Name: Interaction entre le bactériophage T4 et E . coli dans l’intestin murin : un modèle prototypique pour l’étude de la dynamique hôte-bactériophage in vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Découvrez les interactions entre le bactériophage T4 et Escherichia coli dans l'intestin murin gnotobiotique. Cette méthode standardisée permet d'étudier la dynamique hôte-bactériophage in vivo et son impact sur la santé intestinale.

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Les auteurs reconnaissent que les terres sur lesquelles ils ont effectué cette recherche sont le territoire traditionnel, ancestral et non cédé de la nation xwməθkwəy̓əm (Musqueam). La terre sur laquelle il est situé a toujours été un lieu d’apprentissage pour le peuple Musqueam, qui depuis des millénaires transmet sa culture, son histoire et ses traditions d’une génération à l’autre sur ce site. Nous encourageons les autres à en apprendre davantage sur les terres autochtones dans lesquelles ils vivent et travaillent à https://native-land.ca. Les auteurs remercient le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) pour le soutien des bourses d’études supérieures du Canada - maîtrise (N.P.), de la bourse de stagiaire Michael Smith Health Research BC (RT-2023-3174, à MH), du Programme de subventions à la découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) (RGPIN-2019-04591 à C.T., RGPIN-2016-04282 à la CDO), de l’Institut canadien de recherches avancées / L’humain et le microbiome (FL-001253 Appt 3362, à C.T.), la bourse de boursier de la Fondation Michael-Smith pour la recherche en santé (18239, à C.T.), les Instituts de recherche en santé du Canada (PJT-159458 à la CDO) et la Fondation canadienne pour l’innovation (34673 à la CDO et 38277 à CT). Nous sommes reconnaissants du soutien technique du Centre de modélisation des maladies de l’Université de la Colombie-Britannique et d’ubcFLOW, qui est soutenu par l’initiative de résilience biologique GREx de l’Université de la Colombie-Britannique, ainsi que des membres des laboratoires Osborne et Tropini pour les discussions critiques et l’évaluation du manuscrit. Les figures 1A et 2A ont été créées à l’aide de Biorender.com.

Exploration de la dynamique phage-bactérie intestinale dans des modèles murins à l’aide de phages T4

