Expression et purification à haut débit de vecteurs de solutés humains pour des études structurales et biochimiques
29 septembre 2023
Les études structurales et biochimiques des transporteurs membranaires humains nécessitent des quantités de quelques milligrammes de protéines stables, intactes et homogènes. Nous décrivons ici des méthodes évolutives pour cribler, exprimer et purifier les transporteurs de solutés humains à l’aide de gènes optimisés pour les codons.
Les transporteurs de solutés, ou SLC, sont responsables de l’absorption des nutriments et sont impliqués dans les maladies humaines. Cependant, il existe peu de médicaments ciblant les SLC parce qu’ils sont peu étudiés. Nous avons développé des approches efficaces pour cloner, exprimer et purifier les SLC.
Notre flux de travail produit des protéines pures, ce qui permet des études biochimiques et structurelles, et fournit finalement des informations pour les campagnes de découverte de médicaments. Avec les nombreux rôles dans les processus biologiques, les maladies et l’administration de médicaments, les SLC ont de plus en plus attiré l’attention et sont devenus des cibles thérapeutiques attrayantes. Les projets privés et publics de l’IMI ReSOLUTE ont généré des ressources et des données en libre accès pour permettre de nouvelles découvertes dans les domaines de la fonction, de la physiologie, de la pathologie et du ciblage thérapeutique des CSL.
Traditionnellement, les SLC étaient difficiles à étudier car ce sont des protéines membranaires intégrales avec divers substrats et divers mécanismes de transport. Récemment, Cryo-EM, le système d’expression de BacMam et de nouveaux réactifs de solubilisation ont conduit à un changement radical dans leur caractérisation. Des échantillons de protéines pures sont nécessaires pour les études biochimiques et structurales.
Chez l’homme, les porteurs de soluté ont souvent un faible rendement lorsqu’ils sont surexprimés et instables lorsqu’ils sont purifiés. Par conséquent, dans le passé, chaque cible nécessitait des années pour développer des structures individuelles afin de produire l’échantillon de protéine pour des applications en aval. Notre méthode est optimisée pour l’étude parallèle et rentable de plusieurs cibles ou constructions d’une seule cible.
Par conséquent, il équilibre soigneusement la flexibilité expérimentale, le coût, le temps et les ressources de laboratoire. De plus, nous offrons un accès libre à tous nos protocoles et ressources dans cet article et sur le portail Web ReSOLUTE.
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Aperçu
Cette étude porte sur les transporteurs de solutés (SLC), qui jouent un rôle essentiel dans l'absorption des nutriments et sont associés à diverses maladies humaines. Les chercheurs ont mis au point des méthodes efficaces pour le clonage, l'expression et la purification des SLC, permettant ainsi des études biochimiques et structurales plus approfondies.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biochimie
- Pharmacologie
Contexte
- Les transporteurs de solutés jouent un rôle essentiel dans le transport des nutriments.
- Ils sont impliqués dans plusieurs maladies humaines.
- Malgré leur importance, peu de médicaments ciblent les SLC en raison de recherches insuffisantes.
- De récentes initiatives ont cherché à améliorer la compréhension des fonctions des SLC.
Objectif de l'étude
- Développer des méthodes évolutives pour l'étude des SLC humains.
- Produire des protéines pures destinées à des analyses biochimiques et structurales.
- Faciliter les efforts de découverte de médicaments ciblant les SLC.
Méthodes utilisées
- Clonage de gènes optimisés au niveau des codons pour les SLC.
- Expression des protéines SLC dans des systèmes appropriés.
- Purification des protéines afin d'obtenir des échantillons homogènes.
- Utilisation de ressources ouvertes provenant de projets IMI pour l'accès aux données.
Résultats principaux
- Des méthodes efficaces de clonage et d'expression ont été mises en place.
- Des protéines SLC de haute pureté ont été obtenues pour des études ultérieures.
