Name: Reprogrammation de l’adénocarcinome canalaire pancréatique à la pluripotence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Découvrez la reprogrammation de cellules PDAC en iPSC pour étudier la progression du cancer du pancréas. Cette méthode permet d'établir des lignées stables et d'explorer l'hétérogénéité tumorale.

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A.S et J.K tiennent à remercier Cancer Research UK et OHSU pour leur financement (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S est soutenu par une bourse de développement de carrière du CMR (MR/N024028/1). Les AA sont financés par une bourse de doctorat (bourse réf. 1078107040) de la Cité du roi Abdulaziz pour la science et la technologie. J.K est financé par la subvention de nouveau chercheur MRF (GCNCR1042A) et la subvention Knight CEDAR (68182-933-000, 68182-939-000). Nous remercions le professeur Keisuke Kaji d’avoir aimablement fourni les vecteurs de reprogrammation pSIN4-EF1a-O2S et pSIN4-CMV-K2M. Aux fins du libre accès, l’auteur a appliqué une licence Creative Commons Attribution (CC BY) à toute version du manuscrit accepté par l’auteur découlant de cette soumission.

Reprogrammation des cellules PDAC et pancréatiques en cellules souches pluripotentes induites

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Pour faciliter l’utilisation de la reprogrammation des iPSC pour étudier la progression du cancer, un protocole robuste a été établi pour la reprogrammation des cellules cancéreuses du pancréas. La reprogrammation des cellules cancéreuses en pluripotence s’est avérée très difficile jusqu’à présent, car seules quelques études ont réussi à générer des iPSC à partir de cellules cancéreuses 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. La plupart de ces études ont utilisé des lignées cellulaires cancéreuses immortalisées pour générer des lignées iPSC, et non des cellules primaires dérivées de patients 36,37,38,40,42,43,44,46. Par exemple, la reprogrammation de quatre lignées cellulaires différentes de cancer du foie a été tentée en utilisant l’introduction rétrovirale de facteurs OSKM, mais une seule lignée cellulaire a été reprogrammée avec succès41. Cependant, la lignée iPSC du cancer du foie générée a montré une perte de souche après quelques passages, mettant en évidence la forte résistance des cellules cancéreuses à la reprogrammation d’OSKM41. Auparavant, des tentatives ont été faites pour reprogrammer les cellules PDAC en utilisant l’administration lentivirale d’OSKM individuellement ; cependant, une seule lignée iPSC a été générée, dépendante de l’expression exogène d’OSKM et donc pas entièrement reprogrammée37. Une autre étude a utilisé des vecteurs épisomiques pour délivrer des facteurs OSKM sans intégration génomique, mais n’a réussi à générer qu’un seul clone iPSC à partir du PDAC39. Le succès limité de la reprogrammation des cellules cancéreuses s’ajoute aux nombreux défis qui entravent l’utilisation de la technologie iPSC dans la recherche sur le cancer.
Ici, la génération d’iPSC à partir d’échantillons primaires de PDAC dérivés de deux patients différents et d’une lignée cellulaire PDAC établie (BxPc3) est expliquée. De plus, des iPSC ont également été générées à partir de H6c7, une lignée de cellules épithéliales canalaires pancréatiques. À notre connaissance, il s’agit du premier rapport de lignées iPSC stables dérivées avec succès de BxPc3 et H6c7. À la suite de ce protocole, des iPSC ont également été générées avec succès à partir de fibroblastes humains primaires dérivés d’individus sains, élargissant ainsi l’applicabilité de la méthode au-delà de la recherche sur le cancer.
L’un des éléments clés du succès du protocole est l’utilisation de vecteurs lentiviraux bicistroniques pour co-exprimer les facteurs OS et KM. Ces vecteurs contiennent le site d’entrée interne du ribosome 2 (IRES2) pour exprimer OCT4 et SOX2 dans un vecteur et KLF4 et cMYC dans l’autre. De multiples études utilisant des vecteurs monocistroniques où chaque facteur de reprogrammation a été délivré individuellement ont montré que l’absorption de chaque vecteur est différente, affectant la stœchiométrie OSKM et l’efficacité de la reprogrammation47. L’utilisation de vecteurs bicistroniques peut aider à atténuer ce problème. De plus, l’utilisation d’IRES dans les vecteurs lentiviraux a montré une augmentation significative de l’efficacité de la reprogrammation48. Dans ce système lentivirus, l’expression de la SG est pilotée par le promoteur EF1a, tandis que l’expression de KM est sous le contrôle d’un promoteur CMV. On sait que le promoteur du CMV peut être soumis à un silençage très efficace par méthylation de l’ADN et désacétylation des histones, contrairement à EF1a49,50. Par conséquent, le silence précoce de KM avant la SG pendant la reprogrammation peut être un facteur clé pour le succès du protocole. Ceci est cohérent avec des études antérieures montrant l’importance de la dynamique d’expression d’OSKM lors de la reprogrammation 51,52,53,54,55. Ainsi, le vecteur bicistronique est également plus avantageux que le vecteur polycistronique, où tous les facteurs OSKM sont exprimés à partir d’un seul promoteur56. D’autres facteurs contribuent au succès du protocole, notamment les doses d’infection par les lentivirus et le nombre de cellules infectées utilisées pour la reprogrammation, qui ont été personnalisées pour chaque type de cellule.
En résumé, une méthode optimisée de reprogrammation des cellules primaires PDAC avec d’autres lignées cellulaires et cellules normales est présentée. Cette méthode permettra d’étendre l’utilisation de la reprogrammation des iPSC pour modéliser la progression du cancer et, dans ce cas, découvrir des biomarqueurs précoces du PDAC.

