<li>Cliquez sur Enregistrer et quitter pour remplir le formulaire et vous déconnecter de REDCap et de l’ordinateur/tablette.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les échantillons chirurgicaux prélevés sur des patients permettent une caractérisation moléculaire directe de la maladie chez les humains vivants 2,3,4,14 et peuvent aider à surmonter les limites des modèles de maladies cellulaires et animales qui ne récapitulent pas complètement la maladie humaine 15,16. L’analyse moléculaire des tissus humains pourrait améliorer la sélection de nouvelles cibles médicamenteuses et pourrait contribuer à un taux de réussite plus élevé des essais cliniques et de l’approbation des médicaments17. De plus, cette approche offre le potentiel de la médecine personnalisée, car le tissu obtenu conserve l’empreinte génomique, épigénomique, métabolomique, glycomique et protéomique unique de chaque individu 2,18,19.
Une qualité d’échantillon élevée et constante est fondamentale pour toutes les applications d’analyse moléculaire. Des études antérieures ont montré que la congélation immédiate après le prélèvement de l’échantillon et l’évitement des cycles répétés de congélation/décongélation sont essentiels pour des échantillons de qualité élevée 9,20. Le stockage à long terme sur plusieurs années à -70 °C n’a pas affecté de manière significative l’intégrité du profil protéomique9. Un protocole normalisé est une base importante pour réduire les biais et améliorer la comparabilité des données scientifiques, en particulier lorsque plusieurs personnes (chirurgiens, techniciens et autres) ou différentes institutions sont impliquées dans le processus d’échantillonnage. Outre la qualité de l’échantillon, l’annotation des échantillons est un autre facteur important qui nécessite une normalisation pour permettre la corrélation des résultats moléculaires avec les données cliniques. Notre protocole repose sur trois principes essentiels pour y parvenir : 1) une procédure d’échantillonnage normalisée pour l’humeur aqueuse et les biopsies liquides vitreuses par un chirurgien ophtalmologiste, 2) le traitement immédiat et la congélation instantanée des échantillons dans la salle d’opération par le personnel de laboratoire, et 3) une annotation des métadonnées de chaque échantillon dans une base de données Web qui permet aux chercheurs de trouver rapidement des échantillons pour des expériences ultérieures.
En plus des échantillons vitreux20, ce flux de travail établit également la collection standardisée de biopsies liquides d’humeur aqueuse pour l’analyse moléculaire. L’humeur aqueuse est un fluide complexe très accessible dans la chambre antérieure de l’œil qui ne reflète pas seulement les maladies oculaires de la partie antérieure mais aussi du segment postérieur de l’œil, y compris la maladie de la rétine 18,21. Outre le fait qu’un grand nombre d’échantillons d’humeur aqueuse pourraient être collectés, par exemple lors d’une chirurgie de la cataracte, l’une des chirurgies les plus fréquemment pratiquées dans le monde, ces caractéristiques en font une source intéressante pour les biopsies liquides de l’œil humain. L’annotation normalisée des métadonnées de chaque échantillon établie dans ce flux de travail pourrait également permettre la corrélation des données du protéome avec les données de suivi clinique prospectif. Cela offre l’occasion passionnante d’identifier de nouveaux biomarqueurs pronostiques qui peuvent aider à estimer le pronostic pour les futurs patients.
Cependant, l’analyse moléculaire d’échantillons chirurgicaux humains présente également des limites importantes. Par exemple, les manipulations expérimentales complexes ne sont souvent possibles que dans des modèles animaux et cellulaires. Une solution peut consister à comparer le profil moléculaire de modèles animaux ou cellulaires avec celui d’une maladie humaine. Cette stratégie permet d’identifier des biomarqueurs protéiques et des cibles thérapeutiques qui se chevauchent et qui peuvent être validés chez des animaux ou des modèles cellulaires afin d’identifier les candidats les plus prometteurs qui sont en corrélation avec la maladie humaine et qui sont susceptibles de réussir dans les essais cliniques 4,16.
