Name: Une méthode efficace et rapide pour l’étiquetage et l’analyse des glomérules de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Découvrez une méthode rapide et efficace pour l'étiquetage et l'analyse des glomérules rénaux chez la souris en utilisant le FITC-Dextran et la microscopie à feuille de lumière. Cette technique simplifiée permet une quantification précise du nombre et du volume des glomérules dans le rein entier.

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Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82204951) et du Programme des sciences et technologies du Sichuan (2020JDRC0102).

Des souris C57BL/6 adultes (âgées de 6 semaines, 25-30 g) ont été utilisées dans cette étude. Toutes les procédures ont été effectuées dans le respect des réglementations locales en matière de bien-être animal et d’éthique expérimentale. L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche biomédicale de l’hôpital de l’ouest de la Chine de l’Université du Sichuan.
1. Marquage des glomérules et préparation des tissus
<ol><li>Marquage des glomérules<ol><li>Dissoudre le FITC-dextran (10 mg) dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un rapport de 1 :1 (1 mg : 1 mL) pour préparer la solution de sonde de travail. REMARQUE : La solution de travail peut être conservée à 4 °C pendant 1 mois.</li>
		<li>Placez la souris C57 dans un fixateur de veine de queue de souris. Mouillez la gaze avec de l’eau chaude, enroulez la gaze autour de la partie médiane de la queue de la souris et réchauffez la queue pendant 1 min.</li>
		<li>Essuyez la queue de la souris avec de l’éthanol à 75 % jusqu’à ce que les veines gauche et droite de la queue soient visibles.</li>
		<li>Prélever 100 μL de la solution de sonde de travail à l’aide d’une seringue à insuline de 1 mL et injecter lentement la solution dans la veine de la queue de la souris.</li>
		<li>Après l’injection, laisser circuler la solution de sonde pendant 30 min. Laissez les souris se déplacer librement dans leurs cages.</li>
		<li>Une fois que la circulation est suffisante, anesthésier en profondeur les souris par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (1%, 60-80 μg/kg).</li>
	</ol></li>
	<li>Prélèvement et fixation des reins<ol><li>Fixez les souris anesthésiées à la plaque anatomique en position couchée sur le dos. Fixez leurs pattes avec du ruban adhésif médical.</li>
		<li>Après la préparation de la peau, euthanasier les souris avec une dose létale de pentobarbital sodique (1%, 10 mg / kg).</li>
		<li>Faites une incision abdominale médiane pour exposer la cavité abdominale.</li>
		<li>Révéler les rognons et les retirer à l’aide d’un scalpel et de ciseaux dans la hotte. Retirez délicatement l’enveloppe rénale.</li>
		<li>Prélever les reins et les fixer dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à 4 °C pendant la nuit.</li>
		<li>Laver les échantillons avec du PBS trois fois 1 h chacune en agitant à température ambiante (RT).</li>
		<li>Préparez le rein pour la microscopie.<ol><li>Trancher le rein pour la microscopie confocale : Couper le rein en tranches de 1 mm d’épaisseur à l’aide de la matrice cérébrale (acier de 1 mm, 40-75 g) pour standardiser l’épaisseur de la tranche. Transvaser les tranches dans du PFA à 4 % et poursuivre la fixation à 4 °C pendant la nuit.</li>
			<li>Rein entier pour la microscopie à feuille de lumière : Fixer les reins dans de l’APF à 4 % à 4 °C pendant 48 h.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Dégagement
<ol><li>Préparation des réactifs<ol><li>Préparer le réactif CUBIC-L en mélangeant 10 % (poids/poids) de N-butyldiéthanolamine, 10 % (poids/poids) de Triton X-100 et 80 % de ddH2O.</li>
