Name: Fabrication et caractérisation d’organoïdes de cancer colorectal à partir de la lignée cellulaire SW1222 dans une matrice peptidique auto-assemblée ultracourte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Apprenez à fabriquer des organoïdes de cancer colorectal à partir de la lignée SW1222 dans une matrice peptidique auto-assemblée ultracourte. Cette méthode optimise la morphologie et la viabilité pour la médecine régénérative.

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Ce travail a été soutenu financièrement par l’Université des sciences et de la technologie du roi Abdallah. Les auteurs remercient la subvention du fonds d’amorçage de KAUST et le fonds d’innovation de KAUST décerné par l’innovation et le développement économique de KAUST. Les auteurs tiennent à remercier les laboratoires de biosciences et d’imagerie de KAUST pour leur soutien à la caractérisation biologique et aux analyses de microscopie.

1. Préparation du tampon et de la solution
REMARQUE : Toutes les concentrations indiquées sont des concentrations finales.
<ol><li>Ajoutez du sérum fœtal bovin (FBS) et de la pénicilline-streptomycine à une concentration finale de 10 % et 1 %, respectivement, pour préparer le milieu Dulbecco’s modifié (IMDM) complet d’Iscove. Conserver à l’obscurité à 4 °C jusqu’à 1 mois.</li>
	<li>Mélangez du MgCl2 (3 mM), du saccharose (300 mM) et du Triton X-100 (0,5 %) dans une solution saline tampon phosphate (PBS) pour préparer le tampon de perméabilisation. Conservez cette solution à 4 °C jusqu’à 2 mois.</li>
	<li>Combinez l’albumine sérique bovine (BSA, 1%), la glycine (0,3 M) et le Tween-20 (0,1%) dans du PBS pour préparer un tampon de blocage. Conservez cette solution à 4 °C jusqu’à 2 mois.</li>
	<li>Diluer 10x à 2x PBS avec de l’eau ultra-pure dans des conditions stériles. Conservez cette solution à température ambiante pendant plus de 6 mois.</li>
	<li>Stérilisez 3 mg de poudre de peptide sous lumière ultraviolette pendant 30 min. Ajouter 500 μL d’eau ultrapure à dissoudre à l’aide d’un mélangeur vortex. REMARQUE : La concentration finale doit être le double de la concentration cible, c’est-à-dire 6 mg/mL, car la concentration 1x sera de 3 mg/mL.</li>
</ol>2. Fabrication d’organoïdes du cancer colorectal à partir de SW1222 dans un peptide
<ol><li>Décongelez une aliquote pendant la nuit à 4 °C et conservez-la dans de la glace jusqu’à ce qu’il soit nécessaire de préparer le contrôle de la matrice du sous-sol.</li>
	<li>Placez une gouttelette de 10 μL de solution peptidique 2x au centre de chaque puits dans une plaque à 24 puits. Laisser incuber la plaque à température ambiante pendant 10 min. Vous pouvez également déposer 8 à 10 gouttelettes par puits dans une plaque à 6 puits. REMARQUE : Les échantillons destinés à être utilisés en microscopie confocale et électronique sont plus accessibles à la manipulation s’ils sont ensemencés sur une lamelle stérile.</li>
	<li>Ajouter 10 μL de 2x PBS. Mélangez doucement la solution PBS à l’aide de l’embout. Laissez les gels se stabiliser pendant au moins 20 min, en veillant à ce que les gouttelettes restent presque intactes. REMARQUE : L’objectif de l’ajout de PBS et du mélange doux est de maintenir l’intégrité de la gouttelette et d’éviter de répandre l’hydrogel en une couche.</li>
	<li>Détachez les cellules SW1222 à l’aide d’une solution de trypsine-EDTA à 0,125 % (5 ml). Incuber les cellules avec de la trypsine à 37 °C pendant 5 à 10 minutes jusqu’à ce qu’elles se détachent du ballon. Abstenez-vous de tapoter le ballon pour éviter l’agglutination des cellules.</li>
	<li>Ajouter 5 mL de milieu complet pour inactiver la trypsine. Filtrez la suspension cellulaire à l’aide d’une crépine de 30 μm. Alternativement, utilisez une seringue avec une aiguille de 25 G pour perturber les agrégats.</li>