En conclusion, notre flux de travail établit une interface pratique entre la salle d’opération et le laboratoire de recherche qui permet la collecte, l’annotation et le stockage standardisés et à haut débit d’échantillons chirurgicaux de haute qualité pour l’analyse moléculaire en aval, fournissant une base précieuse pour la recherche translationnelle future.

Le profilage moléculaire des biopsies liquides de l’œil humain peut capturer des fluides localement enrichis contenant des molécules telles que l’ADN, l’ARN, les protéines, les glycanes et les métabolites de tissus oculaires hautement spécialisés. Les biopsies liquides du vitré dans la chambre postérieure de l’œil humain se sont avérées être une procédure généralement sûre1. Ils permettent la caractérisation moléculaire des maladies oculaires chez les humains vivants et offrent le potentiel d’identifier de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques 2,3,4. L’humeur aqueuse dans la chambre antérieure de l’œil a une accessibilité chirurgicale encore plus élevée et pourrait être obtenue en grand nombre, par exemple lors de la chirurgie de la cataracte, qui est l’une des chirurgies les plus fréquemment pratiquées. Cependant, aucun protocole normalisé pour la collecte, l’annotation et la biobanque de l’humeur aqueuse humaine et des biopsies liquides vitreuses pour les analyses moléculaires en aval, y compris la protéomique, la métabolomique et la glycomique, n’est disponible jusqu’à présent.
Ici, nous avons développé un protocole pour la collecte et la biobanque de biopsies liquides de haute qualité pour les analyses moléculaires de patients subissant une chirurgie oculaire. Une interface de laboratoire de salle d’opération mobile (MORLI) permet à un chercheur de congeler immédiatement les échantillons prélevés dans des cryovials à code-barres sur de la glace sèche à -80 ° C dans la salle d’opération (RO). Cette procédure garantit une qualité d’échantillon élevée et constante pour l’analyse moléculaire en aval. En plus d’une excellente qualité d’échantillon, une annotation précise des échantillons dans une biobanque est essentielle. À l’aide d’une base de données REDCap (capture de données électronique de recherche) conforme à la loi HIPAA (Health Insurance Portability and Accountability Act)5, notre flux de travail permet de stocker des métadonnées détaillées pour chaque échantillon, y compris l’âge, le sexe, la maladie, le stade de la maladie, le type d’échantillon et les caractéristiques uniques de la chirurgie. Cela permettra une capacité de recherche future précise, par exemple, pour des échantillons d’une maladie spécifique ou d’un groupe particulier de patients. De plus, l’emplacement exact de chaque échantillon dans le congélateur est archivé à l’aide d’un système de grille cartésienne, ce qui permet une récupération efficace des échantillons pour les expériences en aval. Nous montrons des exemples d’analyses d’ADN, de protéines, de glycanes et de métabolites.
Notre flux de travail représente un lien pratique et efficace entre la salle d’opération et le laboratoire de recherche et fournit une base précieuse pour la recherche translationnelle.

<table><tbody><tr><td>Tube tricodé de 0,5 ml, format 96, filetage externe</td><td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803,</td><td>États-Unis 68-0703-12</td><td>utilisé pour les échantillons d’humeur aqueuse</td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>de qualité chirurgicale, tout ce qui est disponible à l’hôpital</td> <td>pour</td> <td>les biopsies de l’humeur aqueuse</td></tr><tr><td>Tube tricodé de 1,9 ml, format 48, fil externe</td><td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, États-Unis</td><td>65-7643</td><td>utilisé pour les échantillons de vitré</td></tr><tr><td>Seringue de 3 mL</td><td>de qualité chirurgicale, tout ce qui est disponible à l’hôpital</td> <td>-</td> <td>pour les biopsies vitrées</td></tr><tr>Acier de<td>calibre 30-32</td> de <td>qualité chirurgicale, tout ce qui est disponible à l’hôpital</td> <td>-</td> <td>pour les biopsies de l’humeur aqueuse</td></tr><tr><td>Électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse transformée de Fourier (CE-FTMS)</td><td>Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japon</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Système de vitrectomie Constellation avec système de canule trocart de calibre 23, 25 ou 27</td><td>Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX,</td> <td>États-Unis-pour</td> <td>les biopsies vitréennes</td></tr><tr><td>Boîte