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les bactériophages, ou phages, sont des virus qui infectent et tuent les bactéries avec une spécificité au niveau de l’espèce et de la souche1. Les phages jouent un rôle important dans les communautés bactériennes complexes telles que le microbiote intestinal, où ils ont été impliqués dans la régulation de la dynamique des populations et la conduite de la fitness bactérienne2. Au cours de la dernière décennie, il y a eu un regain d’intérêt pour la recherche sur les phages en raison de l’augmentation des agents pathogènes résistants aux antimicrobiens3 et du potentiel de la phagothérapie comme stratégie de traitement alternative. Ces dernières années, les cocktails de phages lytiques ont été utilisés par voie intraveineuse avec un certain succès dans les infections septiques bactériennes graves et résistantes aux antibiotiques chez l’homme 3,4. La phagothérapie orale a également été proposée comme alternative potentielle aux antibiotiques pour traiter les infections intestinales et l’inflammation. De plus, les phages ont été impliqués dans le succès des greffes de filtrat fécal (FFT), qui sont des préparations de microbiote fécal filtrées pour éliminer les bactéries, dans le traitement de l’infection récurrente à Clostridioides difficile (ICDr)5,6, des troubles inflammatoires de l’intestin (MICI)7,8 et de l’entérocolite nécrosante chez les porcs prématurés9. Compte tenu de ces résultats, il est important de prendre en compte les interactions entre les phages et le microbiote intestinal, et entre les phages et l’hôte mammifère, car l’ajout de nouveaux phages dans une communauté préexistante peut avoir des effets indirects sur la communauté dans son ensemble, et pas seulement sur ses bactéries cibles 2,10.
L’étude in vitro des interactions des phages avec leurs bactéries cibles s’est avérée utile pour comprendre les mécanismes et les impacts des interactions phages et bactéries dans l’intestin. Dans ce contexte, il a été démontré que les phages T4 spécifiques d’Escherichia coli de l’ordre des Caudovirales ont besoin de domaines de type immunoglobuline (Ig) situés dans des protéines de capside externe (Hoc) hautement antigéniques à la surface du virion pour adhérer au mucus intestinal11. De plus, des tests transwell ont montré que les phages T4 sont capables d’interagir avec les cultures de cellules épithéliales et de se déplacer à travers les couches cellulaires par macropinocytose12,13. Ces résultats soutiennent l’hypothèse selon laquelle les phages peuvent interagir avec leur hôte métazoaire, même s’ils sont incapables d’infecter les cellules eucaryotes. Ces modèles, bien qu’utiles, ne disposent pas de toute la gamme d’interactions complexes qui se produisent dans un écosystème intestinal et qui sont nécessaires à une exploration complète de l’interaction tripartite entre les phages, les bactéries et l’hôte métazoaire.
Les modèles murins sont un outil important pour étudier les phages dans des environnements complexes. Une application souhaitable de l’administration de phages est une stratégie alternative pour traiter les infections résistantes aux antimicrobiens ou les agents pathogènes associés aux maladies inflammatoires chroniques, y compris les MICI. Cependant, la littérature émergente suggère que le comportement des phages in vitro ne représente pas pleinement les fonctions in vivo. Buttimer et al.14 ont démontré qu’un cocktail de phages était capable d’épuiser les bactéries ciblées dans un consortium simplifié de microbiote humain in vitro, mais ne pouvait pas être répliqué in vivo chez des souris gnotobiotiques colonisées par le même consortium bactéries-phages. De plus, dans un microbiome de souris conventionnel, le phage T7 a entraîné un épuisement sélectif de ses bactéries intestinales cibles, bien qu’une récupération progressive ait été observée au fil du temps, indiquant une résistance évoluée15. D’autres études ont démontré la coexistence de phages administrés par voie orale et de leurs souches bactériennes cibles in vivo 2,16. En effet, au-delà de la coexistence phage/bactérie, l’administration de phages a entraîné des changements généralisés dans la composition et la fonction globales de la communauté du microbiote 2,16. Ceci est pertinent dans les contextes pathologiques, car plusieurs études ont trouvé des associations entre l’augmentation de l’abondance relative des Caudovirales et des MICI 7,8,17 qui étaient indépendantes des changements dans l’abondance bactérienne7. On ne sait pas encore s’il s’agit d’un facteur ou d’une conséquence de la pathogenèse de la maladie.