	<li>Préparez une suspension cellulaire de 0,4 × 106 cellules/mL et injectez 2 μL de la suspension cellulaire dans chaque gouttelette peptidique à l’aide d’une micropipette de 10 μL.</li>
	<li>Incuber les gouttelettes pendant 30 min à 37 °C, 5% CO2. Ajouter 0,5 mL de milieu supplémenté dans chaque puits après l’incubation.</li>
	<li>En attendant, préparer le contrôle de la matrice de la membrane basale en diluant le stock principal (8-12 mg/mL, selon le lot) jusqu’à une concentration finale de 3 mg/mL à l’aide du milieu supplémenté. Ajoutez des cellules à cette solution (800 cellules par 25 μL). REMARQUE : La manipulation de la membrane basale doit être effectuée sur de la glace en tout temps. Les pointes doivent être rincées dans du PBS glacé avant de toucher l’hydrogel. Sinon, la polymérisation se produira à l’intérieur des pointes.</li>
	<li>Déposer 20 gouttelettes de 20 μL de la solution de membrane basale dans chaque puits. Laisser les gouttelettes se gélifier en les laissant incuber pendant 20 minutes à 37 °C. Une fois le matériau gélifié, ajoutez 0,5 mL de milieu complet.</li>
	<li>Changez de milieu tous les 3-4 jours. Observez les cellules s’organiser et montrer des signaux de formation de lumière dès le jour 4.</li>
	<li>Imagez des cellules en fond clair les jours 1, 4 et 7 pour évaluer la croissance des organoïdes.</li>
</ol>3. Viabilité et prolifération
<ol><li>Préparez trois plaques à puits noirs pour l’essai de viabilité et trois plaques à puits noirs pour l’essai de prolifération. Ajouter 25 μL de solution peptidique 2x par puits et géler en utilisant le même volume de PBS 2x. Ensemencez les cellules comme décrit ci-dessus.</li>
	<li>Préparez trois puits pour chaque formulation d’hydrogel peptidique à utiliser comme blancs dans la plaque de prolifération. N’ensemencez pas de cellules sur ceux-ci.</li>
	<li>Retirez le milieu de la plaque de puits de viabilité et lavez avec 1x PBS pendant 3 x 5 min.</li>
	<li>Diluer le calcéin-AM et l’homodimère d’éthidium à 8 μM du kit de viabilité/cytotoxicité pour cellules de mammifères (voir la table des matériaux) dans le même tube conique protégé contre la lumière. Pour préparer 2 ml de cette solution à 2 ml de PBS dans un tube conique protégé contre la lumière, ajoutez 4 μL de la solution mère de Calcein-AM et 8 μL de la solution mère d’homodimère-1 d’Ethidium.</li>
	<li>Ajouter la solution d’homodimère de calcéine/éthidium préparée à l’étape 3.4 dans la plaque à 96 puits. Ajouter 100 μL par puits. Protéger de la lumière et incuber à température ambiante pendant 30 min.</li>
	<li>Laver pendant 3 x 5 min avec 1x PBS. Imagez un minimum de trois champs (centre, haut, bas) lors de l’utilisation d’un objectif 4x ou un minimum de cinq champs (centre, haut à gauche, haut à droite, bas à gauche, en bas à droite) lors de l’utilisation d’un objectif 10x et 20x sous un microscope à fluorescence.</li>
	<li>Retirer le fluide de la plaque de puits de prolifération pour obtenir un volume final de 90 μL.</li>
	<li>Ajouter 10 μL de solution d’Alamar Blue (voir tableau des matériaux) pour atteindre une concentration finale de 10 %.</li>
	<li>Protéger de la lumière et incuber pendant 2 à 4 h à 37 °C, 5% CO2</li>
	<li>Utilisez un lecteur de plaque à puits pour mesurer la fluorescence (Ex/Em = 530-560/590 nm/nm) ou l’absorbance (570 nm). Faites la moyenne des valeurs obtenues pour les blancs et soustrayez-les des valeurs de chaque puits contenant des cellules.</li>
	<li>Calculez les valeurs de prolifération en faisant la moyenne du signal de chaque condition et en soustrayant la moyenne de leurs flans respectifs. Créez des graphiques en générant une boîte à moustaches indexée du signal d’absorbance/fluorescence relatif en fonction du temps.</li>
</ol>4. Dosage de l’adhérence des cellules à la matrice