		<li>Préparer le réactif CUBIC-R en mélangeant 45 % (poids/poids) d’antipyrine, 30 % (poids/poids) de nicotinamide, 0,5 % (vol/vol) de N-butyldiéthanolamine et 24,5 % de ddH2O. Assurez-vous que la solution a un pH de 9,6 à 9,8 et un indice de réfraction (AR) de 1,522. REMARQUE : CUBIC-L est utilisé pour la délipidation et CUBIC-R est utilisé pour l’adaptation de l’indice de réfraction.</li>
	</ol></li>
	<li>Procédure de compensation<ol><li>Prélever les échantillons de rein dans un tube à centrifuger de 50 mL, puis les nettoyer dans CUBIC-L en agitant à 60 tr/min à 37 °C. Remplacer CUBIC-L toutes les 4 h (pour les tranches de rein) ou toutes les 24 h (pour un rein entier) jusqu’à l’obtention d’une transparence optique satisfaisante. REMARQUE : Ce processus prend 1 jour pour les tranches de rein et 5 jours pour un rein entier.</li>
		<li>Lavez les échantillons trois fois dans du PBS en agitant doucement à RT pendant 1 h chacun.</li>
		<li>Appliquer CUBIC-R sur les échantillons en agitant les échantillons à 37 °C, 60 tr/min pendant 6 h.</li>
		<li>Observez directement les échantillons dégagés ou stockez-les dans des tubes noirs remplis de CUBIC-R à RT pendant 1 semaine.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Acquisition d’images
<ol><li>Imagerie confocale REMARQUE : Imagez les échantillons de rein tranchés à l’aide d’une microscopie confocale (lentilles : un objectif Plan Apo λ 4×/0,2 N1 ou un objectif Plan Apo VC 10×/0,45 DIC N1). Capturez de grandes images (par exemple, 6052 μm x 6052 μm pour la tranche de rein) avec des piles z.<ol><li>Mettez le microscope confocal sous tension dans l’ordre suivant : alimentation laser, commutateur de commande confocale, ordinateur, microscope et matériel confocal. Après avoir exécuté l’autotest, allumez le logiciel confocal.</li>
		<li>Sélectionnez l’objectif approprié. Retirez l’échantillon du réactif CUBIC-R, placez-le dans la boîte confocale et couvrez-le pour éviter que le réactif CUBIC-R ne se dessèche.</li>
		<li>Déplacez l’échantillon vers le milieu du champ de vision et ajustez le plan focal jusqu’à ce qu’il soit net.</li>
		<li>Appliquez la reconstruction 3D (étape 3.1.4.1) et la reconstruction d’images de grande taille (étapes 3.1.4.2-3.1.4.3).<ol><li>Reconstruction 3D (confocale) : basculez le plan de zoom dans une direction jusqu’à ce qu’aucune fluorescence ne soit visible ; Cette position est définie comme le sommet. Ensuite, basculez le plan de zoom dans la direction opposée jusqu’à ce qu’aucune fluorescence ne soit visible ; Cette position est définie comme le bas. Cliquez sur le bouton Exécuter dans le coin inférieur droit de la boîte de dialogue pour lancer l’analyse.</li>
			<li>Reconstruction d’une grande image (confocale) : déplacez le champ de vision vers le milieu de l’échantillon et définissez la position actuelle comme centre. Sélectionnez un champ de vision 2 x 2.</li>
			<li>Dans l’interface multifonction ND, sélectionnez la pile Z pour reconstruire des images de grande taille et définir différentes options dans le panneau. Appuyez ensuite sur la touche Exécuter mais à n pour lancer l’analyse.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Imagerie par microscopie à fluorescence à nappe de lumière (LSFM) REMARQUE : Imagez l’ensemble des reins à l’aide d’un microscope à fluorescence à feuille de lumière (objectif : EC Plan-Neofluar 5x/0,16 (Medium n = 1,529)).<ol><li>Exemple de fixation (LSFM) :<ol><li>Collez le rein transparent sur l’adaptateur de fixation de l’échantillon et attendez que le rein soit fermement fixé.</li>
			<li>Faites tremper le rein dans le bac à échantillons et poussez le bac à échantillons dans le système de microscope. Fermez la trappe.</li>
		</ol></li>
		<li>Observer et balayer (LSFM) :<ol><li>Dans l’interface Localiser , déplacez l’échantillon vers une position d’observation appropriée. Passez à l’interface d’acquisition , définissez le chemin optique, sélectionnez le laser 488 nm, LBF 405/488/561/640, bloc de filtre à séparation optique SBS LP 490, sélectionnez Caméra 2 et changez la pseudo-couleur en vert.</li>