L’objectif historique de l’étude des phages a été la relation entre un phage et sa bactérie cible. Cependant, il est également important de prendre en compte les interactions potentielles entre le phage et la muqueuse, l’épithélium et le système immunitaire de l’hôte métazoaire. Ces interactions jouent toutes un rôle important dans la réponse globale à l’infection intestinale par les phages. Pour le démontrer, des phages ont été étudiés sur des souris sans germes (GF) afin d’élucider leur impact sur le système immunitaire sans interférence du microbiote8. Dans ce système, les acides nucléiques des phages ont été détectés par des récepteurs de type Toll (TLR) situés dans les endosomes des cellules immunitaires phagocytaires (macrophages et cellules dendritiques). Cela a activé la signalisation en aval et stimulé la production d’interféron (IFN)-γ8 ou d’IFNs de type I18 dépendant des lymphocytes T. De plus, Fluckiger et al.19 ont impliqué les lymphocytes T CD8+ mémoires dans la reconnaissance des antigènes codés par des phages (prophages), ce qui a entraîné une réactivité croisée des lymphocytes T avec les antigènes tumoraux, ce qui a entraîné une réduction de la charge tumorale. Enfin, la production d’anticorps spécifiques aux phages a été documentée dans des études sur des souris où des phages ont été délivrés à des modèles animaux de manière continue par l’eau potable 8,20, ou par gavage oral répété pendant plusieurs mois20, démontrant la capacité des protéines des phages à promouvoir des réponses immunitaires humorales. Bien que ces modes d’inoculation des phages permettent un amorçage optimal et continu du système immunitaire, ils peuvent ne pas représenter les interactions naturelles entre les phages et l’environnement intestinal, ni la cinétique de la phagothérapie appliquée par voie orale. Jusqu’à présent, un nombre limité d’études ont examiné les interactions d’un phage avec une seule espèce bactérienne dans des modèles murins monocolonisés21. Cependant, les souris monocolonisées se sont avérées essentielles pour déchiffrer les effets spécifiques des microbes des espèces individuelles sur le tractus gastro-intestinal (GI) et le développement immunitaire 22,23,24, et elles peuvent encore s’avérer utiles pour comprendre les interactions tripartites entre les phages, leurs bactéries cibles et l’hôte métazoaire.
Il est passionnant de constater qu’il reste encore beaucoup à apprendre sur les interactions entre les phages intestinaux et les bactéries commensales intestinales, ainsi que sur les interactions qui se produisent entre l’hôte métazoaire et les phages qui y résident. Ce protocole fournit un ensemble de procédures pour étudier le phage T4 isolé et son homologue bactérien, E. coli (K-12, BW25113), à l’aide d’un modèle murin gnotobiotique. Ces procédures standardisées fournissent également une base pour optimiser d’autres dyades phage/bactérie en adaptant les paramètres de croissance aux paires d’intérêt. Les méthodes décrites ici décrivent : (1) la préparation de lysats de phages et de véhicules T4 pour le gavage oral de souris ; (2) Administration orale de phage T4 à des souris gnotobiotiques monocolonisées par E. coli ; (3) Surveillance des niveaux de phages T4 dans les excréments et les tissus de souris au fil du temps.
Pour les résultats représentatifs présentés ici, des lysats de phages T4 purifiés ont été propagés à partir de stocks de banques de phages maintenus par le laboratoire Rohwer. La méthode Phage-on-Tap pour la propagation du phage T4 a été adaptée25, comme indiqué dans ce protocole. La méthode permet d’obtenir des stocks de phages à titre élevé et à faible teneur en endotoxines en trois jours. En utilisant cette approche, 10 mL de ≥ 1010 unités formant des plaques (UFP)/mL de phage T4 avec < 0,5 unité d’endotoxine (UE)/mL ont été collectés régulièrement. Les teneurs en endotoxines recommandées pour l’administration orale ou intraveineuse chez la souris sont respectivement de ≤ 20 UE/ml et ≤ de 5 UE/kg/h (ou 0,1 UE administrée en 1 heure pour une souris de 20 g), ce qui en fait une méthode appropriée de préparation de phages pour l’inoculation in vivo . Tous les stocks de phages ont été stockés à 4 °C dans un tampon de magnésium salin (SM) (recette fournie à l’étape 1.1.5.1). E. coli a été cultivé dans des milieux LB. Pour diverses paires phage-bactérie, divers milieux de culture et conditions de croissance peuvent être adaptés à partir de ce protocole. Les phages peuvent également provenir de l’environnement, comme les eaux usées, l’eau de mer, le sol et le contenu intestinal, et peuvent être isolés et purifiés selon Sambrook et Russell26 avant la préparation en utilisant les conditions de croissance et de propagation appropriées pour chaque paire phage-hôte d’intérêt25. Les phages peuvent également être obtenus auprès de sources commerciales (voir le tableau des matériaux) ou de banques de phages.