<ol><li>Préparez 100 μL d’hydrogels peptidiques dans deux plaques indépendantes de 96 puits.</li>
	<li>Ensemencez 20 000 cellules dans chaque puits et ajoutez 100 μL de milieu. Incuber les plaques pendant 90 min à 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Après l’incubation, ne prélever qu’une seule plaque et remettre délicatement le milieu en suspension à l’aide d’une micropipette P200 pendant 20-30 s. Attention à ne pas perturber l’hydrogel en gardant l’embout du gel. Alternativement, si les propriétés mécaniques de l’hydrogel le permettent (G' > 8 000 Pa), tapotez les quatre côtés de la plaque du puits à l’aide d’un vortex en mouvement. REMARQUE : La remise en suspension du média (ou le tapotement de la plaque du puits avec le vortex) enlèvera à la fois les cellules non attachées et les cellules avec une adhérence ténue à la surface de la matrice. La fixation cellulaire se produira dans les 90 minutes, bien que la force de cette attache varie en fonction des hydrogels peptidiques spécifiques et de leurs propriétés adhésives et liantes. La croissance des organoïdes colorectaux est connue pour être favorisée dans les matrices avec des valeurs de rigidité inférieures à 2 000 Pa. Par conséquent, parce que les hydrogels présentés dans ce protocole sont mous et cassants, nous mettons un point d’honneur à utiliser une contrainte mécanique douce.</li>
	<li>Retirez 100 μL de milieu des deux plaques à puits et ajoutez une fois le lavage avec 1x PBS.</li>
	<li>Préparez une solution de DAPI de 1 μg/mL. Ajouter 100 μL de la solution DAPI dans tous les puits et incuber pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Imagez un nombre représentatif de champs au microscope à fluorescence. Assurez-vous que toutes les images sont obtenues en utilisant le même objectif pour maintenir le rapport pixel/distance constant. REMARQUE : Imaginez neuf trames pour un objectif 10x ou 15 trames avec un objectif 20x.</li>
	<li>Chargez les images de fluorescence sur un logiciel d’analyse d’images (par exemple, ImageJ) et analysez les particules sur toutes les images.<ol><li>Dans le menu Image , sélectionnez Type et cliquez sur 8 bits.</li>
		<li>Dans le menu Image , sélectionnez Ajuster et cliquez sur Luminosité/Contraste. Cliquez sur le bouton Auto | Postuler.</li>
		<li>Dans le menu Image , sélectionnez Ajuster et cliquez sur Seuil. Cliquez sur le bouton Auto et fermez la fenêtre.</li>
		<li>Dans le menu Analyser , cliquez sur Analyser les particules. Cochez l’option de résumé et cliquez sur OK.</li>
		<li>Dans la fenêtre Résumé , passez la souris sur le menu Fichier et cliquez sur Enregistrer pour enregistrer les valeurs récapitulatives.</li>
	</ol></li>
	<li>Exportez les résultats de toutes les images vers un logiciel de statistiques standard.</li>
	<li>Calculez le pourcentage de surface couverte par les cellules avant et après le stress. Faites une boîte à moustaches indexée du pourcentage de surface par rapport à chaque condition.</li>
</ol>5. Immunomarquage d’organoïdes dans un hydrogel peptidique
<ol><li>Ensemencez 800 cellules dans des gouttelettes de 20 μL d’hydrogel peptidique pendant 4 jours, comme décrit aux étapes 2.1 à 2.10.</li>
	<li>Le jour 4, retirez le milieu et lavez chaque puits 2x avec 1x PBS.</li>
	<li>Ajouter 400 μL d’une solution de formaldéhyde à 4 %. Incuber la plaque à puits pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirez la solution de formaldéhyde avec un P1000 et lavez une fois avec 1x PBS.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon de perméabilisation et incuber 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirez le tampon de perméabilisation avec un P1000 et lavez-le une fois avec 1x PBS.</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL de tampon de blocage et incuber pendant 30 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Retirez le tampon de blocage avec un P1000 et lavez-le avec 1x PBS.</li>