L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est l’une des tumeurs malignes les plus mortelles, et le diagnostic précoce reste difficile en raison de la nature asymptomatique de la maladie. La majorité des patients atteints de PDAC sont diagnostiqués au stade métastatique avancé lorsque les options de traitement disponibles sont très limitées 1,2. Cela est principalement dû au manque de biomarqueurs fiables pour les stades précoces, tels que ceux qui pourraient être facilement détectés comme des protéines libérées dans la circulation sanguine.
Le PDAC peut se disséminer très tôt au cours de sa progression, et un meilleur pronostic a été associé à la détection précoce du cancer lorsque le PDAC est localisé dans le pancréas3. Cependant, moins d’un dixième des patients atteints de PDAC reçoivent un diagnostic de pronostic favorable, ce qui permet une résection chirurgicale. Néanmoins, les quelques personnes atteintes de tumeurs résécables sont également sujettes à une récidive tumorale dans les 12 mois4.
Au cours des cinq dernières décennies, des améliorations remarquables ont été apportées aux techniques chirurgicales, aux soins aux patients et aux modalités de traitement 5,6. Cependant, le taux de survie à 5 ans chez les patients PDAC réséqués chirurgicalement a à peine atteint 17 %. Néanmoins, cela reste meilleur que celui des patients non réséqués, qui est resté pratiquement inchangé (0,9 %)4,7. La chimiothérapie est le seul autre traitement alternatif du PDAC. Cependant, cette option est très limitée car la grande majorité des patients atteints de PDAC présentent une forte résistance aux médicaments de chimiothérapie tels que la gemcitabine 7,8. D’autres médicaments, comme l’erlotinib, ne sont disponibles que pour un petit groupe de patients atteints de PDAC présentant des mutations spécifiques, dont la plupart présentent une résistance à l’erlotinib9. Les effets secondaires indésirables associés à la chimiothérapie chez la plupart des patients PDAC sont un autre inconvénient de ce traitement10. Récemment, des stratégies prometteuses ont montré que les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (ICI) et les inhibiteurs de kinases à petites molécules (SMKI) peuvent être efficaces dans le traitement du PDAC, mais les réponses durables à ces thérapies ciblées restent limitées à une minorité de patients11,12. Dans l’ensemble, la découverte de biomarqueurs précoces spécifiques au PDAC peut ouvrir de nouvelles voies pour un diagnostic et un traitement précoces.
Le PDAC se développe à partir de lésions précurseurs de néoplasmes intra-épithéliales pancréatiques (PanIN) qui résultent de proliférations épithéliales non invasives du canal pancréatique13,14. Bien que la formation de PanIN soit initiée par des mutations oncogènes telles que KRAS, des altérations génétiques et épigénétiques supplémentaires sont nécessaires pour la progression vers le PDAC. Il a été prévu que la progression du PanIN à travers les différentes étapes vers le PDAC invasif prend environ 10 ans 13,15,16,17. Ce délai offre une excellente occasion de bénéficier d’un diagnostic précoce de l’ACPE. Par conséquent, des recherches approfondies ont été menées pour établir des modèles animaux de xénogreffes tumorales et des cultures d’organoïdes afin d’étudier la progression du PDAC 18,19,20,21. Ces modèles ont été très utiles pour étudier les stades invasifs du PDAC, mais pas la transition des premières phases de PanIN. Il est donc important de développer des modèles expérimentaux capables de récapituler la progression précoce des stades PanIN pour permettre la découverte de biomarqueurs de détection précoce.
La reprogrammation des cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à l’aide des quatre facteurs de transcription OCT4, SOX2, KLF4 et c-MYC (OSKM) a illustré l’étendue de la plasticité cellulaire22. La plasticité des cellules cancéreuses a été bien documentée, et la reprogrammation des cellules cancéreuses humaines en iPSC a été utilisée avec succès pour réinitialiser les cellules à leur état cellulaire d’origine, éliminant ainsi de nombreuses agressions épigénétiques qui se sont accumulées au cours de la progression du cancer 23,24,25,26,27,28,29. La possibilité d’utiliser cette stratégie de reprogrammation pour manipuler l’identité des cellules cancéreuses s’est donc révélée très prometteuse dans le traitement du cancer30,31. En effet, nous avons précédemment montré que la différenciation des iPSC dérivées des PDAC