Isolement intestinal de larves de poisson-zèbre pour le séquençage de l’ARN unicellulaire
10 novembre 2023
Nous décrivons ici une méthode d’isolement intestinal des larves de poisson-zèbre 5 jours après la fécondation, pour l’analyse du séquençage de l’ARN unicellulaire.
Notre recherche vise à étudier les changements transcriptomiques survenant au cours du développement gastro-intestinal et le dysfonctionnement chez les larves de poisson-zèbre. Ici, nous fournissons un nouveau protocole qui permet d’isoler différents types de cellules dans l’intestin du poisson-zèbre, ce qui a des applications potentielles dans la compréhension de la santé et des maladies gastro-intestinales. Au cours des dernières années, on s’est intéressé de plus en plus à l’interaction entre le système nerveux entérique et d’autres types de cellules intestinales au cours du développement et de la maladie.
La compréhension de ces dynamiques complexes à l’aide de techniques avancées telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire a le potentiel de révéler des informations essentielles sur les neuromyopathies entériques, conduisant à des diagnostics et des traitements plus précis. À l’aide de ce protocole, nous avons réussi à identifier divers types de cellules intestinales, y compris les cellules épithéliales, stromales, sanguines, musculaires, immunitaires et même les neurones entériques et gliales, qui n’avaient pas été capturés auparavant à cette quantité en utilisant des approches similaires. Ainsi, nous fournissons une technique fiable pour étudier la composition gastro-intestinale au cours du développement et du dysfonctionnement.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article présente un protocole novateur pour isoler les cellules intestinales de larves de zebrafish à 5 jours post-fécondation, facilitant l'analyse par séquençage de l'ARN au niveau cellulaire unique. La méthode vise à améliorer la compréhension du développement et du dysfonctionnement gastro-intestinal.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie du développement
- Santé gastro-intestinale
Contexte
- Étude des échanges transcriptomiques au cours du développement du système gastro-intestinal.
- Accent mis sur les interactions entre le système nerveux antérieur et les types cellulaires intestinaux.
- Importance des techniques avancées dans l'étude des neuromyopathies.
- Potentiel pour des diagnostics et traitements améliorés.
Objectif de l'étude
- Fournir une méthode fiable pour isoler divers types de cellules intestinales.
- Approfondir la compréhension de la composition gastro-intestinale au cours du développement.
- Explorer les implications pour la santé et les maladies gastro-intestinales.
Méthodes utilisées
- Isolation de différents types cellulaires dans l'intestin du poisson zèbre.
- Application du séquençage de l'ARN au niveau cellulaire unique.
- Identification des cellules épithéliales, stromales, sanguines, musculaires, immunitaires et des ganglions nerveux entériques.
- Utilisation d'un protocole novateur permettant une capture cellulaire améliorée.
Résultats principaux
- Identification réussie de divers types de cellules intestinales.
- Nouvelles connaissances sur la santé gastro-intestinale et la dynamique des maladies.
- Compréhension améliorée des neuromyopathies antérieures.
- Technique fiable pour l'étude de la composition gastro-intestinale.
Conclusions
- Le protocole constitue une avancée significative dans l'isolement des cellules intestinales.
- Il ouvre des perspectives pour des recherches approfondies sur la santé gastro-intestinale.
- Potentiel pour améliorer la compréhension des processus de développement et des mécanismes des maladies.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Le séquençage de l'ARN au niveau de la cellule unique dans l'intestin de larves de poisson zèbre permet une cartographie haute résolution de la diversité cellulaire intestinale au cours du développement et de la modélisation des maladies. Ce protocole soutient la validation précoce des cibles et la réduction des risques mécanistiques pour les portefeuilles de recherche en gastro-entérologie. L'approche renforce la confiance prédictive dans le choix des systèmes pertinents pour la maladie et la découverte de biomarqueurs translationnels.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'analyse de transcriptomes spécifiques à un type cellulaire dans un modèle de vertébré.
- Permet la validation fonctionnelle de cibles en isolant les neurones entériques, les cellules gliales et les cellules immunitaires.
- Facilite la détection mécanistique des risques associés aux cibles neuromusculaires et épithéliales dans les troubles gastro-intestinaux.
Développement de criblages et de tests
- Fournit des suspensions monocellulaires validées et viables pour des analyses transcriptomiques en aval.
- Standardise l'isolement et le tri des cellules afin d'obtenir des résultats quantitatifs reproductibles.
- Permet une préparation évolutive de cellules d'origine intestinale pour des plateformes de criblage à haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne la composition cellulaire de l'intestin du poisson zèbre avec la biologie gastro-intestinale humaine pertinente pour la maladie.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique des cibles gastro-intestinales.
- Permet la progression ajustée au risque des cibles candidates en fonction de profils d'expression spécifiques aux types cellulaires.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole s'intègre dans la continuité découverte-préclinique en permettant l'isolement et le profilage des types cellulaires intestinaux pour l'identification de cibles, leur validation et des études mécanistiques.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur le développement et le dysfonctionnement du tube digestif avec une résolution au niveau cellulaire unique.
- Triage : Fournit des populations cellulaires viables et reproductibles pour des tests transcriptomiques et phénotypiques.
- Analyse : Fournit des données quantitatives d'expression génique pour des analyses comparatives entre types cellulaires et conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la biologie digestive du poisson zèbre et celle de l'humain afin d'aligner les biomarqueurs et modéliser les maladies.
- Réutilisation à grande échelle : Met en place un flux de travail réutilisable pour l'isolement des cellules intestinales et l'analyse unicellulaire dans divers programmes de recherche gastro-intestinale.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans le choix des cibles gastro-intestinales et la compréhension mécanistique.
- Valeur opérationnelle : Standardise l'isolement et le tri des cellules pour assurer la reproductibilité et la reproductibilité à grande échelle.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'avancement ou d'abandon en permettant des analyses transcriptomiques spécifiques aux types cellulaires.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des cibles gastro-intestinales et des modèles de maladies.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation des zebrafish, en dissection et en protocoles à l'échelle cellulaire unique.
- Requiert un accès à un équipement de tri cellulaire par cytométrie en flux (FACS) et à des plateformes de séquençage de l'ARN à partir d'une seule cellule.
- Exige une standardisation entre équipes pour une isolation et un tri cellulaires reproductibles.
- Une adaptation peut être nécessaire pour d'autres stades de développement ou d'autres organismes modèles.
- La viabilité et le rendement cellulaires dépendent d'étapes précises de dissection et de dissociation enzymatique.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:22
Obtaining Wildtype and Transgenic Zebrafish Larvae and WildType Whole Larvae Dissociation
2:50
Isolation and Dissociation of Gut from Zebrafish Larvae for FACS Enrichment of Gut Cells
5:25
FACS Enrichment of Zebrafish Gut Cell Suspension for scRNAseq