réfrigérante</td><td>Boîte standard en polystyrène, tout ce qui est disponible en laboratoire</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Glace sèche</td><td>Tout ce qui est disponible en laboratoire</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Kit de scanner de gamme standard mains libres avec câble USB blindé</td><td>Zebra Symbol&nbsp ;</td><td>DS9208-SR4NNU21Z Lecteur de codes-barres</td><td></td></tr><tr><td>Réseau d’anticorps de glycosylation humaine L3&nbsp ;</td><td>RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA</td>, <td>GAH-GCM-L3-Mac</td><td></td></tr> <tr><td>mini</td><td>Apple Inc., Cupertino, CA 95014, États-Unis</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>MetaboAnalyst software</td><td>Pang et al., 2021, PMID : 34019663</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Rack pour tubes de 0,5 ml, 96-Format</td><td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA</td><td>66-51026</td><td>pour échantillons d’humour aqueux</td></tr><tr><td>Rack pour tubes de 1,9 ml, format</td> <td>48Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA</td><td>65-9451</td><td>pour les échantillons vitrés</td></tr><tr><td>Base de données d’échantillons basée sur un navigateur REDCap</td><td>Consortium REDCap, Université Vanderbilt, https://www.project-redcap.org</td><td></td><td>--</td></tr></tbody></table>

biobanque de biopsies liquides aqueuses et vitrées humaines pour analyses moléculaires

Biobanking of Human Aqueous and Vitreous Liquid Biopsies for Molecular Analyses

Un défi crucial de la recherche translationnelle consiste à établir une interface viable et efficace entre les soins aux patients en salle d’opération et le laboratoire de recherche. Ici, nous avons développé un protocole pour l’acquisition de biopsies liquides de haute qualité pour les analyses moléculaires de l’humeur aqueuse et du vitré des patients subissant une chirurgie oculaire. Dans ce flux de travail, un chariot MORLI (Mobile Operating Room Lab Interface) équipé d’un ordinateur, d’un lecteur de codes-barres et d’instruments de laboratoire, y compris un entrepôt frigorifique intégré, est utilisé pour obtenir et archiver des échantillons biologiques humains. Une base de données Web conforme à la confidentialité des données permet d’annoter chaque échantillon tout au long de sa durée de vie, et un système de coordonnées cartésiennes permet de suivre chaque échantillon à code-barres stocké, permettant une récupération rapide et précise des échantillons pour les analyses en aval. La caractérisation moléculaire d’échantillons de tissus humains sert non seulement d’outil de diagnostic (p. ex., pour faire la distinction entre l’endophtalmie infectieuse et d’autres inflammations intraoculaires non infectieuses), mais représente également une composante importante de la recherche translationnelle, permettant l’identification de nouvelles cibles médicamenteuses, le développement de nouveaux outils de diagnostic et de thérapies personnalisées.

Les échantillons de biopsie liquide collectés peuvent être soumis à une variété d’analyses moléculaires, y compris l’analyse de l’ADN, des protéines, des glycanes et des métabolites. Il a été démontré auparavant que le stockage à long terme sur plusieurs années à -70 °C n’affectait pas de manière significative l’intégrité du profil protéomique9. La base de données REDCap permet une récupération simple et rapide des échantillons. La base de données peut être recherchée pour des échantillons provenant d’un groupe spécifique de patients, par exemple, tous les patients atteints de rétinopathie diabétique. La base de données fournira ensuite les codes-barres des tubes et les positions en stockage. Jusqu’à présent, nous avons recueilli et archivé plus de 1 000 biopsies liquides. La base de données nous a permis de trouver rapidement les échantillons pour les analyses en aval 3,10 et nous a aidés à réaliser les expériences suivantes.
Une jeune fille de 17 ans présentait une inflammation de la rétine et du nerf optique. Elle était immunodéprimée et on craignait qu’elle ne soit infectée. L’humeur aqueuse a été recueillie de son œil droit et envoyée pour une analyse ADN PCR. Les résultats étaient positifs pour le cytomégalovirus et négatifs pour le virus de l’herpès simplex et la toxoplasmose. Ces résultats illustrent que les biopsies liquides de l’humeur aqueuse peuvent aider à distinguer les formes infectieuses et non infectieuses d’inflammation intraoculaire, ce qui est essentiel pour choisir le traitement approprié.