<table><tbody><tr><td>1-octanol (99 %)</td><td>Thermofisher</td><td>CAAAA15977-AP</td><td></td></tr><tr><td>50 ml PES Steriflip Unités de Filtre Sous Vide Jetables</td><td>Stériles Millipore Sigma&nbsp ;</td><td></td><td>Agarose SCGP00525</td></tr><tr><td>(faible EEO/polyvalente/biologie moléculaire)</td><td>Fisher BioReagents&nbsp ;</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon&reg ; 100kDa Ultra-15 dispositif de filtre centrifuge, Ultracel-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>BD Microtainer&reg ; Tubes, SST</td><td>BD Medical</td><td>365967</td><td></td></tr><tr><td>Cages étanches à l’air Bioexclusion (cages ISO)&nbsp ;</td><td>Techiplast</td><td>1245ISOCAGE</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch&trade ; Thermocycleur avec module de réaction rapide à 96 puits</td><td>BioRad</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>chlorure de calcium dihydraté (cristaux blancs à poudre)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>Verrouillage du capuchon pour tube de 1,5 ml 100/pqt</td><td>Andwin Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>16812612</tr><tr><td>Chloroforme (éthanol comme agent de conservation/certifié ACS)</td><td>Fisher</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Billes d’acier recouvertes de cuivre (4,5 mm)</td><td>Crosman Corporation</td><td>0767</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de mouchoirs (50)</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Vert PCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Solution de sel disodique d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), pour la biologie moléculaire, 0,5 M dans H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&trade ; Agar, poudre / flocons, Fisher BioReagents&commerce ; &nbsp ;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&trade ; Milieu de microbiologie : Bouillon LB (poudre) - Lennox&nbsp ;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Échelle d’ADN</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Green FastMix&reg ; qPCR mix, 1250 rxns</td><td>QuantaBio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>Filtres HEPA pour couvercles isocage, AUTOCLAVABLES H14 FILTRES POUR ISO LINE- IRRADIATED</td><td>Techiplast</td><td>UISOHEPAXTBOX-300</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 6000 Agitateur incubé</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>8354-30-0009</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de microbiologie : LB Bouillon (poudre) - Lennox</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation avec capuchon à pression verrouillable, 2ml</td><td>Fisher</td><td>14-666-315</td><td></td></tr><tr><td>Film d’étanchéité de parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Stocks de phages</td><td>Carolina Biological Supply&nbsp ;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>PicoLab&reg ; Régime de souris 20 EXT</td><td>LabDiet</td><td>5R58</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&trade ; Kit Optionnel d’Endotoxines Chromogènes</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>A39552S</tr><tr><td>RNase A (17 500 U)</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble de DNase sans RNase</td><td>Qiagen&nbsp ;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium (poudre blanche fine)</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (cristallin/certifié ACS)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (sonde modèle CL-18 ; source d’alimentation modèle FB50)</td><td>Fisher scentific&nbsp ;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Isolateur à film souple stérile</td><td>Classe : Biologiquement propre</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&trade ; Thermocycleur Gel d’ADN sûr</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T100.</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>amorce de phage T4, avant (CCACACATAGCGCGAGTATAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Amorce de phage T4, avant (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II&nbsp ;</td><td>Qiagen&nbsp ;</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, solution 1M, pH 8,0, qualité biologie moléculaire, thermo scientifique ultrapur&</td><td>nbsp ;</td><td></td><td></td>AAJ22638AE</tr><tr><td>Eau, (sans DNASE, RNASE)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2484100</td><td></td></tr></tbody></table>

