Name: Isolement intestinal de larves de poisson-zèbre pour le séquençage de l’ARN unicellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Découvrez un protocole d'isolement cellulaire intestinal chez les larves de Danio rerio pour le séquençage ARN unicellulaire. Cette méthode permet d'étudier le développement gastro-intestinal et les dysfonctionnements associés.

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Ce travail a été financé par les amis de la Fondation Sophia (SSWO WAR-63).

Tous les élevages et expériences de poissons-zèbres ont été menés conformément aux directives institutionnelles du programme Erasmus MC et à la législation sur le bien-être animal. L’utilisation de larves de poisson-zèbre 5 jours après la fécondation entre dans la catégorie des expériences qui ne nécessitent pas d’approbation éthique formelle, comme le prévoit la réglementation néerlandaise.
1. Obtention de 5 jours après la fécondation (dpf) larves de type sauvage et tg(phox2bb :GFP)
<ol><li>Mettre en place l’élevage de poissons-zèbres de type sauvage et recueillir 50 œufs dans un milieu E3 tamponné HEPES (ci-après dénommé E3) dans une boîte de Pétri de 15 cm. Utilisez ces poissons comme témoin négatif pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FAC).</li>
	<li>Mettre en place l’élevage de poissons-zèbres tg(phox2bb :GFP) et collecter environ 300 œufs en E3 dans une boîte de Pétri de 15 cm.</li>
	<li>Conservez les œufs fécondés en E3 (maximum 50 œufs/boîte) selon un cycle lumière/obscurité de 14 h/10 h, dans un incubateur à 28,5 °C.</li>
	<li>À 1 dpf, retirez les œufs non fécondés et laissez les œufs fécondés se développer jusqu’à 5 dpf.</li>
	<li>Sélectionner les larves tg(phox2bb :GFP) à 1 dpf.</li>
</ol>2. Dissociation des larves entières de type sauvage
<ol><li>Anesthésier 5 larves dpf avec 0,016 % de tricaïne.</li>
	<li>Couper 30 poissons-zèbres en petits morceaux à l’aide d’une lame de rasoir dans une boîte de Pétri contenant 1 mL de solution 10x trypsine-EDTA.</li>
	<li>Transférez le poisson-zèbre haché dans un tube de microcentrifugation d’un volume total de 2 mL de solution de trypsine-EDTA 10x et laissez-le sur glace pendant 3 h. Pipeter de haut en bas avec une pipette P1000 toutes les heures pour stimuler la dissociation.</li>
</ol>3. Isolement intestinal
<ol><li>Placer 6 à 10 larves de 5 dpf anesthésiées avec 0,016 % de tricaïne dans une rangée, sur une plaque d’agarose à 1,8 % (0,45 g d’agarose dans 25 mL d’E3), sous un microscope à dissection</li>
	<li>Mettez une épingle à insectes dans la tête du poisson-zèbre.</li>
	<li>Retirez tous les E3 restants à l’aide d’un mouchoir en papier.</li>
	<li>Isolez l’intestin à l’aide d’une autre épingle à insectes, sans déranger les autres organes. Assurez-vous que le jaune d’œuf est enlevé (figure supplémentaire S1A).</li>
	<li>Une fois l’appareil isolé, inspectez l’intestin et retirez tout le matériel non intestinal (p. ex., peau, graisse, foie) si nécessaire.</li>
	<li>Prélevez l’intestin à l’aide d’une pince à épiler et placez-le dans un tube de microcentrifugation, contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 10 % de sérum de veau fœtal (FCS), sur de la glace. REMARQUE : Un minimum de 244 intestins doivent être isolés, en maintenant le temps total de dissection à 3 h. C’est faisable avec deux personnes travaillant en parallèle.</li>
</ol>4. Dissociation intestinale
<ol><li>Immédiatement après la dissection de tous les intestins, centrifuger le tube de microcentrifugation à pleine vitesse (13 800 × g) pendant 30 s.</li>
	<li>Retirez le PBS/10% FCS mais laissez une petite quantité (~100 μL) pour éviter que les intestins ne se dessèchent. Ajouter 500 μL de papaïne à 2,17 mg/mL dans HBSS contenant du CaCl2 et du MgCl2, pour dissocier les cellules.</li>
	<li>Activer la papaïne avec 2,5 μL de cystéine (1 M).</li>
	<li>Incuber les intestins au bain-marie à 37 °C pendant 10 min. Pipeter de haut en bas à mi-course (après 5 min) pour stimuler la digestion des tissus enzymatiques.</li>
	<li>Transférez les cellules dans un tube FACS à l’aide d’une crépine de 35 μm, préhumidifiée avec 0,5 mL de PBS/10 % FCS.</li>
	<li>Lavez la passoire en ajoutant un total de 2 mL de PBS/10 % de FCS par pas de 0,5 mL.</li>
	<li>Centrifuger à 700 × g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 300 μL de PBS/10 % FCS.</li>
	<li>Ajouter 1 μg/mL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour marquer les cellules mortes (1 :1 000) et incuber pendant 5 min pour permettre leur exclusion pendant le FACS.</li>
</ol>5. Enrichissement du FACS
<ol><li>Utilisez l’échantillon de type sauvage pour définir les portes de la population de cellules triées en enregistrant 3 000 cellules sur le cytomètre en flux (figure supplémentaire S1B-E).</li>
	<li>Utilisez une buse de 100 μm, réglez la précision de tri sur la pureté et placez le tube de collecte contenant 200 μL de PBS/5 % FCS dans la machine FACS.</li>
	<li>Chargez la suspension cellulaire des intestins et triez les cellules individuelles vivantes (DAPI-négatives) dans le tube de collecte (Figure 2C), en excluant les doublets (Figure 2B) et les cellules mortes (Figure 2C). REMARQUE : Pour le poisson-zèbre tg(phox2bb), la proportion de cellules GFP+ n’est vérifiée qu’à titre de référence, car toutes les cellules vivantes individuelles sont triées.</li>
	<li>Conservez le tube de prélèvement sur de la glace après le tri des cellules.</li>
	<li>Comptez la suspension cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre, y compris un contrôle de viabilité avec du bleu de trypan. Si la viabilité est d’au moins 80 %, passez à l’étape suivante.</li>
	<li>Les cellules sont maintenant prêtes à être traitées pour le scRNAseq (c’est-à-dire la plateforme 10x Genomics Chromium). Utilisez environ 20 000 cellules par échantillon.</li>
</ol>

