Name: Optimisation de l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tumeurs solides fraîches et congelées pour le séquençage multiome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T12:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 49 s
Description: Découvrez une méthode optimisée pour isoler les noyaux à partir de tumeurs solides fraîches ou congelées destinées au séquençage multiome. Ce protocole améliore la qualité des données et facilite l'analyse du microenvironnement tumoral.

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Nous tenons à remercier le Stanford Functional Genomics Facility (SFGF), en particulier Dhananjay Wagh et John Coller, ainsi que 10x Genomics pour leur aide dans l’optimisation de nos expériences. Nous tenons également à remercier les Drs George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser et Byrne Lee pour leur aide dans l’acquisition d’échantillons de patients. Nous tenons à remercier Art et Elaine Taylor, la Fondation Rantz, ainsi que Warren et Judy Kaplan pour leur généreux soutien à nos efforts de recherche. Les sources de financement comprennent les subventions des NIH 1F32CA23931201A1 (D.S.F.), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L), la Fondation Goldman Sachs (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), la Fondation Damon Runyon pour la recherche sur le cancer (D.D., M.T.L.), le Fonds Gunn/Olivier, le California Institute for Regenerative Medicine, la Fondation Stinehart/Reed et le Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine. Le séquençage a été obtenu à l’aide de machines achetées avec des fonds du NIH (S10OD025212, S10OD018220 et 1S10OD01058001A1).

