Cristallisation et collecte in situ de données à température ambiante à l’aide de l’installation de cristallisation de Harwell et de la ligne de faisceau VMXi, source de lumière au diamant
8 mars 2024
Nous présentons un protocole pour la cristallisation des protéines à l’aide de l’installation de cristallisation du complexe de recherche à Harwell et la collecte ultérieure de données cristallographiques aux rayons X in situ à partir de cristaux à l’intérieur des plaques sur la ligne de faisceau VMXi (Versatile Macromolecular Crystallography in situ ) de Diamond. Nous décrivons les exigences en matière d’échantillons, les protocoles de cristallisation et les directives de collecte de données.
La compréhension des structures tridimensionnelles des protéines sous-tend la conception de médicaments, la biotechnologie et notre compréhension de nombreuses maladies différentes. Le VMXI détermine les structures des protéines sans refroidissement cryogénique, donc beaucoup plus proches de leurs températures naturelles. Le VMXI mesure également les données de diffraction des cristaux de protéines lorsqu’ils sont encore dans leurs plaques de cristallisation, évitant ainsi tout dommage dû à la manipulation mécanique.
À l’avenir, nous voulons vraiment exploiter l’incroyable débit de VMXI pour explorer de grandes populations de cristaux afin d’identifier de nombreux états structurels différents plutôt que la structure unique que les gens obtiennent souvent aujourd’hui. Nous voulons également pousser vers le développement de médicaments et la réalisation de criblage et d’optimisation de fragments au sein de plaques de cristallisation. Une nouvelle approche très prometteuse.
Aperçu
Cet article présente un protocole de cristallisation des protéines et de collecte in situ de données cristallographiques par rayons X. La méthode utilise la ligne de faisceau VMXi pour analyser les structures protéiques à des températures naturelles, améliorant ainsi la compréhension du comportement des protéines.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie structurale
- Cristallographie
- Analyse des protéines
Contexte
- La compréhension des structures protéiques est essentielle pour la conception de médicaments et la recherche sur les maladies.
- Les méthodes traditionnelles impliquent souvent une cryorefroidissement, qui peut modifier les états des protéines.
- VMXi permet la collecte de données directement à partir de plaques de cristallisation.
- Cette approche minimise les dommages mécaniques aux cristaux dus à la manipulation.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole pour la cristallisation efficace des protéines.
- Exploiter les capacités de VMXi pour l'analyse structurale à haut débit.
- Explorer plusieurs états structuraux des protéines afin d'obtenir de meilleures informations.
Méthodes utilisées
- Crystallisation des protéines dans des plaques NC2.
- Utilisation du système ISPyB pour la gestion des propositions et des expéditions.
- Collecte de données à l'aide de la ligne de faisceau VMXi à 20 degrés Celsius.
- Imagerie et analyse automatisées des gouttes de cristallisation.
Résultats principaux
- Collecte réussie de données de diffraction sans cryorefroidissement.
- Identification d'objets cristallins à l'aide de l'évaluation CHiMP.
- Gestion efficace des groupes d'échantillons et des processus de collecte de données.
- Débit accru pour l'exploration de structures protéiques diverses.
Conclusions
- Le protocole facilite la cristallisation et l'analyse des protéines à haut débit.
- L'approche de VMXi offre des avantages significatifs par rapport aux méthodes traditionnelles.
- Cette méthode présente un potentiel prometteur pour le développement futur de médicaments et la recherche en biologie structurale.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La cristallographie in situ à température ambiante sur VMXi permet une interrogation structurale rapide et à haut débit des protéines, soutenant la découverte précoce de médicaments et la réduction des risques mécanistiques. La collecte directe des données à partir de plaques de cristallisation minimise les artefacts liés à la manipulation des échantillons et accélère la rétroaction sur les résultats de cristallisation, renforçant ainsi la confiance prédictive dans la recherche et le développement basés sur la structure. Ce flux de travail est conçu pour rationaliser la validation des cibles et le criblage fondé sur des fragments, un accès distant mondial permettant une avancée de portefeuille à l'échelle industrielle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une analyse structurale directe des protéines à des températures proches des conditions physiologiques pour la validation fonctionnelle des cibles.
- Permet un test rapide des hypothèses en fournissant un retour immédiat sur les états de cristallisation et de liaison du ligand.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en capturant plusieurs états conformationnels au sein des populations cristallines.
- Améliore la fiabilité prédictive pour la conception de médicaments en aval en minimisant les artefacts induits par la congélation.
Développement de tests et criblage
- Prépare des systèmes de cristallisation validés pour le criblage et l'optimisation de fragments dans des plaques.
- Standardise les flux de travail d'imagerie et de collecte de données à l'aide d'une identification automatisée des cristaux basée sur l'apprentissage machine.
- Permet d'obtenir des résultats structuraux reproductibles et quantitatifs pour une évaluation fiable des composés.
- S'adapte au criblage à haut débit grâce à une acquisition des données basée sur une file d'attente et à une fusion automatisée des données.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne la collecte de données structurales avec des conditions pertinentes pour la maladie en évitant les artefacts liés au refroidissement cryogénique.
- Préserve la continuité translationnelle du stade de découverte à la validation préclinique en soutenant la cristallographie en série.
- Permet une progression ajustée aux risques en permettant une évaluation rapide de la liaison du ligand et des dynamiques protéiques.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode intègre l'ensemble du processus, de la découverte précoce à l'identification de composés leaders, en soutenant la conception basée sur la structure et le criblage de fragments dans un flux de travail unifié et accessible à distance.
- Biologie de la découverte : Accélère le test des hypothèses et la clarification des voies en permettant une détermination rapide et sans artefact de la structure.
- Essais : Fournit des plateformes de cristallisation prêtes à l'emploi et reproductibles, avec imagerie automatisée et collecte des données.
- Analyse : Fournit des données de diffraction quantitatives et une fusion automatisée pour une analyse comparative rigoureuse.
- Recherche translationnelle : Soutient la continuité préclinique en capturant les structures protéiques dans des conditions proches des conditions naturelles.
- Réutilisation en milieu professionnel : Offre une infrastructure évolutible et accessible à distance pour des campagnes structurales répétées dans différents programmes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Standardise et automatise les flux de travail de cristallisation, d'imagerie et de collecte de données.
- Valeur stratégique : Permet des décisions plus rapides d'aller/arrêt et une progression du portefeuille plus efficace en termes de capital.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque et l'avancement rapide des cibles validées structuralement.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en cristallisation des protéines et en interprétation des données de biologie structurale.
- Suppose l'accès à un système d'imagerie automatisé, à une identification des cristaux basée sur l'apprentissage automatique et à une infrastructure de ligne de lumière de synchrotron.
- Exige une standardisation interéquipes pour le suivi des échantillons, la gestion des données et les protocoles d'accès à distance.
- L'adaptation à diverses cibles protéiques et à différentes conditions de cristallisation peut nécessiter une optimisation du protocole.
- Le débit et la qualité des données dépendent de la préparation des échantillons et de la compatibilité des plaques avec les systèmes automatisés.