	<li>Diluez l’anticorps primaire dans le tampon de blocage conformément aux instructions du fabricant (voir la table des matériaux). Ajouter 200 μL dans deux puits.</li>
	<li>Incuber toute la nuit à 4 °C.</li>
	<li>Retirez la solution de coloration avec un P200 et lavez une fois avec 1x PBS.</li>
	<li>Diluez l’anticorps secondaire dans un tampon bloquant, selon les instructions du fabricant (voir la table des matériaux). Ajouter le conjugué de la phalloïdine dans un rapport de 1:40 dans la solution d’anticorps secondaire.</li>
	<li>Protéger de la lumière et incuber à température ambiante pendant 3 h maximum. Retirez la solution de coloration avec un P200 et lavez une fois avec 1x PBS.</li>
	<li>Préparez une solution de DAPI de 1 μg/mL dans la mémoire tampon de blocage. Ajouter 300 μL de la solution DAPI dans chaque puits.</li>
	<li>Protéger de la lumière et incuber 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirez la solution de coloration avec un P200 et lavez une fois avec 1x PBS.</li>
	<li>Protéger de la lumière et conserver à 4 °C jusqu’à 7 jours.</li>
</ol>6. Imagerie et analyse d’images d’organoïdes dans la matrice
<ol><li>Imagez les échantillons colorés à l’aide d’un microscope à épifluorescence à 10x. Utilisez uniquement les canaux phalloïdine et DAPI.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel Cellopose et appuyez sur ctrl + L pour charger une image. Comme le logiciel aura accès à tous les fichiers à l’emplacement de l’image sélectionnée, assurez-vous d’enregistrer toutes les images de fluorescence à l’emplacement exact sans avoir de sous-dossiers.</li>
	<li>Entrez le diamètre moyen des colonies dans le panneau Segmentation et cliquez sur ENTRÉE.</li>
	<li>Sélectionnez un modèle personnalisé pour les organoïdes du côlon et cliquez sur le bouton Exécuter le modèle . REMARQUE : Ici, nous vous suggérons d’utiliser deux modèles à partir de zéro dans Cellpose2.029,30</li>
	<li>Appuyez sur ctrl + s pour enregistrer les masques sous forme de fichier .npy.</li>
	<li>Utilisez les flèches du clavier pour parcourir les images du dossier et exécutez le modèle d’organoïdes deux-points sur toutes les images du dossier.</li>
	<li>Faites une copie du dossier et répétez les étapes 6.2 à 6.6 en utilisant un modèle pour la lumière organoïde du côlon.</li>
	<li>Ouvrez ImageJ et cliquez sur Plugin | Macros | Courir... pour exécuter le fichier imagej_roi_converter.py disponible sur le site Github de Cellpose et attendre qu’une fenêtre apparaisse.</li>
	<li>Sélectionnez le premier fichier dans le dossier de l’organoïde deux-points et cliquez sur Ouvrir.</li>
	<li>Sélectionnez le fichier seg.npy correspondant au premier fichier et cliquez sur Ouvrir. REMARQUE : ImageJ convertira les masques en régions d’intérêt et les chevauchera avec les images de fluorescence correspondantes.</li>
	<li>Cliquez sur Sélectionner tout dans la fenêtre Gestionnaire de retour sur investissement , puis sur Mesurer.</li>
	<li>Cliquez sur Fichier | Enregistrer sous... dans la fenêtre Résultats et enregistrez les résultats. REMARQUE : Cela se traduira par un fichier .csv contenant toutes les propriétés de forme de chaque colonie dans le champ.</li>
	<li>Répétez les étapes 6.8 à 6.12 pour la même image dans le dossier de la lumière organoïde du côlon.</li>
	<li>Chargez OriginPro et appuyez sur ctrl + 3 pour ouvrir l’assistant d’importation. Cliquez sur le bouton des trois points et sélectionnez les deux fichiers .csv correspondant aux propriétés de forme de l’organoïde et de la lumière pour la même image.</li>
	<li>Copiez et collez les résultats des propriétés de la forme de la lumière dans une colonne à côté des résultats de la colonie pour vous assurer que chaque mesure de lumière est associée à sa colonie respective.</li>