Des échantillons de cancer du pancréas humain (adénocarcinome canalaire pancréatique) ont été prélevés dans notre laboratoire selon un protocole approuvé par l’IRB. Le consentement éclairé des patients a été obtenu pour le prélèvement de tissus. Les tissus ont été transportés de la salle d’opération au laboratoire, puis traités comme suit.
1. Dissociation tissulaire (digestion)
<ol><li>Préparez le tampon de synthèse (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Obtenir le tissu d’intérêt dès que possible après l’exérèse de la tumeur et transporter l’échantillon dans un tampon de trempe (DMEM F-12 avec ~5% de sérum de veau fœtal) ou 1x PBS sur glace.</li>
	<li>Hacher le tissu à l’aide d’une pince propre et de ciseaux dans 3 à 5 mL de tampon de digestion dans une boîte de Pétri de 90 mm (Figure 2A).</li>
	<li>Transférez le tissu haché dans un tube conique de 50 mL et dissociez-le dans ~10 mL de tampon digéré pendant 30 min à 37 °C à l’aide d’un bain-marie avec fonction d’agitation ou d’un agitateur sec.</li>
	<li>Retirer de l’agitateur et tremper avec ~20 mL de milieu de trempe. Filtrez la solution à travers une crépine cellulaire de 100 μm dans un tube conique propre.</li>
	<li>Récupérez les tissus solides restants de la passoire (émincez à nouveau les morceaux de tissu restants si nécessaire) et placez-les dans ~10 mL de tampon Digest frais pendant encore 30 minutes à 37 °C en agitant. Répétez l’opération jusqu’à ce que tout le tissu tumoral ait été dissocié.</li>
	<li>Aliquotes de suspension de cellules de piscine et filtre à travers une crépine de 70 μm suivie d’une crépine de cellules de 40 μm dans un tube conique propre sur de la glace.</li>
	<li>Centrifuger dans des cellules à granulés à 500 × g pendant 5 min à 4 °C, puis décanter le surnageant.</li>
</ol>2. Cryoconservation
<ol><li>Rincez les cellules en remettant la pastille en suspension dans 1 mL de PBS 1x.</li>
	<li>Transférez la suspension cellulaire (~1 à 10 millions de cellules/tube pour une congélation optimale) dans un flacon cryogénique de 1,5 ml sur glace.</li>
	<li>Centrifuger dans des cellules à granulés à 500 × g pendant 5 min à 4 °C, puis décanter le surnageant.</li>
	<li>Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de solution de Bambanker, les transférer dans un flacon cryogénique de 1,5 ou 2 mL (figure 2B) et les congeler à l’aide d’un récipient de congélation à vitesse de refroidissement de -1 °C/min (contenant de l’alcool isopropylique à 100 %) à -80 °C, ou les transférer à l’azote liquide si l’on prévoit un stockage à plus long terme de l’échantillon.</li>
</ol>3. Isolement des noyaux
<ol><li>Décongelez rapidement le cryofiole de suspension cellulaire et placez-le sur de la glace humide.</li>
	<li>Transférez la suspension cellulaire décongelée dans un tube de microcentrifugation de 2 mL et complétez le flacon dans une solution de 2 mL avec 1x PBS pour rincer les cellules.</li>
	<li>Obtenir une numération cellulaire manuelle à l’aide d’un hémocytomètre pour évaluer à la fois la quantité et la qualité des cellules (figure 2C).</li>
	<li>Centrifuger sur des cellules à granulés à 500 × g pendant 5 min à 4 °C, puis décanter doucement le surnageant à l’aide d’embouts de pipette de plus en plus petits pour laisser une pastille sèche et la maintenir sur de la glace.<ol><li>Utilisez un rotor à godets oscillants pour toutes les étapes de centrifugation. Pour un rendement maximal des cellules, placez les tubes dans la centrifugeuse avec la charnière tournée vers l’extérieur, puis décantez avec l’embout de pipette dirigé vers le côté opposé du tube (Figure 2D). REMARQUE : Pour décanter le surnageant, utilisez des pointes de pipette de plus en plus petites pour éliminer le liquide afin de limiter la perturbation de la pastille tout en maximisant le volume de fluide décanté. Cette stratégie est particulièrement utile plus tard dans le protocole suivant l’extraction des noyaux, car la pastille des noyaux n’est généralement pas visible.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez 1x tampon de lyse cellulaire, tampon de dilution de lyse cellulaire et tampon de lavage (Figure 3A) selon le protocole publié avec les modifications suivantes (voir Tableau 1, Tableau des matériaux) : REMARQUE : Placez la digitonine sur un bloc chauffant à 65 °C avant utilisation pour dissoudre le précipité (Figure 3B). Cela prend généralement environ 10 minutes.</li>
	<li>Préparez le tampon de lyse cellulaire 0,1x en combinant 100 μL de tampon de lyse cellulaire 1x et 900 μL de tampon de dilution de lyse cellulaire, pipetez doucement pour mélanger et placez-le sur de la glace.</li>
	<li>Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL de tampon de lyse cellulaire 0,1x refroidi et pipeter doucement pour mélanger 5x.</li>
	<li>Incuber sur de la glace pendant 3 minutes (figure 3C).</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon de lavage réfrigéré et pipeter de haut en bas pour mélanger délicatement 5 fois.</li>
	<li>Centrifuger pour granuler les noyaux à 500 × g pendant 5 min à 4 °C, décanter doucement le surnageant en pastille sèche et maintenir sur glace. REMARQUE : Si le nombre de cellules de départ est faible (100 000 à 200 000 cellules), effectuez les étapes de lyse et de lavage des cellules dans un tube PCR de 200 μL au lieu d’un tube de microcentrifugation de 2 mL pour réduire la surface du tube et minimiser les pertes. Dans ce cas, ajustez le volume du tampon de lavage vers le bas pour s’adapter au plus petit volume du tube.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.9-3.10 2x pour un total de trois lavages.</li>
	<li>Comptez manuellement les noyaux à l’aide d’une lame d’hémocytomètre sous le microscope. Utilisez un colorant bleu trypan si vous le souhaitez pour fournir un contraste permettant de visualiser les noyaux et d’aider à distinguer les noyaux des cellules non lysées.</li>
	<li>Préparez le tampon 1x noyaux selon le protocole publié : 20x stock tampon de noyaux, 1 mM DTT, 1 inhibiteur U/μL de la RNase dans de l’eau sans nucléase et conservez-le sur glace (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Remettre en suspension la pastille de noyaux dans 1x Nuclei Buffer en fonction de la récupération des noyaux ciblés sur l’objectif. NOTA : Si la concentration est suffisamment élevée, viser une récupération ciblée de 10 000 ou légèrement plus à cette étape (3 230 à 8 060 noyaux/μL) lors de la détermination du volume de remise en suspension de départ, compte tenu de la perte de volume prévue de 25 μL et de la diminution de 20 % de la concentration avec filtration (étape 3.15).</li>
	<li>Passez doucement le volume des noyaux remis en suspension à travers une crépine cellulaire à pointe de pipette de 40 μm et placez les noyaux sur de la glace (Figure 3D).</li>
	<li>Comptez les noyaux (Figure 4A-C). Diluez davantage la solution finale avec Nuclei Buffer si nécessaire.</li>
	<li>Transportez les noyaux sur de la glace et procédez immédiatement à la capture des noyaux selon les protocoles publiés.</li>
</ol>