Traitement de cellules intestinales à partir de larves de poisson-zèbre pour le séquençage de l’ARN unicellulaire

<ol><li>Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+intestinal+function+relies+on+coordinated+enteric+nervous+system%2C+immune+system%2C+and+epithelium+eesponses%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses.</a> Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Sitrin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSitrin%2C+M+%22The+Gastrointestinal+System%22">The Gastrointestinal System</a>. , (2014).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organisation+of+the+autonomic+nervous+system%3A+peripheral+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%3A+Basic+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).</li>
<li>Obata, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+microbiota+and+the+immune+system+on+the+development+and+organization+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).</li>
<li>Heuckeroth, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease+-+integrating+basic+science+and+clinical+medicine+to+improve+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).</li>
<li>Antonucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).</li>
<li>De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+our+understanding+of+the+pathology+of+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).</li>
<li>Bianco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neuromyopathies%3A+highlights+on+genetic+mechanisms+underlying+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Biomolecules. 12 (12), 1849(2022).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).</li>
<li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).</li>
<li>Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+the+development+of+the+enteric+nervous+system+using+a+Tg%28-8.3bphox2b%3AKaede%29+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish.</a> Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).</li>
<li>Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+organism+for+studying+enteric+nervous+system+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073(2020).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Kuil, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+characterization+of+the+larval+zebrafish+enteric+nervous+system+at+a+single+cell+transcriptomic+level%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level.</a> iScience. 26 (7), 107070(2023).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+differential+transcriptomes+and+cell+types+in+zebrafish+larvae+intestine+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver.</a> Cells. 11 (20), 3290(2022).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx1b+protects+intestinal+cell+fate+by+repressing+signaling+networks+for+liver+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification.</a> Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).</li>
<li>Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+microbe-responsive+processes+in+the+zebrafish+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine.</a> Cell Reports. 38 (5), 110311(2022).</li>
<li>Kline, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKline%2C+M+%22Fishing+for+answers%3A+Isolating+enteric+neurons+and+identifying+putative+ENS+mutants%22">Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants</a>. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).</li>
<li>Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+a+single+cell+suspension+from+zebrafish+retinal+tissue+for+flow+cytometric+cell+sorting+of+Muller+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia.</a> Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).</li>
<li>Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+zebrafish+brain-derived+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres.</a> Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617(2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Nous présentons ici une méthode d’isolement et de dissociation de l’intestin de 5 larves de poisson-zèbre dpf à l’aide de FACS. Grâce à cette méthode, différents types de cellules intestinales ont été collectés et analysés avec succès par scRNA-seq, à l’aide de la plateforme 10x Genomics Chromium. Nous avons sélectionné la lignée de poisson-zèbre tg(phox2bb :GFP), car nous voulions une indication que les cellules ENS viables seraient également isolées (Figure 2D). Cependant, il est ...

