Ex Vivo Imagerie calcique pour le modèle d’épilepsie de la drosophile
13 octobre 2023
Nous présentons ici un protocole d’imagerie calcique ex vivo chez la drosophile adulte exprimant GCaMP6 pour surveiller les activités épileptiformes. Le protocole fournit un outil précieux pour étudier les événements ictaux chez la drosophile adulte par imagerie calcique ex vivo , permettant d’explorer les mécanismes potentiels de l’épilepsie au niveau cellulaire.
Récemment, de nombreux gènes candidats à l’épilepsie ont été trouvés dans des tests génétiques, puis facilement par des expériences sur des animaux. Nous proposons un ensemble de techniques permettant d’étudier l’activité neuronale liée à l’épilepsie, notamment l’enregistrement de cellules entières, l’enregistrement EPSP évoqué et la nouvelle que nous allons présenter ici, l’imagerie calcique ex vivo. Étant donné que l’intégrité du cerveau et de ses réseaux neuronaux ne peut pas être entièrement répliquée dans des cultures cellulaires ou des tranches de cerveau, le principal avantage de l’expérience actuelle est d’obtenir des tissus cérébraux intacts tout en protégeant les réseaux neuronaux des dommages.
Nous avons mis au point une technique d’imagerie calcique ex vivo ainsi qu’un test de comportement de type crise sensible à la bande pour dépister efficacement les gènes associés à l’épilepsie et explorer les mécanismes sous-jacents de l’épilepsie au niveau cellulaire. Nous avons mis en œuvre des tissus cérébraux de drosophiles isolés et intacts pour l’imagerie calcique, ce qui permet d’éviter leurs techniques chirurgicales complexes et de préserver l’intégrité des réseaux neuronaux. Et l’approche ex vivo peut également donner un rapport signal sur bruit supérieur par rapport aux techniques d’imagerie in vivo.
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Aperçu
Cette étude présente un protocole d'imagerie calcique ex vivo chez des adultes de Drosophila exprimant GCaMP6 afin d'étudier les activités épileptiformes. La méthode vise à surveiller les événements ictaux chez Drosophila, offrant ainsi des aperçus sur les mécanismes cellulaires sous-jacents à l'épilepsie.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Recherche sur l'épilepsie
- Imagerie calcique
Contexte
- Les gènes candidats de l'épilepsie nécessitent une validation au moyen de modèles animaux.
- Les techniques ex vivo conservent les réseaux neuronaux intacts, essentiels pour l'étude de l'épilepsie.
- L'imagerie calcique offre une qualité de signal supérieure par rapport aux approches in vivo.
- Drosophila constitue un organisme modèle pertinent pour les études d'activité neurologique.
Objectif de l'étude
- Développer des techniques d'imagerie calcique ex vivo chez Drosophila.
- Analyser les gènes associés à l'épilepsie et étudier les mécanismes neuronaux sous-jacents.
- Mesurer quantitativement les comportements de type crise épileptique.
Méthodes utilisées
- La principale plateforme utilisée est l'imagerie calcique ex vivo avec des tissus cérébraux de Drosophila intacts.
- Le modèle biologique est constitué de Drosophila adultes exprimant GCaMP6.
- Des protocoles détaillés pour la dissection du cerveau, le montage d'imagerie et l'analyse des données sont fournis.
- Des tests comportementaux pour évaluer une activité de type crise ont été utilisés.
- Des mesures quantitatives telles que les intensités de fluorescence ont été analysées à l'aide d'ImageJ.
Résultats principaux
- Des signaux calciques ont été observés dans les neurones du corps en crochets, en portant une attention particulière aux différences entre les mouches avec gène inhibé et les mouches de type sauvage.
- Les mouches avec inhibition de Cac ont présenté une activité de type épileptique significativement plus importante et des temps de récupération modifiés.
- Les données de fluorescence indiquent une augmentation des pics importants dans le groupe avec gène inhibé, fournissant ainsi des indices mécanistiques sur l'épilepsie.