La chromatographie liquide-spectrométrie de masse permet une analyse non biaisée et semi-quantitative du protéome. Dans une biopsie liquide du vitré d’un patient subissant une vitrectomie, la technique a permis d’identifier 484 protéines uniques, dont le complément C3 (C3), l’optacine (OPTC) et le collagène de type II alpha 1 (COL2A1) (Figure 1A).
Trois biopsies liquides vitreuses ont été analysées à l’aide d’un ELISA multiplex glycoprotéomique (voir le tableau des matériaux)11. Le test a détecté les profils de glycosylation de 500 protéines humaines, capturant une variété de voies biologiques, telles que le métabolisme, la réponse immunitaire, l’adhésion cellulaire et l’organisation de l’actine (Figure 1B).
Un criblage métabolomique utilisant l’électrophorèse capillaire couplé à la spectrométrie de masse transformée de Fourier12 (voir le tableau des matériaux) a identifié 292 métabolites différents dans trois échantillons de biopsie liquide de l’humeur aqueuse. Une analyse des voies (voir le tableau des matériaux)13 a permis d’identifier diverses voies métaboliques, y compris le métabolisme des acides aminés, le cycle de l’urée et la synthèse de la carnitine (figure 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65804/65804fig01.jpg"> Figure 1 : Résultats représentatifs. (A) L’analyse protéomique de l’humeur vitrée humaine par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) a permis d’identifier 484 protéines uniques dans une seule biopsie liquide. Les niveaux de protéines sont indiqués et classés en fonction des comptages spectraux. Les protéines représentatives sont surlignées en bleu. (B) Un test ELISA multiplex glycoprotéomique a détecté des niveaux de glycosylation de 500 protéines uniques dans trois biopsies liquides vitreuses. Une analyse des interactions protéiques STRING a permis d’identifier des grappes d’interactions protéiques (les grappes contenant au moins 10 protéines sont représentées). La voie la plus enrichie est indiquée pour chaque grappe. (C) L’analyse métabolomique par spectrométrie de masse a permis d’identifier 292 métabolites différents dans trois biopsies liquides de l’humeur aqueuse. Chaque point représente un échantillon. La hauteur de la barre correspond au nombre moyen de métabolites, la barre d’erreur représente l’écart type. Le panneau de droite montre des voies considérablement enrichies. Le nombre de métabolites détectés (numérateur) ainsi que le nombre total de métabolites dans chaque voie (dénominateur) sont indiqués. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65804/65804fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole présente une plate-forme de bioréférentiel intégrée pour la collecte, l’annotation et la biobanque normalisées de biopsies de l’humeur aqueuse humaine et du liquide vitreux de haute qualité pour les analyses moléculaires en aval, y compris la protéomique, la métabolomique et la glycomique.

Biobanque de biopsies liquides aqueuses et vitrées humaines pour analyses moléculaires

A critical challenge in translational research is establishing a viable and efficient interface between patient care in the operating room (OR) and the ...