interaction entre le bactériophage t4 et e . coli dans l’intestin murin : un modèle prototypique pour l’étude de la dynamique hôte-bactériophage in vivo

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

Les bactériophages (phages) sont des virus qui infectent les bactéries avec une spécificité au niveau de l’espèce et de la souche et sont les entités biologiques les plus abondantes dans tous les écosystèmes connus. Au sein des communautés bactériennes, telles que celles que l’on trouve dans le microbiote intestinal, les phages sont impliqués dans la régulation de la dynamique des populations de microbiote et dans l’évolution bactérienne. La recherche sur les phages a connu un regain d’intérêt au cours de la dernière décennie, en partie en raison des capacités de destruction spécifiques à l’hôte des phages lytiques, qui offrent un outil prometteur pour contrer la menace croissante des bactéries résistantes aux antimicrobiens. De plus, des études récentes démontrant que les phages adhèrent au mucus intestinal suggèrent qu’ils pourraient avoir un rôle protecteur dans la prévention de l’invasion bactérienne dans l’épithélium sous-jacent. Il est important de noter que, comme les microbiomes bactériens, les phagéomes perturbés ont été associés à une aggravation des résultats dans des maladies telles que les maladies inflammatoires de l’intestin. Des études antérieures ont démontré que les phages peuvent moduler le microbiome des animaux et des humains grâce à des greffes de filtrat fécal, ce qui est bénéfique pour la santé de l’hôte. Cette récente vague de recherche s’accompagne de la nécessité d’établir et de normaliser des protocoles pour étudier les phages dans le contexte du microbiome intestinal. Ce protocole fournit un ensemble de procédures pour étudier les phages T4 isolés et leur hôte bactérien, Escherichia coli, dans le contexte du tractus gastro-intestinal murin. Les méthodes décrites ici décrivent comment partir d’un lysat de phage, l’administrer à des souris et évaluer les effets sur l’hôte bactérien et les niveaux de phages. Ce protocole peut être modifié et appliqué à d’autres paires phage-bactérie et fournit un point de départ pour étudier la dynamique hôte-phage in vivo.