Isolement de noyaux pour le séquençage de multiomes dans un échantillon de tumeur solide

<ol><li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+and+spatial+transcriptomics+reveal+cancer-associated+fibroblasts+in+glioblastoma+with+protumoral+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects.</a> J Clin Invest. 133 (5), e147087(2023).</li>
<li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+advancing+our+understanding+of+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts.</a> Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).</li>
<li>Foster, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiomic+analysis+reveals+conservation+of+cancer-associated+fibroblast+phenotypes+across+species+and+tissue+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiomic analysis reveals conservation of cancer-associated fibroblast phenotypes across species and tissue of origin.</a> Cancer Cell. 40 (11), 1392-1406 (2022).</li>
<li>Hasan, S., Buechler, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+in+a+name%3F+An+emerging+framework+for+cancer-associated+fibroblasts%2C+myofibroblasts%2C+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">What's in a name? An emerging framework for cancer-associated fibroblasts, myofibroblasts, and fibroblasts.</a> Cancer Cell. 40 (11), 1273-1275 (2022).</li>
<li>Nuclei isolation from complex tissues for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).</li>
<li>Nuclei isolation from embryonic mouse brain tissue for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).</li>
<li>Januszyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+diabetic+and+non-diabetic+foot+ulcers+using+single-cell+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Characterization of diabetic and non-diabetic foot ulcers using single-cell RNA-sequencing.</a> Micromachines (Basel). 11 (9), 815(2020).</li>
<li>Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+relationship+of+wound+healing+and+tumor+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">The evolving relationship of wound healing and tumor stroma.</a> JCI Insight. 3 (18), e99911(2018).</li>
<li>Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+of+multiple+brain+cell+types+for+omics+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).</li>
<li>Foster, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+spatial+multiomics+reveals+fibroblast+fate+during+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118(2021).</li>
<li>Leiz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+adult+mouse+kidney+for+single-nucleus+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing.</a> J Vis Exp. (175), (2021).</li>
<li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+fresh+frozen+brain+tumors+for+single-nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> J Vis Exp. (162), e61542(2020).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Démêler les populations cellulaires hétérogènes présentes dans le microenvironnement tumoral est un domaine d’intérêt actif en biologie du cancer. De même, des tissus complexes existent dans les pathologies bénignes telles que la cicatrisation des plaies et la fibrose. Le séquençage multiome est apparu comme un outil puissant permettant l’acquisition de données de séquençage de l’ARNsc et de l’ATAC appariés de cellules identiques. Ce protocole décrit l’isolement des noyaux, ce qui exige une optimisation dans le cadre du ...