Le profilage moléculaire des biopsies liquides de l’œil humain peut capturer des fluides localement enrichis contenant des milliers de molécules différentes provenant de tissus oculaires hautement spécialisés. Ils permettent la caractérisation moléculaire des maladies oculaires chez les humains vivants et d’autres possibilités d’identifier de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques. Ici, nous avons développé un protocole pour la collecte standardisée et la biobanque de biopsies de l’humeur aqueuse et du liquide vitreux de haute qualité pendant la chirurgie intraoculaire.Une partie du protocole est une base de données Web conforme à la confidentialité des données pour annoter chaque échantillon au cours de sa durée de vie et l’utilisation d’un système de coordonnées qui permet de suivre l’emplacement de chaque échantillon à code-barres stocké, ce qui permet une récupération efficace des échantillons pour les expériences en aval telles que l’analyse des protéines, des glycanes et des métabolites. Utilisez un microscope opératoire pour effectuer une paracentèse de la chambre antérieure perpendiculaire au limbe à l’aide d’une aiguille de calibre 30 à 32 reliée à une seringue d’un ml. Une pointe en coton peut être utilisée pour stabiliser l’œil pendant cette procédure.Assurez-vous que la pointe de l’aiguille reste au-dessus de l’iris périphérique dans la chambre antérieure médiane pour éviter d’endommager les structures intraoculaires. Sous visualisation directe au microscope, aspirer manuellement une centaine de microlitres d’humeur aqueuse non diluée à l’aide d’une seringue d’un ml. L’aiguille est ensuite soigneusement retirée de la chambre antérieure.Dans un œil phaque, gardez l’aiguille sur l’iris pour éviter de toucher la lentille. Une pression positive sur le globe peut augmenter le reflux. Libérer l’embout de coton avant le retrait de l’aiguille aide à réduire le reflux.Retirez le plombier et voyez comment l’air et le fluide collecté se déplacent. Injectez la seringue dans le flacon cryogénique. L’air supplémentaire nettoie l’espace mort de la seringue.Ici, vous pouvez voir le code-barres qui est gravé en permanence sur le flacon. Le code-barres est ensuite utilisé pour numériser l’échantillon vers le formulaire REDCap sur un ordinateur de la salle d’opération. Le flacon cryogénique sera immédiatement transféré sur de la glace sèche dans la boîte de refroidissement.Les biopsies de liquide vitreux peuvent être obtenues au début d’une vitrectomie par un chirurgien vitréo-rétinien qualifié. Notez que le coupe-vitrectomie ne sera pas amorcé avec du liquide. Dans la cavité vitrée, activer le coupe-vitré sans perfusion pour prélever un échantillon vitreux non dilué.Aspirer manuellement 0,5 à un ml de vitré à l’aide d’une seringue reliée à la canule d’extrusion vitrée. L’échantillon est ensuite traité comme nous l’avons démontré pour un échantillon huméral précis. Cette vidéo est une présentation pas à pas d’un formulaire de collecte d’échantillons rempli dans REDCap en vue d’enquête.Une fois qu’un patient a rempli le consentement électronique avec l’aide d’un coordonnateur de la recherche clinique, ce formulaire est rempli. Il est possible d’y accéder sur le même appareil que celui sur lequel le patient a obtenu son consentement électronique, ou il peut être consulté à l’aide de tout autre appareil approuvé. Une copie du consentement électronique qui a été rempli peut être consultée ici pour que les signatures soient vérifiées.Le coordinateur remplit ensuite les autres sections pertinentes, y compris le type de consentement et dans cette section bleue, des détails sur le cas lui-même, tels que le chirurgien de cas, où il a été effectué, la date de la collecte et d’autres informations pertinentes. Dans cette prochaine section verte sur les patients, nous avons les données démographiques des patients, y compris un échantillon de MRN, le prénom et le nom du patient, son sexe, sa date de naissance avec un calcul automatique de l’âge, la latéralité de l’œil affecté et la catégorie de diagnostic. Ce formulaire comporte une logique de branchement, de sorte que lorsqu’une case à cocher est sélectionnée, elle affecte l’apparence des cases à cocher situées en dessous.Dans ce cas, il s’agit d’un segment antérieur et d’un cas de rétine. Donc, d’abord, la boîte de diagnostic de la rétine est remplie. Le coordonnateur a choisi qu’il s’agit d’un trou maculaire et la boîte de diagnostic du segment antérieur a également été remplie.Dans