			<li>Renseignez la valeur Décalage Z gauche/droite enregistrée précédemment dans le sous-menu Canal . Sélectionnez le zoom le plus petit (0,36) et ajustez-le pour une clarté maximale.</li>
		</ol></li>
		<li>Trouvez la limite X\Y et l’intervalle Z de l’orgue entier. Ajustez l’intensité du laser et le temps d’exposition (de préférence inférieur à 10 ms), puis cliquez sur Exécuter pour commencer.</li>
		<li>Si le tissu est trop grand, fusionnez deux images ou plus à l’aide de l’assemblage d’images. Ouvrez le fichier capturé à l’aide du logiciel de microscopie (ici, ZEISS ZEN 3.7). Sélectionnez Méthode de traitement > > Paramètre Méthode d’assemblage > > Appliquer pour terminer l’assemblage d’images.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Traitement et quantification des données
REMARQUE : Traitez les piles d’images avec le logiciel Imaris (analyse d’images), en utilisant la fonction Surface pour étiqueter les glomérules et effectuer l’analyse.
<ol><li>Comte de glomérules<ol><li>Importez des images de grande taille (microscopie confocale) ou des images assemblées (microscopie à nappe de lumière) dans le logiciel d’analyse d’images.</li>
		<li>Ouvrez les fichiers dans le logiciel d’analyse d’images. Cliquez sur le bouton Surface pour créer une nouvelle Surface. Suivez le guide en bas à gauche de l’écran.<ol><li>Cliquez sur le bouton Suivant (flèche vers la droite) sans rien cocher.</li>
			<li>Cochez la case avant l’option Lissage et entrez un nombre approprié (par exemple, 14,5) pour contrôler les détails de la surface. Sélectionnez Soustraction d’arrière-plan dans Seuillage et remplissez la zone avec le diamètre moyen approximatif des glomérules. Cliquez sur le bouton Suivant .</li>
			<li>Ajustez si nécessaire, puis cliquez sur le bouton Suivant . Sélectionnez la plage appropriée et cliquez sur le bouton Suivant pour créer une surface.</li>
		</ol></li>
		<li>Cliquez sur Filtrer, puis sur le bouton Ajouter pour ajouter de la sphéricité afin de filtrer les objets non sphériques. Cliquez sur le bouton Dupliquer pour copier cette nouvelle surface.</li>
		<li>Cliquez sur le bouton Statistiques , puis sur le bouton Global . le logiciel présentera le nombre de glomérules comme le nombre total de surfaces.</li>
	</ol></li>
	<li>Volume des glomérules<ol><li>Créez une surface des glomérules comme ci-dessus.</li>
		<li>Une fois la surface terminée, cliquez sur le bouton Sélection pour sélectionner les objets cibles et présenter le volume de chaque objet. Cliquez sur le bouton Enregistrer et exportez les statistiques vers une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie.</li>
	</ol></li>
	<li>Volume de la tranche ou du rein entier<ol><li>Importez des images de grande taille (microscopie confocale) ou des images assemblées (microscopie à nappe de lumière) dans le logiciel d’analyse d’images.</li>
		<li>Ouvrez les fichiers dans le logiciel d’analyse d’images. Cliquez sur le bouton Surface pour créer une nouvelle Surface. Suivez le guide en bas à gauche de l’écran.<ol><li>Cliquez sur le bouton Suivant (flèche droite) sans le cocher.</li>
			<li>Cochez la case avant l’option Lissage et entrez un nombre approprié (par exemple, 50) pour contrôler les détails de la surface. Sélectionnez Intensité absolue dans Seuillage. Cliquez sur le bouton Suivant .</li>
			<li>Ajustez la surface jusqu’à ce qu’elle recouvre l’ensemble du tissu, puis cliquez sur le bouton Suivant . Cliquez sur le bouton Suivant pour créer la surface.</li>
		</ol></li>
		<li>Cliquez sur le bouton Sélection pour sélectionner la surface de l’ensemble du tissu et présenter le volume du tissu. Cliquez sur le bouton Enregistrer pour exporter les statistiques vers une feuille de calcul.</li>
	</ol></li>
</ol>