peut récapituler la progression du PDAC à travers les premiers stades PanIN32. En identifiant les gènes et les voies spécifiques aux stades précoces et intermédiaires du PDAC, des biomarqueurs candidats ont été identifiés qui peuvent être utilisés cliniquement pour le diagnostic précoce du PDAC32,33. Cependant, les biomarqueurs découverts à l’aide d’une seule lignée d’iPSC ont montré une couverture limitée chez la majorité des patients atteints de PDAC32. Les défis liés à la génération de lignées iPSC à partir d’autres patients PDAC ont mis fin à la capacité de découvrir des biomarqueurs plus fiables. Cela est dû à de nombreux facteurs techniques, notamment l’hétérogénéité de l’administration d’OSKM, car seule une petite partie des cellules primaires humaines du PDAC contenait les quatre facteurs et répondait avec succès à la reprogrammation. Ici, un protocole détaillé est présenté pour reprogrammer les cellules primaires PDAC en utilisant une double administration lentivirale plus efficace et cohérente d’OSKM.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoéthanol (50 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-humain TRA-1-60-R</td><td>BioLegend</td><td>330613</td><td></td></tr><tr><td>Extrait hypophysaire bovin (BPE)</td><td>Thermo Fisher</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BxPc3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td></td></tr><tr><td>Toxine cholérique de Vibrio cholerae</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Collagène, solution de type I à partir de la queue de rat</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Terminé défini K-SFM</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp ; 10744-019</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC Plaques à puits multiples</td><td>Merck&nbsp ;</td><td></td><td></td>CLS3516</tr><tr><td>Filtres pour seringues</td><td>Corning Merck&nbsp ;</td><td></td><td></td>CLS431231</tr><tr><td>Boîtes de culture traitées à la culture tissulaire Corning</td><td>Merck&nbsp ;</td><td></td><td></td>CLS430599</tr><tr><td>jour Impex&nbsp ; Virkon Désinfectant Virucide Pastilles</td><td>Thermo Fisher</td><td>12328667</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime ; s Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (SCF)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de transfection Fugene HD&nbsp ;</td><td>Promega&nbsp ;</td><td>&nbsp ; E2312</td><td></td></tr><tr><td>Solution de gélatine, type B, 2 % dans H2O</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Média minimum essentiel Glasgow (GMEM)</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>Protéine recombinante EGF humaine</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic humain (FGF-2/bFGF) (154 aa) Protéine recombinante, PeproTech</td><td>Thermo Fisher</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Lignée cellulaire épithéliale du canal pancréatique humain (H6c7)</td><td>Kerafast</td><td>ECA001-FP</td><td></td></tr><tr><td>Cellules nourricières iMEF&nbsp ;</td><td>iXcells Biotechnologies</td><td>10MU-001-1V</td><td></td></tr><tr><td>Milieux sans sérum de kératinocytes (KSFM)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut sérum de remplacement&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HP 0.45 &mu ; Unité de filtration de seringue M (stérile)</td><td>Merck&nbsp ;</td><td></td><td></td>SLHP033RS</tr><tr><td>Opti-MEM Sérum Réduit Medium&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>pMDG&nbsp ;</td><td>AddGene</td><td>187440</td><td></td></tr><tr><td>Polybrène (bromure d’hexadiméthrine)&nbsp ;</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-CMV-K2M&nbsp ;</td><td>AddGene</td><td>21164</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF2-O2S&nbsp ;</td><td>AddGene</td><td>21162</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>AddGene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pWPT-GFP&nbsp ;</td><td>AddGene</td><td>12255</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (modification ATCC)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1049101</td><td></td></tr><tr><td>Sodym Pyruvate</td><td></td><td></td> Seringues <td></td></tr><tr><td>stériles à usage unique (60 mL)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15899152</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), rouge de phénol</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (dichlorhydrate)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr></tbody></table>