Pour étudier les interactions entre la dyade phage/E. coli T4 dans l’intestin murin, le phage T4 et les lysats de véhicule ont été préparés, nettoyés et purifiés (Figure 1A). Les lysats de phages T4 ont été titrés par test sur plaque et dilués à 2 x 107 pfu/mL (2 x 106 pfu/souris) dans un tampon SM. Les lysats de véhicule ont également été titrés pour confirmer l’absence de présence de phages viables et dilués dans le même volume de tampon SM que le lysat de phage T4. Les niveaux d’endotoxines ont été quantifiés dans des lysats dilués à l’aide d’un kit de quantification d’endotoxines chromogènes. Les lysats de phage T4, de phage inactivé par la chaleur et de véhicule présentaient des niveaux d’endotoxines inférieurs aux niveaux acceptables pour l’eau potable (&lt;20 UE/mL)25 (figure 1B). Comme le lysat du véhicule contenait une quantité d’endotoxine similaire à celle du lysat de phage T4, il a été jugé comme un témoin approprié. Le lysat de phage inactivé par la chaleur (2 x 107 UFP/mL avant traitement thermique) contenait moins d’endotoxines que le lysat de phage véhicule et le lysat de phage T4. Conformément aux instructions de la trousse, les échantillons traités au 1-octanol ont été testés pour l’inhibition du test par l’ajout d’un étalon d’endotoxine au lysat du véhicule (véhicule enrichi), pour donner une concentration finale de 0,5 UE/mL. Les niveaux d’endotoxines des véhicules dopés moins les niveaux d’endotoxines des véhicules étaient de 0,5 UE/mL ±25 %, conformément aux recommandations du fabricant (figure 1B). Cela a démontré que le 1-octanol avait été éliminé avec succès et qu’il n’y avait pas d’inhibition du test causée par les lysats qui pourrait interférer avec les résultats du test.
E. coli Des souris C57BL/6 monocolonisées K-12 (BW25113) ont été élevées dans un isolateur stérile en vinyle à film flexible dans des conditions gnotobiotiques (Figure 2A). Les souris de la génération F0 ont été colonisées par E. coli par son ajout à leur environnement et son cohabitation. Seule la descendance (génération F1 et F2) qui a été colonisée par E. coli dès la naissance par transmission verticale et cohabitation a été utilisée pour les expériences. Cette stratégie contrôlait les changements du système immunitaire, de la production de mucus et du développement du tractus gastro-intestinal qui se produisent en réponse à l’inoculation bactérienne22,37, permettant ainsi de mesurer les changements qui se produisent uniquement en raison de l’introduction de phages. Une fois matures, les souris expérimentales ont été transférées dans des isocages stériles, où elles ont chacune reçu 2 x 106 pfu de phage T4 ou un volume égal de lysat de véhicule par gavage oral à l’âge de 6 à 8 semaines. L’abondance des phages T4 et d’E. coli a été surveillée pendant quatre semaines par prélèvement de boulettes fécales et des tests d’ensemencement localisé sur gélose à 0,5 % (molle) ou gélose à 1,5 %, respectivement. Au cours de cette expérience, le phage T4 et E. coli ont pu coexister sans que l’une ou l’autre population ne soit épuisée (figure 2B, C). L’administration orale de phage T4 à des doses plus faibles de 2 x 102 et 2 x 104 pfu/souris n’a pas réduit la capacité du phage T4 à coloniser l’intestin par rapport à 2 x 106 pfu (Figure 2D). De même, aucun effet dose-dépendant de l’inoculation de T4 sur les niveaux d’E. coli n’a été observé (figure 2E).
Il est important de noter que la cohérence du placage entre les échantillons s’est avérée cruciale pour le nombre de plaques. Par exemple, lors de l’ajout de bactéries dans la gélose molle, il a été déterminé que la densité des bactéries influençait grandement le résultat du test. L’ajout d’E. coli sous-cultivé pendant 1 h, 1,5 h ou 2 h a entraîné un nombre de plaques inférieur à celui de l’ajout d’E. coli sous-cultivé pendant 2,8 h ou plus. De plus, la quantification de la plaque s’est stabilisée à ~1 x 109 ufp/mL lorsque E. coli a été sous-cultivé pendant 2,8 h à 16 h (pendant la nuit), ce qui représente une augmentation d’environ 5 fois par rapport à la valeur calculée à partir d’une sous-culture de 1 h (~2 x 108 ufp/ml) (figure 3A). Plutôt que de sous-culturer, les bactéries cibles peuvent être inoculées dans une gélose molle à partir de cultures de nuit. Ici, le volume de la culture d’E. coli de 16 h (pendant la nuit) qui a été inoculée dans la gélose molle a eu un impact sur le nombre de plaques (figure 3B). Ces résultats indiquent que la densité d’E. coli dans la gélose peut influencer le nombre de plaques. Dans les deux approches, les résultats de quantification des phages plafonnaient à la même valeur (109 UFP/ml), ce qui suggère que les bactéries cibles doivent être d’une densité suffisamment élevée dans la gélose molle pour assurer la précision du comptage des plaques.
Ensemble, ces résultats soulignent l’importance de développer une compréhension de la cinétique des phages-bactéries par des expériences pilotes in vitro et in vivo avant d’effectuer des manipulations expérimentales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig01v2.jpg"> Figure 1 : Préparation des lysats de phages. (A) Flux de travail pour démarrer un lysat de phages à partir d’un stock de phages à titre élevé. Les lysats ont été propagés, nettoyés, concentrés et les endotoxines ont été éliminées. Le 1-octanol contaminant a été éliminé par vide rapide. (B) Les endotoxines ont été quantifiées dans les lysats de phages et de véhicules à l’aide d’un kit de quantification des endotoxines chromogènes. Les lignes bleues pointillées indiquent les limites supérieure et inférieure pour réfuter l’inhibition du produit dans le contrôle de l’inhibition du produit (0,5 UE/mL ± 25 %). Chaque point représente l’une des deux répliques techniques. La hauteur de la barre représente la moyenne entre les répétitions. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig02v2.jpg"> Figure 2 : Génération de souris monocolonisées et surveillance des niveaux de phages et de bactéries dans les boulettes fécales. (A) Flux de travail pour coloniser des souris exemptes de germes avec une seule espèce bactérienne et génération de souris monocolonisées F1 et F2. (B-E) Les niveaux de phage T4 et d’E. coli détectés dans les boulettes fécales de souris C57BL/6 nées monocolonisées par E. coli et inoculées avec le phage T4 à l’âge de 6 à 8 semaines. Au jour 0 (avant la colonisation) et les jours indiqués après la colonisation, les concentrations de phages en T4 ont été mesurées par placage ponctuel et par analyse sur plaque à l’aide de la méthode de la gélose unique. Les niveaux d’E. coli ont été mesurés par placage ponctuel sur une gélose à 1,5 % de LB. (B, C) Cinétique des niveaux de phage (B) T4 et d’E. coli (C) dans les boulettes fécales récupérées après inoculation avec 2 x 106 pfu de lysat de phage ou de véhicule T4 (normalisé pour le volume et les niveaux d’endotoxines). (D, E) (D) les niveaux de phage T4 et (E) d’E. coli dans les boulettes fécales récupérées après inoculation avec 2 x 102 pfu, 2 x 104 pfu ou 2 x 106 pfu de phage T4. Les barres d’erreur représentent la moyenne et l’erreur type de la moyenne (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig02largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig03v2.jpg"> Figure 3 : Précision du dépannage dans les tests sur plaque. (A) Titre de lysat de phage T4 à l’aide de cultures ou de sous-cultures d’E. coli pendant la nuit pour la préparation d’une gélose molle (gélose à 0,5 %, LB). Des sous-cultures ont été réalisées en utilisant une dilution de 1:50 d’une culture d’E. coli pendant la nuit dans des LB fraîches. 5 mL de préparations de gélose molle ont été inoculées avec 100 μL d’E. coli et 20 μL de phage T4. Le CaCl2 et le MgSO4 n’ont pas été ajoutés à la gélose molle pour ces essais, mais peuvent être ajoutés si vous le souhaitez. Les temps de sous-culture d’E. coli inférieurs à 2,8 h ont entraîné une baisse apparente du titre de lysphage. (B) Titre de lysat de phage T4 utilisant différentes densités d’E. coli dans la préparation d’une gélose molle. L’ajout de différents volumes d’E. coli provenant d’une culture de nuit (non sous-cultivée, comme dans A) dans la gélose molle a entraîné des titres de phages apparents différents. Les barres d’erreur représentent l’incertitude calculée du titre de phage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig03largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Les bactériophages (phages), des virus qui infectent les bactéries, font partie intégrante du microbiome intestinal. Bien que ces habitants symbiotiques déterminent la forme physique bactérienne et la dynamique des populations, on comprend peu de choses sur leur impact sur l’homéostasie intestinale et les maladies. Ce protocole étudie des phages T4 isolés dans un modèle murin, adaptable à d’autres paires phage-bactérie.