Marquage fluorescent de glomérules dans des reins de souris dégagés pour la microscopie

<ol><li>Hoy, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number%2C+glomerular+volume%2C+renal+disease+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).</li>
<li>Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nephron+number%3A+implications+for+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Human nephron number: implications for health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).</li>
<li>Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+number+and+size+in+relation+to+age%2C+kidney+weight%2C+and+body+surface+in+normal+man%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man.</a> The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).</li>
<li>Rasch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+diabetic+glomerulopathy+in+streptozotocin+diabetic+rats+by+insulin+treatment.+Kidney+size+and+glomerular+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume.</a> Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).</li>
<li>Puelles, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+number+and+size+variability+and+risk+for+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Glomerular number and size variability and risk for kidney disease.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).</li>
<li>Bertram, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+and+how+we+determine+nephron+number%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Why and how we determine nephron number.</a> Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).</li>
<li>Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+numbers+of+glomeruli+and+individual+glomerular+cell+types+in+the+normal+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney.</a> Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).</li>
<li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li>
<li>Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+renal+glomeruli+with+the+new+stereology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">Analyzing renal glomeruli with the new stereology.</a> International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).</li>
<li>Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+biopsies+can+be+used+for+estimations+of+glomerular+number+and+volume%3A+a+pig+study%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv%22%5BJournal%5D)">Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study.</a> Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).</li>
<li>Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+glomerular+volume%3A+a+comparison+of+four+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods.</a> Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).</li>
<li>Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurements+of+kidney+glomerular+number+and+size+in+healthy+and+Os%28%2F%2B%29+mice+using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cationic+near+infrared+fluorescent+agent+and+ethyl-cinnamate+tissue+clearing+protocol+for+vascular+staining+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 521(2019).</li>
<li>Beeman, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+glomerular+number+and+size+in+perfused+kidneys+using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).</li>
<li>Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+glomerular+number+in+situ+using+magnetic+resonance+imaging+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy.</a> Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).</li>
<li>Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+molecular+imaging+of+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Label-free molecular imaging of the kidney.</a> Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).</li>
<li>Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+thick+and+thin+section+method+for+estimation+of+podocyte+number%2C+glomerular+volume%2C+and+glomerular+volume+per+podocyte+in+rat+kidney+with+Wilms%27+tumor-1+protein+used+as+a+podocyte+nuclear+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Lloyd-Lewis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+mammary+gland+and+mammary+tumours+in+3D%3A+optical+tissue+clearing+and+immunofluorescence+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 127(2016).</li>
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<li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li>
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<li>Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+can+see+clearly+now%3A+optical+clearing+and+kidney+morphometrics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).</li>
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<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+A+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Bai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+effective+vascular+network+labeling+method+for+transparent+tissues+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice.</a> Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042(2023).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+imaging+methods+for+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Iscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development.</a> Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).</li>
<li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+technique%3A+Recent+progress+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li>
<li>Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+CLARITY-based+tissue+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Therapeutic%22%5BJournal%5D)">Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging.</a> Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).</li>
<li>Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cleared+intact+biological+systems+at+a+cellular+level+by+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382(2014).</li>
</ol>