- L'étude fournit des informations sur les fonctions des SLC et leur potentiel thérapeutique.
- Les données générées soutiennent les recherches en cours sur la physiologie et la pathologie des SLC.
Conclusions
- Les méthodes développées améliorent considérablement l'étude des transporteurs SLC.
- Les connaissances acquises pourraient conduire à de nouvelles stratégies de découverte de médicaments.
- Une meilleure compréhension des SLC pourrait améliorer le ciblage thérapeutique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Les transporteurs de solutés humains (SLC) représentent une vaste classe sous-exploitée de transporteurs membranaires possédant un potentiel thérapeutique important, mais leur caractérisation structurale et biochimique a pris du retard en raison de difficultés liées à l'expression et à la purification. Ce flux de travail à haut débit permet la production parallèle et évolutive de protéines SLC pures et fonctionnellement actives, répondant directement à un goulot d'étranglement majeur dans la découverte précoce de médicaments et la validation de cibles. En facilitant l'accès à des échantillons SLC de haute qualité, la méthode soutient la réduction des risques à l'échelle du portefeuille et accélère l'évaluation de ces cibles en vue d'interventions pharmaceutiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation systématique de la fonction et de la spécificité des substrats des transporteurs SLC.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en fournissant une protéine intacte sur le plan structural et active sur le plan biochimique pour la vérification d'hypothèses.
- Permet la validation de cibles grâce à la production reproductible de multiples constructions SLC en parallèle.
Développement de tests et criblage
- Fournit des protéines SLC de haute pureté, adaptées aux dosages biochimiques quantitatifs et aux essais de transport.
- Standardise la quantité de protéine utilisée en amont des études de criblage à haut débit et d'engagement.
- Améliore la reproductibilité et l'extensibilité des essais en assurant une qualité et un rendement constants des protéines.
Recherche translationnelle et préclinique
- Permet des études structurales éclairant les mécanismes des transporteurs pertinents pour les maladies et leur aptitude au développement de médicaments.
- Offre des préparations protéiques stables pour des études de liaison et de transport de petites molécules, en adéquation avec le développement de biomarqueurs translationnels.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en générant des données sur la stabilité et l'activité des protéines.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce flux de travail s'intègre à l'interface entre la phase initiale de découverte et l'identification de composés candidats, fournissant des réactifs fondamentaux tant pour les études mécanistiques que pour les campagnes de criblage.
- Biologie de la découverte : Fournit des protéines SLC de haute qualité destinées à des analyses fonctionnelles et structurales guidées par des hypothèses.
- Essais de criblage : Permet le développement d'essais robustes et le criblage de composés à l'aide de protéines d'entrée reproductibles.
- Analyse : Fournit des données quantitatives telles que la concentration, la pureté et la monodispersité des protéines, permettant des comparaisons entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Facilite l'identification des protéines SLC impliquées dans les maladies et leur modulation pharmacologique.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme évolutive et réutilisable pour l'évaluation des cibles SLC dans plusieurs programmes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la sélection des cibles SLC et réduit l'ambiguïté mécanistique.
- Valeur opérationnelle : Rationalise la production de protéines grâce à des protocoles standardisés et à haut débit.
- Valeur stratégique : Accélère les décisions d'orientation (go/no-go) et améliore l'allocation des capitaux en permettant un tri précoce des cibles.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des cibles SLC pour leur intégration dans les criblages et les filières précliniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en expression, purification et caractérisation analytique des protéines membranaires.
- Exige un accès à des systèmes d'expression eucaryotes, à une infrastructure de chromatographie et à des outils d'analyse des protéines.
- Bénéficie de protocoles standardisés et de ressources en libre accès pour assurer la reproductibilité entre équipes.
- Adaptable à divers membres de la famille SLC et à différentes conceptions de constructions, ce qui en élargit l'applicabilité.
- La stabilité et le rendement de la protéine peuvent varier selon la cible, nécessitant une optimisation de la construction et du tampon.