Au fur et à mesure que nos connaissances sur la biologie des tumeurs augmentent, l’importance de l’analyse des cellules hétérogènes dans le microenvironnement tumoral a également augmenté 1,2. La possibilité d’acquérir de l’ARN unicellulaire et le dosage de la chromatine accessible par transposase avec des données de séquençage (séquençage ATAC) à partir de la même cellule à la manière d’une cellule appariée (séquençage multiome) constitue une avancée significative vers cette fin 3,4. Cependant, ces expériences sont coûteuses et prennent beaucoup de temps, et la qualité et l’impact des données acquises dépendent fortement de la qualité des conditions expérimentales et des matériaux. Des protocoles normalisés pour l’isolement des noyaux ont été publiés 5,6. Les tissus frais et hétérogènes nécessitent une optimisation du protocole, car les cellules fraîchement isolées à partir d’échantillons de tumeurs solides sont plus fragiles que celles isolées à partir de lignées cellulaires.
Une autre considération est que pour les tumeurs solides, les échantillons chirurgicaux ne sont souvent pas disponibles de la salle d’opération avant la fin de la journée. Ainsi, il n’est généralement pas possible de passer directement de l’acquisition de l’échantillon à la capture des noyaux sans une étape de cryoconservation. D’après notre expérience, la congélation d’une suspension unicellulaire permet d’obtenir des noyaux de la plus haute qualité (plutôt que des tissus entiers surgelés ou d’autres modalités de conservation). Cela est particulièrement vrai pour les types de tissus enzymatiques à forte teneur en RNase tels que le pancréas.
Les conditions de digestion des tissus doivent également être conçues pour maximiser le rendement cellulaire sans sacrifier la qualité7. Dans le contexte des types de tumeurs solides avec des matrices desmoplastiques denses8, la matrice extracellulaire doit être décomposée en douceur pour la libération cellulaire. De plus, étant donné que les types de cellules isolées sont hétérogènes, les conditions doivent être ajustées pour soutenir la population cellulaire totale. Des échantillons de cancer du pancréas humain (adénocarcinome canalaire pancréatique) sont utilisés dans le protocole décrit. Le cancer du pancréas représente un type de tumeur hautement desmoplastique, ce qui laisse présager des tissus et des cellules relativement collants. De plus, comme les échantillons de tumeurs pancréatiques disponibles pour la recherche ont également tendance à être relativement petits, des efforts sont faits pour maximiser la quantité de cellules capturées.
L’isolement des noyaux nécessite le plus d’optimisation en termes de conditions et de temps de lyse cellulaire, ainsi que de types et de ratios de réactifs. La manipulation des noyaux au cours de l’isolement nécessite également une grande prudence. Dans cet article, nous décrivons notre expérience dans l’optimisation de l’isolement nucléaire pour la plateforme de séquençage multiome 10x Genomics à partir de tissus tumoraux solides (Figure 1). Nous fournissons des recommandations pour la digestion des tissus, la cryoconservation des suspensions unicellulaires (si vous le souhaitez) et l’isolement nucléaire.

<table><tbody><tr><td>100, 70 et 40 &mu ; m Crépines à cellules Falcon&nbsp ;</td><td>&nbsp ; ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Genomics Nuclei Buffer (20x)</td><td>10x Genomics</td><td>2000153/2000207</td><td></td></tr><tr><td>Bambanker&nbsp ;</td><td>Wako, Fisher Scientitic</td><td>NC9582225&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de calcium Sigma Aldrich</td><td>499609</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase (Collagénase Type IV)</td><td>ThermoFisher</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Thermo Fisher</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington</td><td>LS006330</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium F-12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal</td><td>Thermo Fisher</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>Flowmi 40 &mu ; m&nbsp ; Passoire à cellules d’embout de pipette&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BAH136800040</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1119 Solution de séparation cellulaire à gradient</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2520</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi GentleMACSTM digest kit&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Cryo « Mr. Frosty » Conteneur de congélation</td><td>&nbsp ; ThermoFisher</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Nonident P40 Substitut</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 188</td><td>Sigma</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la RNASE&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher</td><td>85113</td><td></td></tr></tbody></table>

optimisation de l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tumeurs solides fraîches et congelées pour le séquençage multiome

Optimized Nuclei Isolation from Fresh and Frozen Solid Tumor Specimens for Multiome Sequencing