Tous les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Les technologies de nettoyage des tissus peuvent être classées en 3 ou 4 groupes 29,30,31. L’élimination des tissus à base de solvants organiques (p. ex., DISCO et PEGASOS), l’élimination des tissus à base d’eau (p. ex., CUBIC) et l’élimination des tissus d’enrobage d’hydrogel (p. ex., CLARITY) ont toutes été appliquées dans le nettoyage des reins 25,26,28,32. CUBIC, comme nous l’avons démontré, fonctionne mieux lorsque les glomérules (récipients) sont étiquetés avec FITC-Dextran. De plus, CUBIC a un processus de fonctionnement relativement plus pratique et ne nécessite pas plus que des lentilles microscopiques ordinaires27, car les échantillons traités n’ont pas besoin d’être trempés dans des réactifs organiques33. Cependant, les différentes méthodes de dédouanement et d’étiquetage des navires ont leurs propres avantages et inconvénients ; Les chercheurs devront peut-être expérimenter différentes approches pour répondre à leurs besoins spécifiques.
Des études antérieures ont remarqué que les glomérules pouvaient être marqués dans les reins clairsemés lorsque les vaisseaux sanguins dans les reins étaient étiquetés 13,25,26,28. Une explication approfondie de ce phénomène doit encore être étudiée plus avant, mais on peut en déduire qu’une bonne méthode de marquage du système vasculaire marque également efficacement les glomérules. Sur la base des résultats expérimentaux, nous recommandons l’injection intravasculaire de FITC-Dextran avec un poids moléculaire moyen (tel que 150 kDa). Cependant, étant donné que l’étiquetage repose sur la circulation sanguine, cette méthode peut ne pas marquer les glomérules lorsqu’ils manquent de circulation.
Le LSFM permet l’observation des tissus à grande échelle, ce qui le rend plus adapté à la détection des glomérules rénaux entiers. Cependant, les microscopes à feuille de lumière peuvent ne pas être disponibles dans tous les laboratoires. Nous proposons donc un ensemble alternatif de protocoles utilisant des microscopes confocaux ordinaires. Bien que le rein doive être découpé en plusieurs sections, il est possible d’obtenir des données telles que le nombre et le volume de glomérules dans l’ensemble du rein. En outre, la microscopie confocale fournit un plus petit volume de données, ce qui est plus facile à traiter les données.
Imaris fournit une sortie directe des données. Cependant, il faut veiller à faire correspondre étroitement le signal analogique à l’original. De plus, le logiciel peut prendre beaucoup de temps pour traiter des fichiers volumineux, ce qui peut être frustrant. Tant que les glomérules peuvent être clairement étiquetés et visualisés, il existe plus d’une solution unique pour l’analyse des données. Les chercheurs de différents laboratoires ont pu travailler avec leurs propres logiciels et langages de programmation familiers.

Le nombre et le volume des glomérules sont très importants pour le diagnostic et le traitement de diverses maladies rénales 1,2,3,4,5. L’étalon-or de l’estimation du nombre de glomérules est la combinaison dissecteur/fractionneur physique. Cependant, cette méthode nécessite des réactifs et des équipements spéciaux, ce qui la rend lente et coûteuse 6,7,8,9. La biopsie fournit une mine d’informations, mais il est évident que cette méthode ne convient qu’à des estimations approximatives10,11. Les technologies d’imagerie médicale, y compris l’imagerie par résonance magnétique (IRM), la tomodensitométrie (TDM) et les rayons X, sont également largement utilisées dans la détection glomérulaire 12,13,14,15, mais ces technologies nécessitent des instruments encombrants. De nouvelles méthodes, telles que le spectromètre de masse imageur par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI)16 ou la méthode des sections épaisses et minces17, ont également été utilisées pour la détection glomérulaire, bien qu’elles restent fastidieuses et laborieuses.
À l’aide des technologies de transparence, il est possible d’observer des profondeurs plus profondes et d’obtenir des informations plus riches et plus complètes à partir de tissus épais ou même d’organes entiers 18,19,20,21,22,23. Par conséquent, les technologies de transparence ont été largement utilisées dans la recherche sur les reins24. L’observation et la détection des glomérules dans les reins dégagés sont également impliquées. Cependant, ces articles publiés ne faisaient que brièvement référence à la détection glomérulaire25 ou utilisaient des méthodes de marquage difficiles à réaliser telles que des animaux transgéniques26, des colorants autoproduits13 ou l’incubation d’anticorps à haute concentration27 pour marquer les glomérules. De plus, bien que des études aient analysé des glomérules dans des reins dégagés, les analyses étaient toujours limitées13 ou reposaient sur des algorithmes d’analyse établis par les auteurs eux-mêmes26.
Nous avons déjà démontré un moyen plus pratique d’étiqueter les glomérules dans les reins de souris28. En utilisant Imaris, nous avons constaté que le nombre, la fréquence et le volume des glomérules pouvaient être obtenus rapidement. Ainsi, nous présentons ici un ensemble de méthodes plus accessibles, complètes et simplifiées pour étiqueter et analyser les glomérules des reins de souris.