Le tractus gastro-intestinal (GI) est un système complexe qui joue un rôle essentiel dans la santé et le bien-être en général. Il est responsable de la digestion et de l’absorption des nutriments, ainsi que de l’élimination des déchets 1,2. Le tractus gastro-intestinal est composé de plusieurs types de cellules, y compris les cellules épithéliales, les cellules musculaires lisses, les cellules immunitaires et le système nerveux entérique (SNE), qui communiquent étroitement entre elles pour réguler et maintenir une fonction intestinale appropriée 3,4,5. Les défauts dans le développement du tractus gastro-intestinal peuvent avoir des effets considérables sur divers aspects tels que l’absorption des nutriments, la composition du microbiote, l’axe intestin-cerveau et le SNE, conduisant à plusieurs troubles neuromusculaires entériques, tels que la maladie de Hirschsprung et la pseudo-obstruction intestinale chronique 6,7. Ces troubles sont caractérisés par une dysmotilité intestinale sévère causée par des altérations de diverses cellules clés, telles que les cellules interstitielles de Cajal, les cellules musculaires lisses et l’ENS 6,8,9. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement et au dysfonctionnement gastro-intestinal sont encore mal compris.
Le poisson-zèbre est un organisme modèle précieux pour l’étude du développement et du dysfonctionnement gastro-intestinal en raison de son développement embryonnaire rapide, de sa transparence pendant les stades embryonnaire et larvaire et de sa tractabilité génétique 10,11,12,13,14. De nombreuses lignées transgéniques de poissons-zèbres exprimant des protéines fluorescentes sont disponibles. Un exemple d’une telle lignée est le poisson-zèbre tg(phox2bb :GFP), couramment utilisé pour étudier le SNE, car toutes les cellules phox2bb+, y compris les neurones entériques, sont étiquetées15,16. Ici, en utilisant la lignée de poisson-zèbre tg(phox2bb :GFP), nous présentons une méthode d’isolement intestinal de larves 5 jours après la fécondation (dpf) pour l’analyse du séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) (Figure 1).

<table><tbody><tr><td>10x Trypsine (0,5 %)-EDTA (0,2 %)</td><td>Sigma</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>Tube à fond rond de 5 mL avec capuchon de filtre cellulaire</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Tube à fond rond 5 mL (tubes FACS) bouchon à pression</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger v3.0.2</td><td>10X Genomics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#D-9542</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Olympus SZX16</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III Trieuse</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS avec CaCl2 et MgCl2</td><td>Gibco</td><td>14025050</td><td></td></tr><tr><td>Épingles à insectes</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>MS-222, Tricaine</td><td>Supelco</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma</td><td>P4762</td><td></td></tr><tr><td>Seurat v3</td><td>Stuart et&nbsp ;al. (2019)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>Réf. #T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement intestinal de larves de poisson-zèbre pour le séquençage de l’arn unicellulaire