ce cas, on dirait que c’est une cataracte. Un formulaire d’historique préopératoire est également rempli sous forme de zone de texte libre. Ici, les informations du DME peuvent être copiées et collées ou de nouvelles informations sur l’historique préopératoire peuvent être entrées pour référence future.Ensuite, dans cette section rouge, nous avons la boîte de procédure. Dans ce cas, on dirait qu’une vitrectomie pars plana a été sélectionnée avec la LIO phaco. Tout ce qui n’est pas rempli ici dans l’une de ces cases à cocher peut être entré en texte libre à l’aide de ces autres cases qui sont poivrées tout au long du formulaire.Les détails pertinents sur l’affaire elle-même sont également complétés. Enfin, dans cette section d’or, nous avons une zone de collecte. Le nom du coordinateur qui a recueilli le spécimen ainsi que le nombre de tubes d’échantillons utilisés ont été saisis ici.Encore une fois, en utilisant la logique de branchement, nous sommes en mesure de collecter autant d’échantillons que nécessaire pour le cas. Dans ce cas, deux échantillons ont été prélevés, ressemblant à un noyau vitreux et à un échantillon de liquide de la chambre antérieure. Les codes-barres de chacun de ces échantillons ont été scannés ici et enregistrés dans le formulaire.Enfin, il y a une section de notes de collecte d’échantillons où le coordinateur peut taper des détails pertinents, y compris les volumes et la qualité du fluide prélevé. Dans cette dernière section de téléchargement de fichier, toutes les photos, vidéos ou documents pertinents peuvent être téléchargés dans le formulaire lui-même et liés. Enfin, une fois que tout est terminé, le coordinateur peut cliquer sur Soumettre suivant et le formulaire est enregistré avec toutes les informations pertinentes stockées, reliant l’échantillon avec succès avec le patient.Transporter les échantillons sur glace sèche de la salle d’opération au laboratoire. Connectez-vous à REDCap sur l’ordinateur de laboratoire. Prenez l’un des échantillons collectés et scannez le code-barres dans la base de données.Maintenant, un deuxième récipient avec de la glace sèche et un rack pour les flacons cryogéniques est nécessaire. Le code-barres du rack sera également scanné dans la base de données et les échantillons seront transférés sur le rack. La position des flacons dans le rack est ajoutée à la base de données et l’entrée est enregistrée et fermée.Le support avec les flacons est ensuite transporté sur de la glace sèche au réfrigérateur pour un stockage à moins 80 degrés Celsius. Le rack est ajouté à une position spécifique dans le réfrigérateur à l’aide d’un système de coordonnées. Cela permettra plus tard de récupérer facilement des échantillons pour une analyse en aval.Cette vidéo est une procédure pas à pas du formulaire de stockage d’exemples. Ici, nous voyons l’enregistrement de l’aperçu du patient. Ce cercle vert indique que le formulaire d’inscription au prélèvement d’échantillons a déjà été rempli.Ce cercle vide indique qu’un formulaire de stockage doit être rempli. Un formulaire d’entreposage doit être rempli pour chaque échantillon prélevé au cours de la phase du formulaire d’inscription. En cliquant sur ce cercle, nous accéderons au premier formulaire de stockage d’échantillons.Ici, nous pouvons voir qu’un PID a été généré et que le MRN a été masqué. Ces informations sont toujours accessibles et peuvent être consultées à partir de la page précédente en cliquant sur le cercle vert dans le formulaire d’inscription. Ici, un échantillon d’instantané sera généré une fois cette page terminée.Sous les notes de collecte, nous voyons que les informations ont été importées automatiquement à partir du formulaire d’inscription. Ensuite, sous Date d’archivage des documents, nous pouvons entrer la date à laquelle ce formulaire est rempli. Sous le code-barres du tube de l’échantillon, nous scannons ou entrons à nouveau le code à barres du tube en cours d’archivage.En temps réel, cet instantané du spécimen est en cours de mise à jour. Dans cette section, nous pouvons sélectionner si un échantillon est transféré. Ici, nous entrons ces informations pertinentes.Pour les besoins de cet exemple, nous allons indiquer qu’il s’agit d’un échantillon qui va dans le stockage interne du bioréférentiel. Sous vérification, un coordonnateur de recherche peut revenir en arrière et vérifier que le consentement électronique ou le consentement papier a été rempli avec succès et dans le respect des protocoles. Le nom de la