<table><tbody><tr><td>4 % PFA</td><td>Biosharp</td><td>7007171800</td><td>Fixation reaagen</td></tr><tr><td>502 Colle&nbsp ;</td><td>Deli</td><td>7146</td><td>Pour la fixation du rein à l’adaptateur de fixation de l’échantillon&nbsp ;</td></tr><tr><td>Antipyrine</td><td>Aladdin</td><td>A110660</td><td>Réactif de clarification</td></tr><tr><td>Brain Matrix</td><td>RWD Life Science</td><td>1mm 40-75</td><td>Découpe de tissus</td></tr><tr><td>Microscopie confocale</td><td>Nikon</td><td>A1plus</td><td>Acquisition d’images</td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD150S</td><td>Réactif de marquage</td></tr><tr><td>Feuille de lumière microscopie à fluorescence&nbsp ;</td><td>Feuille Zeiss</td><td>Light 7&nbsp ;</td><td>Acquisition d’images</td></tr><tr><td>Souris</td><td>Ensiweier</td><td></td><td>Adult C57BL/6 souris (6 semaines, 25 po ; 30 g)&nbsp ;</td></tr><tr><td>N-Butyldiéthanolamine</td><td>Aladdin</td><td>B299095</td><td>Réactif de clarification</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Aladdin</td><td>N105042</td><td>Réactif de clarification</td></tr><tr><td>Pentobarbital Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Fixateur de veine de queue</td><td>JINUOTAI</td><td>JNT-FS35</td><td>Fixer la souris pour injection de voile</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Réactif de clarification</td></tr></tbody></table>

une méthode efficace et rapide pour l’étiquetage et l’analyse des glomérules de souris

An Efficient and Fast Method for Labeling and Analyzing Mouse Glomeruli

Les glomérules sont des unités fondamentales dans le rein ; Par conséquent, l’étude des glomérules est essentielle pour comprendre la fonction rénale et la pathologie. L’imagerie biologique fournit des informations intuitives ; Il est donc d’une grande importance d’étiqueter et d’observer les glomérules. Cependant, les méthodes d’observation des glomérules actuellement utilisées nécessitent des opérations compliquées, et les résultats peuvent perdre des détails d’étiquette ou des informations tridimensionnelles (3D). La technologie d’élimination des tissus (CUBIC) a été largement utilisée dans la recherche rénale, permettant une détection plus précise et une profondeur de détection plus profonde. Nous avons constaté que les glomérules de souris peuvent être marqués rapidement et efficacement par injection dans la veine caudale de FITC-Dextran de poids moléculaire moyen, suivie de la méthode de nettoyage CUBIC. Le rein de souris nettoyé pourrait être scanné par un microscope à feuille de lumière (ou un microscope confocal lorsqu’il est tranché) pour obtenir des empilements d’images tridimensionnelles de tous les glomérules dans l’ensemble du rein. Traités à l’aide d’un logiciel approprié, les signaux des glomérules pourraient être facilement numérisés et analysés pour mesurer le nombre, le volume et la fréquence des glomérules.