Interaction entre le bactériophage T4 et E . coli dans l’intestin murin : un modèle prototypique pour l’étude de la dynamique hôte-bactériophage in vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

Notre recherche vise à comprendre les interactions tripartites entre les bactériophages, les bactéries et le système immunitaire des mammifères dans le contexte de l’intestin, de l’intestin gnotobiotique de souris. Nous espérons mieux comprendre ces interactions dans des conditions de santé et de maladie afin de mieux comprendre l’importance du microbiome intestinal. Des développements récents ont montré que les bactériophages peuvent être détectés par le système immunitaire des mammifères.Il a été suggéré que le phageome intestinal humain peut être dérégulé dans des conditions pathologiques telles que les troubles inflammatoires de l’intestin, et que la stimulation immunitaire par les phages pourrait exacerber les phénotypes de la maladie. Notre objectif est de fournir à d’autres un protocole standardisé pour la production d’un lysat de phage T4 pour l’inoculation et le dénombrement dans des modèles murins gnotobiotiques. Ces protocoles peuvent être construits et modifiés pour être utilisés avec d’autres paires de bactéries bactériophages.

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Cet article décrit la procédure à suivre pour la préparation d'une version marquée par fluorescence du bactériophage lambda, l'infection...

Après Cell-sort<em&gt; E. coli</em&gt; Après infection par le phage Lambda

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024).This video demonstrates the in vivo interaction between T4 bacteriophage and E. coli in the murine intestine, and the fecal spot plating method to quantify their coexistence by measuring bacterial colonies and phage plaques.