Le séquençage multiome, qui fournit des données de séquençage (séquençage ATAC), qui fournit des données de séquençage de l’ARN unicellulaire identique ou apparié et le test de la chromatine accessible par transposase (séquençage ATAC), représente une percée dans notre capacité à discerner l’hétérogénéité des cellules tumorales, un objectif principal de la recherche translationnelle sur le cancer à l’heure actuelle. Cependant, la qualité des données de séquençage acquises à l’aide de cette modalité avancée dépend fortement de la qualité du matériau d’entrée. 
Les conditions de digestion doivent être optimisées pour maximiser le rendement cellulaire sans sacrifier la qualité. Ceci est particulièrement difficile dans le contexte des tumeurs solides avec des matrices desmoplastiques denses qui doivent être décomposées doucement pour la libération cellulaire. Les cellules fraîchement isolées du tissu tumoral solide sont plus fragiles que celles isolées des lignées cellulaires. De plus, comme les types de cellules isolées sont hétérogènes, les conditions doivent être sélectionnées pour soutenir la population cellulaire totale. 
Enfin, les conditions d’isolement nucléaire doivent être optimisées en fonction de ces qualités en termes de temps de lyse et de types/ratios de réactifs. Dans cet article, nous décrivons notre expérience de l’isolement nucléaire pour la plate-forme de séquençage multiome 10x Genomics à partir d’échantillons de tumeurs solides. Nous fournissons des recommandations pour la digestion des tissus, le stockage des suspensions unicellulaires (si désiré), ainsi que l’isolement et l’évaluation nucléaires.

Pour isoler des noyaux de haute qualité à partir d’échantillons de tumeurs solides de patients pour le séquençage multiome (Figure 1), le tissu tumoral a été dissocié et une suspension unicellulaire a été cryopréservée (Figure 2A-D). La suspension cellulaire a ensuite été décongelée au moment de la capture planifiée du multiome. La capture des noyaux a été effectuée à l’aide de réactifs tampons de lyse et d’un timing optimisés a...

Le protocole fournit une approche fiable et optimisée de l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tumeurs solides pour le séquençage multiome à l’aide de la plate-forme 10x Genomics, y compris des recommandations pour les conditions de dissociation des tissus, la cryoconservation des suspensions unicellulaires et l’évaluation des noyaux isolés.

Optimisation de l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tumeurs solides fraîches et congelées pour le séquençage multiome

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) ...

Au fur et à mesure que nos connaissances sur la biologie des tumeurs se développent et que nous nous intéressons à la compréhension des subtilités de la façon dont les cellules interagissent au sein de la tumeur et influencent les résultats des patients, l’importance de l’analyse des cellules hétérogènes dans le microenvironnement tumoral a également augmenté. Le séquençage multiome, qui permet l’acquisition d’ARN d’une seule cellule et le séquençage d’attaque à partir de la même cellule de manière appariée, constitue une avancée significative vers cette fin. Cependant, la qualité des données obtenues à partir de ces expériences dépend fortement de la qualité des conditions expérimentales et du matériel biologique introduit.Ce protocole fournit une approche fiable et optimisée de l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tumeurs solides pour le séquençage multiome à l’aide de la plateforme 10x Genomics. Ce protocole est fiable en utilisant des suspensions unicellulaires fraîches ou congelées. Nous fournissons des recommandations pour les conditions de dissociation des tissus, la cryoconservation des suspensions de cellules uniques et l’évaluation des noyaux isolés.Dans ce p

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Cette vidéo décrit le protocole permettant d’isoler des noyaux uniques à partir de tissus de gliome fraîchement congelés. Les noyaux uniques isolés peuvent être utilisés comme échantillons pour des techniques de séquençage telles que le séquençage de l’ARN à noyaux uniques (snRNA) et le dosage des noyaux uniques pour le séquençage de la chromatine accessible à la transposase (snATAC) afin d’obtenir des informations plus approfondies sur l’hétérogénéité inter- et intra-tumorale observée dans le...

Isolement de noyaux à partir de tissus de gliome frais congelés : une méthode pour obtenir des noyaux intacts à partir d’échantillons de tumeurs de gliome

L’hétérogénéité intratumorale est une caractéristique inhérente aux tumeurs, y compris les gliomes. Nous avons développé un protocole simple et efficace qui utilise une combinaison de tampons et de centrifugation par gradient pour isoler des noyaux uniques à partir de tissus de gliome frais congelés pour des études de séquençage de l’ARN à noyau unique et de l’ATAC.

Isolement des noyaux à partir de tumeurs cérébrales fraîchement congelées pour l’ARN-seq à noyau unique et ATAC-seq

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