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

Le tractus gastro-intestinal (GI) remplit une série de fonctions essentielles à la vie. Les malformations congénitales affectant son développement peuvent entraîner des troubles neuromusculaires entériques, d’où l’importance de comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement et au dysfonctionnement gastro-intestinal. Dans cette étude, nous présentons une méthode d’isolement intestinal des larves de poisson-zèbre 5 jours après la fécondation afin d’obtenir des cellules vivantes et viables qui peuvent être utilisées pour l’analyse du séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq). Ce protocole est basé sur la dissection manuelle de l’intestin du poisson-zèbre, suivie d’une dissociation enzymatique avec de la papaïne. Par la suite, les cellules sont soumises à un tri cellulaire activé par fluorescence et les cellules viables sont collectées pour le scRNA-seq. Grâce à cette méthode, nous avons réussi à identifier différents types de cellules intestinales, notamment les cellules épithéliales, stromales, sanguines, musculaires et immunitaires, ainsi que les neurones entériques et les cellules gliales. Par conséquent, nous considérons qu’il s’agit d’une ressource précieuse pour étudier la composition du tractus gastro-intestinal dans la santé et la maladie, en utilisant le poisson-zèbre.

Grâce à ce protocole, nous avons réussi à isoler et à dissocier des intestins entiers de 5 larves dpf. En utilisant la papaïne comme enzyme de dissociation, nous avons considérablement amélioré la viabilité cellulaire, permettant la capture de 46 139 événements impliquant des cellules uniques et viables (6,4 % de toutes les cellules) sur 244 intestins isolés (Figure 2A). Des larves entières de type sauvage ont été utilisées comme témoin pour s’assurer que le processus de tri était optimisé, ...

Nous décrivons ici une méthode d’isolement intestinal des larves de poisson-zèbre 5 jours après la fécondation, pour l’analyse du séquençage de l’ARN unicellulaire.

Isolement intestinal de larves de poisson-zèbre pour le séquençage de l’ARN unicellulaire

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

Notre recherche vise à étudier les changements transcriptomiques survenant au cours du développement gastro-intestinal et le dysfonctionnement chez les larves de poisson-zèbre. Ici, nous fournissons un nouveau protocole qui permet d’isoler différents types de cellules dans l’intestin du poisson-zèbre, ce qui a des applications potentielles dans la compréhension de la santé et des maladies gastro-intestinales. Au cours des dernières années, on s’est intéressé de plus en plus à l’interaction entre le système nerveux entérique et d’autres types de cellules intestinales au cours du développement et de la maladie.La compréhension de ces dynamiques complexes à l’aide de techniques avancées telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire a le potentiel de révéler des informations essentielles sur les neuromyopathies entériques, conduisant à des diagnostics et des traitements plus précis. À l’aide de ce protocole, nous avons réussi à identifier divers types de cellules intestinales, y compris les cellules épithéliales, stromales, sanguines, musculaires, immunitaires et même les neurones entériques et gliales, qui n’avaient pas été capturés auparavant à cette quantité en utilisant des approches similaires. Ainsi, nous fournissons une technique fiable pour étudier la composition gastro-intestinale au cours du développement et du dysfonctionnement.

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Developmental Biology

Biologie du développement

L'isolement de haute qualité, intacte ARN est une étape essentielle dans de nombreux protocoles de laboratoire. Ici, nous démontrons l'extraction d'ARN à partir d'embryons de poisson zèbre ensemble et synthèse de l'ADNc pour l'application ultérieure dans diverses procédures expérimentales, y compris l'analyse des microréseaux d'expression génique.