Assessing the Coexistence of T4 Bacteriophage and E. coli in Murine Fecal Samples

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the purification of bacteriophages from bacterial cell lysates using sequential centrifugation, membrane filtration, chloroform extraction, centrifugal filtration, and buffer exchange to obtain a purified phage preparation.

Purification of Bacteriophages from Bacterial Lysate

Ce protocole décrit une méthode robuste d’utilisation de paramètres à haut débit pour dépister l’efficacité antibactérienne des cocktails de bactériophages.

Efficacité des bactériophages pour le biocontrôle des agents pathogènes d’origine alimentaire évaluée à l’aide de paramètres à haut débit

Nous décrivons un protocole pour identifier les rôles clés des molécules de l'hôte de signalisation dans la réplication lytique d'un virus de l'herpès modèle, gamma herpèsvirus 68 (γHV68). L'utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées et des fibroblastes embryonnaires de γHV68 réplication lytique, le protocole permet à la fois la caractérisation phénotypique et moléculaire de l'interrogatoire interactions virus-hôte dans la réplication virale lytique.

Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d&#39;un virus de l&#39;herpès modèle

Murin de transplantation de moelle osseuse est une technique largement utilisée pour étudier les mécanismes immunologiques qui régissent la réaction du greffon contre l'hôte chez l'homme. La capacité de surveiller les tendances du trafic de cellules...

L&#39;induction de la réaction du greffon contre l&#39;hôte et des maladies<em&gt; In Vivo</em&gt; Suivi des lymphocytes T utilisant un modèle murin MHC-apparié

Nous présentons des méthodes pour l'isolement / culture efficace et rapide de la microglie viable du cortex cérébral néonatal et la moelle épinière adulte. La dissection et le placage de la microglie corticale peuvent être accomplies dans les 90 minutes, avec la récolte des microglies subséquente aura lieu ~ 10 jours suivant la dissection initiale.

Microglia de culture du système nerveux central néonatale et de l&#39;adulte

Les membres du genre Burkholderia sont des agents pathogènes d'importance clinique. Nous décrivons un procédé pour l'extraction totale de la protéine bactérienne, en utilisant une rupture mécanique, et un gel d'électrophorèse 2D pour l'analyse protéomique ultérieure.

Extraction des protéines totales et 2-D Méthodes électrophorèse sur gel pour<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espèces

Ici, un procédé est décrit pour la mise en place d'une infection systémique chez le rat nouveau-né avec des cultures d'Escherichia coli K1. Cette procédure non invasive permettant la colonisation du tractus gastro-intestinal, de la translocation de l'agent pathogène dans la circulation systémique, et l'invasion du système nerveux central chez le plexus choroïde.

Modèle non-invasive de neuropathogènes Escherichia coli Maladies infectieuses chez le rat nouveau-né

La présente étude décrit le développement et les applications d’un système de dosage génétiquement modifié basé sur la transfection de cellules de leucémie basophile de rat avec le gène équin FcεRIα. Les cellules transfectées expriment un récepteur fonctionnel où la libération de médiateurs de la réponse allergique peut être activée par les IgE et l’antigène.

Développement d'un In vitro Système modèle pour l'étude de l'interaction de Equus Caballus IgE avec son récepteur de haute affinité FcsRI

Découvrez les interactions entre le bactériophage T4 et Escherichia coli dans l'intestin murin gnotobiotique. Cette méthode standardisée permet d'étudier la dynamique hôte-bactériophage in vivo et son impact sur la santé intestinale.

Interaction entre le bactériophage T4 et E . coli dans l’intestin murin : un modèle prototypique pour l’étude de la dynamique hôte-bactériophage in vivo (Vidéo) | JoVE Journal

Interaction entre le bactériophage T4 et E . coli dans l’intestin murin : un modèle prototypique pour l’étude de la dynamique hôte-bactériophage in vivo

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