Cette étude fournit une méthode simple et efficace pour marquer et analyser les glomérules dans les reins de souris.
Les glomérules (vaisseaux sanguins) peuvent être bien marqués par injection intravasculaire de FITC-Dextran. Après le processus de clairification, le rein est devenu transparent (Figure 1A) et les glomérules ont pu être clairement observés à l’aide de la microscopie à feuillet de lumière (Figure 1B) ou de la microscopie confocale (Figure 1C). La microscopie confocale a une profondeur de balayage limitée, de sorte que les reins doivent être coupés en tranches d’environ 1 mm d’épaisseur. Si l’on utilise un microscope à feuille de lumière, le rein entier peut être scanné directement.
Avec les signaux clairs, il était facile de compter le nombre de glomérules. En fait, l’étiquetage était si efficace que les glomérules pouvaient être comptés à l’œil nu. Le volume des glomérules a également pu être mesuré directement. Bien sûr, des logiciels tels qu’Imaris ont considérablement accéléré ce processus. À l’aide de la fonction Surface , tous les glomérules d’une tranche de rein (Figure 2), d’un rein entier (Figure 3) ou d’une bandelette (Figure 4) pouvaient être sélectionnés, et le nombre et le volume des glomérules pouvaient être obtenus directement (Figure 2C, Figure 3C, Figure 4C). Le volume de la région sélectionnée peut également être mesuré (Figure 2B, Figure 3B, Figure 4B), de sorte que le rapport de volume et la fréquence des glomérules dans une certaine région ou dans l’ensemble du rein peuvent être calculés (Figure 2D, Figure 3D, Figure 4D). Une zone du rein peut être sélectionnée pour effectuer des calculs dans des régions spécifiques. Nous avons présenté une bandelette semblable à une biopsie. Le nombre, le volume et la fréquence des glomérules dans la bandelette ont également pu être obtenus facilement (figure 4).
Comme le montrent les figures, les résultats présentés dans cette étude sont (N = nombre, F = fréquence, V = volume, V(a) = volume moyen, V(t) = volume total) :
Nglomérules dans la tranche = 1128, Nglomérules dans le rein entier = 14006, Fglomérulaire dans la tranche = 65 par mm3, Fglomérulaire dans le rein entier = 105 par mm3, Vglomérules totaux dans la tranche/V tranche = 2,24%, Vglomérules totaux dans le rein entier/V rein = 5,54%, V(a)glomérules dans la tranche = 373654 μm3, V(a)glomérules dans le rein entier = 521627 μm3, V(t)glomérules dans la coupe = 421481724 μm3, V(t)glomérules dans le rein entier = 7305386256 μm3 (Figure 2D, Figure 3D).
N glomérules en bandelette = 63,F glomérules en bandelette = 72 par mm3,V glomérules totaux en bande/bande V = 2,23 %, V(a)glomérules en bandelette = 307698 μm3, V(t)glomérules en bandelette = 19384977 μm3 (Figure 4D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65973/65973fig01.jpg"> Figure 1 : Transparence du tissu rénal et glomérules marqués au FITC-dextran. (A) Rein avant et après le traitement par transparence. (B) L’image d’un rein entier scanné avec LSFM. (C) L’image d’une tranche de rein scannée au microscope confocal (à gauche : 4x, à droite : 10x). barre d’échelle = 300 μm (4x, confocale) ; barre d’échelle = 100 μm (10x, confocale). ; barre d’échelle = 700 μm (5x, zoom 0,36, LSFM). Les glomérules ont été marqués avec FITC-Dextran. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65973/65973fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65973/65973fig02.jpg"> Figure 2 : La fonction Surface appliquée à la tranche de rein confocale scannée. (A) La surface de la tranche et tous les glomérules sont créés. Rose = glomérules, bleu = surface de la tranche de rein, vert = étiquette d’origine des vaisseaux (glomérules et certains gros vaisseaux). Barre d’échelle = 300 μm. (B) Lorsque la surface de la tranche (à gauche) ou les glomérules (à droite) sont sélectionnés (les objets sélectionnés deviennent jaunes), les données peuvent être obtenues directement (la boîte en pointillés met en surbrillance l’endroit où elles montrent les données). (C) Le nombre, le volume de chaque glomérule et le volume des glomérules totaux peuvent être obtenus directement, ainsi que le volume de la tranche. (D) Les données exportées pourraient faire l’objet d’une analyse plus poussée afin d’établir le calcul, tel que le volume moyen des glomérules et le rapport volumique des glomérules et de la zone sélectionnée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65973/65973fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65973/65973fig03.jpg"> Figure 3 : La fonction Surface appliquée au rein entier scanné par LSFM. (A) La surface de l’ensemble du rein et de tous les glomérules est créée. Rose = glomérules, bleu = surface de l’ensemble du rein, vert = étiquette d’origine des vaisseaux (glomérules et certains gros vaisseaux). Barre d’échelle = 1000 μm. (B) Lorsque la surface du rein (à gauche) ou les glomérules (à droite) sont sélectionnés (les objets sélectionnés deviennent jaunes), les données peuvent être obtenues directement (les cases en pointillés surlignent là où elles montrent les données). (C) Le nombre, le volume de chaque glomérule et le nombre des glomérules peuvent être obtenus directement, ainsi que le volume du rein. (D) Les données exportées pourraient faire l’objet d’une analyse plus poussée afin d’établir le calcul, tel que le volume moyen des glomérules et le rapport volumique des glomérules et du rein entier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65973/65973fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65973/65973fig04.jpg"> Figure 4 : La fonction Surface appliquée à la bandelette rénale sélectionnée. (A) La surface de la bandelette et tous les glomérules sont créés. Rose = glomérules, bleu = extérieur Surface de la bandelette rénale, vert = étiquette d’origine des vaisseaux (glomérules et certains gros vaisseaux). Barre d’échelle = 150 μm. (B) Lorsque la surface de la bande (à gauche) ou les glomérules (à droite) sont sélectionnés (les objets sélectionnés deviennent jaunes), les données peuvent être obtenues directement (les cases en pointillés surlignent l’endroit où les données sont affichées). (C) Le nombre, le volume de chaque glomérule et le volume des glomérules totaux peuvent être obtenus directement, ainsi que le volume de la bande. (D) Les données exportées pourraient faire l’objet d’une analyse plus poussée afin d’établir le calcul, tel que le volume moyen des glomérules et le rapport volumique des glomérules et de la zone sélectionnée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65973/65973fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Cette étude présente un ensemble de méthodes simples et faciles à utiliser pour marquer et analyser les glomérules des reins de souris nettoyés par CUBIC. Des données telles que le nombre et le volume du glomérule peuvent être obtenues facilement et de manière fiable à l’aide de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-Dextran, de la microscopie à fluorescence à feuille de lumière (LSFM) ou de la microscopie confocale commune et de logiciels tels qu’Imaris.