Isolement d&#39;ARN à partir de synthèse d&#39;ADNc embryonnaires Zebrafish et pour analyser l&#39;expression génique

Cette vidéo décrit un protocole permettant d’isoler les neurones, les macrophages et la microglie du cerveau des larves de poisson-zèbre en perturbant mécaniquement le tissu cérébral. Les populations cellulaires purifiées peuvent ensuite être utilisées pour l’analyse génomique.

Isolement de cellules cérébrales à partir de larves de poisson-zèbre : une technique pour obtenir des neurones, des macrophages et des microglies intacts à partir de tissu cérébral de poisson-zèbre

Ce protocole décrit une méthode pour isoler des cellules uniques à partir d’embryons de poisson-zèbre, enrichir pour des cellules d’intérêt, capturer des cellules de poisson-zèbre dans des systèmes de multiplexage de cellules uniques basés sur la microfluidique, et évaluer l’expression génique à partir de cellules uniques.

Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d&#39;embryons de poisson zèbre

Nous présentons ici un protocole pour isoler gonades des larves de poisson zèbre, ce qui facilitera les enquêtes de la différenciation sexuelle et l'entretien du poisson zèbre.

Dissection de tissu gonadique Larval Zebrafish

Nous décrivons ici une technique pour isoler les cellules de la population de côté d'un modèle de poisson zèbre leucémie aiguë lymphoblastique T myc induite (T-ALL). Ce test de population côté est très sensible et est décrit pour T-ALL zebrafish, mais il peut être applicable à d'autres types de cellules malignes et non zebrafish malignes.

L&#39;isolement de la population latérale dans la leucémie lymphoblastique aiguë de cellules T induite par Myc dans le poisson zèbre

Ce protocole présente une approche pour l’analyse du transcriptome ensemble des embryons de poisson-zèbre, larves, ou trier des cellules. Nous incluons l’isolement de l’ARN, la voie analyse des données RNASeq et qRT-PCR-based validation des modifications de l’expression génique.

Préparation des échantillons et l’analyse des données sur l’Expression génique à base RNASeq de poisson-zèbre

Nous présentons un protocole visant à isoler les neurones, les macrophages et les cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre dans des conditions physiologiques et pathologiques. Après isolement, l’ARN est extrait de ces cellules à analyser leur profil d’expression génique. Ce protocole permet à la collection de l’ARN haute qualité pour effectuer des analyses en aval comme qPCR et transcriptomique.

Isolement et Extraction de l’ARN des neurones, les Macrophages et les cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre

Nous décrivons une technique de profilage des microARN chez les premiers embryons de souris. Ce protocole surmonte le défi de l’entrée de cellules faibles et de l’enrichissement de l’ARN. Ce test peut être utilisé pour analyser les changements dans l’expression miRNA au fil du temps dans différentes lignées cellulaires de l’embryon de souris précoce.

Préparation de petites bibliothèques d’ARN pour le séquençage à partir d’embryons de souris précoces

L’isolement des noyaux uniques repose sur la dissociation et la perméabilisation à base de détergent de la membrane cellulaire, étapes qui nécessitent une optimisation et sont sujettes à l’introduction d’artefacts techniques. Nous démontrons un protocole sans détergent et sans enzymes pour l’isolement rapide des noyaux intacts directement à partir de tissus entiers, donnant des noyaux appropriés pour l’ARN-seq mono-noyau (snRNA-Seq) ou ATAC-seq.

Isolation des noyaux par tissu entier à l’aide d’une méthode sans détergent et sans enzymes

Ici, nous présentons une méthode pour aligner et cryosectionner plusieurs échantillons de larves de poisson-zèbre (Danio rerio) et les collecter sur une seule lame pour une analyse transcriptomique spatiale.

Agencement spatialement compact de coupes de larves de poisson-zèbre pour l’analyse transcriptomique spatiale

Découvrez un protocole d'isolement cellulaire intestinal chez les larves de Danio rerio pour le séquençage ARN unicellulaire. Cette méthode permet d'étudier le développement gastro-intestinal et les dysfonctionnements associés.

Isolement intestinal de larves de poisson-zèbre pour le séquençage de l’ARN unicellulaire

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