Conclusions
- Ce protocole permet aux chercheurs d'étudier les mécanismes des crises chez Drosophila, facilitant la validation de gènes dans la recherche sur l'épilepsie.
- La compréhension des profils de signalisation calcique fournit des informations sur l'excitabilité neuronale et sur des cibles thérapeutiques potentielles.
- Les résultats enrichissent les connaissances sur les mécanismes de l'épilepsie grâce à une approche d'imagerie robuste.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'imagerie calcique ex vivo chez Drosophila exprimant GCaMP6 permet une interrogation fonctionnelle directe des gènes associés à l'épilepsie au sein de réseaux neuronaux intacts. Cette approche renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles en corrélant les perturbations génétiques à une activité neuronale quantifiable et à des comportements semblables à des crises épileptiques. La méthode soutient les décisions précoces de portefeuille en fournissant des éclairages mécanistiques sur les voies pertinentes pour la maladie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet la validation fonctionnelle de gènes candidats d'épilepsie dans un modèle génétiquement accessible.
- Permet une réduction du risque mécanistique en reliant l'extinction du gène à des modifications de l'activité neuronale.
- Facilite l'élucidation des voies grâce à l'imagerie quantitative de circuits neuronaux intacts.
- Offre une confiance prédictive pour la progression des cibles génétiques dans les troubles neurologiques.
Développement de criblages et de tests
- Établit une plateforme reproductible pour analyser les effets des gènes pathogènes sur l'activité neuronale.
- Fournit des données quantitatives telles que la fréquence des potentiels d'action et l'intensité de fluorescence pour la standardisation des tests.
- Prépare des systèmes biologiques validés pour des protocoles de criblage de composés ou de criblage génétique en aval.
- Permet une comparaison fiable des phénotypes de type sauvage et mutés dans un environnement ex vivo contrôlé.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les schémas d'activité neuronale pertinents pour la maladie avec les phénotypes comportementaux afin d'assurer une continuité translationnelle.
- Permet une progression ajustée au risque en corrélant les mécanismes cellulaires aux comportements convulsifs observables.
- Constitue un pont entre la découverte génétique et la validation de modèles précliniques dans la recherche sur l'épilepsie.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole d'imagerie ex vivo s'intègre dans la continuité de la découverte, depuis la validation de la cible jusqu'aux études mécanistiques précliniques, en soutenant à la fois la vérification des hypothèses et le phénotypage quantitatif.
- Biologie de la découverte : Permet l'interrogation fondée sur des hypothèses de la fonction des gènes dans les circuits neuronaux liés à l'épilepsie.
- Écrantage : Fournit des mesures quantitatives normalisées pour comparer des interventions génétiques ou pharmacologiques.
- Analytique : Produit des données mesurables telles que la classification des potentiels d'action et l'intensité de fluorescence, permettant une analyse statistique rigoureuse.
- Recherche translationnelle : Relie les modifications de l'activité cellulaire aux phénotypes comportementaux des crises, facilitant l'alignement des biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme évolutive et réutilisable pour l'écrantage de génomique fonctionnelle et d'activité neurologique sur diverses cibles géniques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Standardise les tests d'activité neuronale pour assurer la reproductibilité et l'évolutivité en phase précoce de découverte.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'avancement ou d'abandon en reliant les perturbations génétiques à des résultats neuronaux quantifiables.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des gènes cibles de l'épilepsie en vue de développements ultérieurs.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en génétique de Drosophila et en techniques d'imagerie confocale.
- Exige un accès à la microscopie confocale et à des outils d'analyse quantitative d'images.
- Implique une standardisation inter-équipes de la classification des potentiels d'action et des tests comportementaux.
- L'adaptation à d'autres systèmes modèles peut nécessiter une optimisation du protocole en fonction de l'intégrité des tissus et des paramètres d'imagerie.
- L'interprétation est limitée aux circuits neuronaux et aux comportements modélisés chez Drosophila, tels qu'autorisés par le protocole.