personne qui effectue cette vérification est entré et à l’aide de cette liste déroulante, le vérificateur fait correspondre le code à barres ici avec ce qui vient d’être tapé.Cela garantit la précision. Ensuite, dans cette phase de localisation, nous voyons le congélateur où l’échantillon va être stocké. Nous pouvons indiquer l’étagère où l’échantillon sera stocké ainsi que le code à barres de la boîte, qui peut être scanné ou tapé.Une étiquette de boîte peut également être tapée ici et l’étiquette peut être placée sur la boîte pour une correspondance ultérieure. Ensuite, les deux positions par ligne et colonne sont toutes deux enregistrées. Cela garantit que chaque code-barres est associé à une position dans la boîte qui est enregistrée pour une récupération facile à l’avenir.Dans cette section d’utilisation, nous pouvons entrer notre nom de projet ou en sélectionner un dans une liste déroulante. Notez le volume de l’échantillon. Et ici, la date et l’heure ainsi que l’utilisateur qui a accédé à ce formulaire pour la dernière fois sont remplis automatiquement pour assurer une chaîne de traçabilité qui peut être examinée et auditée au besoin.La personne qui archive le formulaire entre son nom ici et indique ici toutes les notes pertinentes qui peuvent être cohérentes avec ce qu’elle veut enregistrer dans ce formulaire d’entrée pour stockage. Enfin, il y a une autre section pour télécharger un fichier, et une fois que tout cela est terminé, ce formulaire peut être rempli et soumis en cliquant sur enregistrer et quitter, ce qui nous ramène à l’aperçu du patient. Pour chaque formulaire supplémentaire qui doit être rempli, pour chaque tube qui doit être stocké, nous pouvons cliquer sur ce bouton plus pour revenir au formulaire de stockage de l’échantillon et générer un autre enregistrement.Cet aperçu permet d’accéder au formulaire d’inscription qui a été généré ainsi qu’à tous les formulaires de stockage ultérieurs pour ce dossier patient. De cette façon, il est facilement récupérable et accessible par toute personne disposant d’un accès backend ou d’autres autorisations données dans un REDCap. Les biopsies liquides collectées peuvent être soumises à une variété d’analyses moléculaires, y compris la protéomique, la glycomique et la métabolomique.La base de données REDCap permet de récupérer des échantillons simplement et rapidement, par exemple en recherchant des échantillons de patients atteints d’une maladie spécifique. Il s’agit d’une patiente de 17 ans immunodéprimée qui présentait une inflammation de la rétine et du nerf optique. Préoccupé par une infection, une biopsie liquide de l’humeur aqueuse a été effectuée et envoyée pour analyse ADN PCR.Les résultats étaient positifs pour le CMV et négatifs pour le VHS et la toxoplasmose et étaient essentiels pour distinguer les formes infectieuses des formes non infectieuses d’inflammation intraoculaire et choisir le traitement approprié. La spectrométrie de masse par chromatographie liquide permet une analyse non biaisée et semi-quantitative du protéome. Dans une biopsie liquide du vitré d’un patient subissant une vitrectomie, la technique a permis d’identifier 484 protéines uniques, dont le complément C3, l’opticine et le collagène de type 2.Trois biopsies liquides vitreuses ont été analysées à l’aide d’un analyseur multiplex glycoprotéomique. Le test a détecté les profils de glycosylation de 500 protéines humaines, capturant une variété de voies biologiques telles que le métabolisme, la réponse immunitaire, l’adhésion cellulaire et l’organisation de l’actine. Nous avons également analysé le profil métabolomique des biopsies liquides à humeur aqueuse à l’aide d’une forme spéciale de spectrométrie de masse.Nous avons identifié 292 métabolites différents dans trois biopsies liquides humaines aqueuses. Une analyse des voies a identifié une variété de voies métaboliques, y compris le métabolisme des acides aminés, le cycle de l’urie et la synthèse de la carnitine. En conclusion, notre flux de travail a établi une interface pratique entre la salle d’opération et le laboratoire de recherche qui permet la collecte, l’annotation et le stockage standardisés et à haut débit d’échantillons chirurgicaux de haute qualité.Les échantillons peuvent être utilisés pour l’analyse moléculaire en aval, y compris la protéomique, la glycomique et les études métabolomiques. Notre protocole fournit une base précieuse pour la recherche translationnelle future.

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