Une méthode efficace et rapide pour l’étiquetage et l’analyse des glomérules de souris

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological ...

L’étiquetage et le comptage des glomérules à l’aide de méthodes conventionnelles peuvent être compliqués, fastidieux, longs et des instruments encombrants sont nécessaires. Notre méthode offre une méthode de marquage instantanée et intuitive pour l’analyse des glomérules dans l’ensemble du rein. Notre technique est une méthode rapide, facile, précise et peu coûteuse pour analyser les glomérules dans l’ensemble du rein.Il ne nécessite aucun équipement spécial, il peut donc être réalisé dans n’importe quel laboratoire. Il s’agit d’une méthode révolutionnaire, rapide et simple pour marquer les glomérules, permettant une observation intuitive de tous les glomérules dans l’ensemble du rein. Il a un grand potentiel pour aider les chercheurs à faire des percées significatives dans l’étude du rein en fournissant des informations telles que la quantité, le volume, la distribution des glomérules, etc.D’une part, nous explorons l’application de cette méthode de marquage des glomérules dans la recherche clinique sur les maladies rénales. D’autre part, nous continuerons à travailler sur l’amélioration des méthodes de marquage des biocibles telles que les vaisseaux sanguins ou des protéines spécifiques dans les tissus transparents, en les ajustant pour répondre à nos besoins de recherche.

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Biologie

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