reprogrammation de l’adénocarcinome canalaire pancréatique à la pluripotence

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

La génération de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) à l’aide de facteurs de transcription a été réalisée à partir de presque tous les types de cellules différenciées et s’est avérée très précieuse pour la recherche et les applications cliniques. Il est intéressant de noter que la reprogrammation des cellules cancéreuses par iPSC, comme l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC), inverse le phénotype invasif du PDAC et remplace l’épigénome du cancer. La différenciation des iPSC dérivées du PDAC peut récapituler la progression du PDAC à partir de son précurseur précoce de la néoplasie intra-épithéliale pancréatique (PanIN), révélant les changements moléculaires et cellulaires qui se produisent tôt au cours de la progression du PDAC. Par conséquent, les iPSC dérivées du PDAC peuvent être utilisées pour modéliser les premiers stades du PDAC pour la découverte de marqueurs diagnostiques de détection précoce. Ceci est particulièrement important pour les patients atteints de PDAC, qui sont généralement diagnostiqués aux stades métastatiques tardifs en raison d’un manque de biomarqueurs fiables pour les stades antérieurs de PanIN. Cependant, la reprogrammation des lignées cellulaires cancéreuses, y compris le PDAC, en pluripotence reste difficile, laborieuse et très variable entre les différentes lignées. Ici, nous décrivons un protocole plus cohérent pour générer des iPSC à partir de diverses lignées cellulaires PDAC humaines à l’aide de vecteurs lentiviraux bicistroniques. Les lignées iPSC résultantes sont stables, ne montrant aucune dépendance à l’expression exogène de facteurs de reprogrammation ou de médicaments inductibles. Dans l’ensemble, ce protocole facilite la génération d’un large éventail d’iPSC dérivées du PDAC, ce qui est essentiel pour découvrir des biomarqueurs précoces plus spécifiques et représentatifs des cas de PDAC.

Des images représentatives montrant la morphologie des colonies d’iPSC dérivées de cellules PDAC, BXPc3, H6C7 et hFib sont présentées à la figure 1. Les colonies PDAC-iPSC ont commencé à se former au jour 25 de la reprogrammation. Des colonies de CSPi robustes avec une morphologie plus établie de type ESC ont été identifiées au jour 40 de la reprogrammation (Figure 1). De même, la formation des CSPi BxPc3 a commencé le 23e jour et s’est établie au 35e jour. La formation des CSPi H6C7 était similaire à celle des CSPi du CADPE et a commencé à s’établir au jour 45. Les colonies de hFib-iPSC ont commencé à se former au jour 15 de la reprogrammation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figure 1 : Images représentatives des colonies d’iPSC. Les images montrent une morphologie établie de type CSEh dérivée de (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 et (D) hFib. Les jours de reprogrammation sont indiqués au-dessus de chaque image. Barres d’échelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a> 
Des lignées clonales d’iPSC ont été établies à partir de chaque reprogrammation de cellules PDAC, BxPc3, H6C7 et hFib. Toutes les lignées iPSC établies ont été colorées positives pour TRA-1-60, un marqueur de surface cellulaire hESC indifférencié, confirmant leur reprogrammation en pluripotence (Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig2.jpg"> Figure 2 : Images représentatives des lignées iPSC clonales. Les images sont dérivées de (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 et (D) hFib montrant une morphologie de type ESC (panneaux supérieurs) et une coloration positive pour TRA-1-60 (panneau inférieur). Barres d’échelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Le présent protocole décrit la reprogrammation de l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) et des cellules épithéliales canalaires pancréatiques normales en cellules souches pluripotentes induites (CSPi). Nous fournissons une procédure optimisée et détaillée, étape par étape, de la préparation du lentivirus à l’établissement de lignées iPSC stables.

Reprogrammation de l’adénocarcinome canalaire pancréatique à la pluripotence

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