	<li>Dans une nouvelle colonne, divisez les aires de la lumière et de la colonie pour obtenir la surface lumineuse relative de la colonie qui la contient.</li>
	<li>Sélectionnez la colonne correspondant à la circularité de chaque colonie et à la zone lumineuse. Cliquez sur Plot | 2D de base | Dispersez-vous.</li>
	<li>Faites un clic droit sur la fenêtre du tracé et sélectionnez Détails du tracé. Cliquez sur l’onglet Centroïde (PRO) et cochez les options Afficher le point centroïde pour le sous-ensemble, Se connecter aux points de données et Afficher l’ellipse.</li>
</ol>

Évaluation de l’adhésion et de la morphologie des peptides biofonctionnels auto-assemblés

<ol><li>Susapto, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+peptide+bioinks+support+automated+printing+of+large-scale+constructs+assuring+long-term+survival+of+printed+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ultrashort peptide bioinks support automated printing of large-scale constructs assuring long-term survival of printed tissue constructs.</a> Nano Letters. 21 (7), 2719-2729 (2021).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemically+well-defined%2C+self-assembling+3D+substrate+for+long-term+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Bio+Materials%22%5BJournal%5D)">A chemically well-defined, self-assembling 3D substrate for long-term culture of human pluripotent stem cells.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (4), 1406-1412 (2019).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+proteins+and+peptides+as+scaffolds+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Self-assembled proteins and peptides as scaffolds for tissue regeneration.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (16), 2557-2586 (2015).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+bioink%3A+self-assembling+nanofibrous+scaffolds+for+three-dimensional+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Peptide bioink: self-assembling nanofibrous scaffolds for three-dimensional organotypic cultures.</a> Nano Letters. 15 (10), 6919-6925 (2015).</li>
<li>Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+using+3D+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936(2018).</li>
<li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+based+personalized+medicine%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+extracellular+matrix+hydrogels+as+alternatives+to+Matrigel+for+culturing+gastrointestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tissue extracellular matrix hydrogels as alternatives to Matrigel for culturing gastrointestinal organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 1692(2022).</li>
<li>Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+current+status+of+three-dimensional+organoids+as+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: current status of three-dimensional organoids as preclinical models.</a> Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Hauser, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+tri-+to+hexapeptides+self-assemble+in+water+to+amyloid+beta-type+fiber+aggregates+by+unexpected+alpha-helical+intermediate+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Natural tri- to hexapeptides self-assemble in water to amyloid beta-type fiber aggregates by unexpected alpha-helical intermediate structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1361-1366 (2011).</li>
<li>Lakshmanan, A., Zhang, S., Hauser, C. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+self-assembling+peptides+as+building+blocks+for+modern+nanodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Short self-assembling peptides as building blocks for modern nanodevices.</a> Trends in Biotechnology. 30 (3), 155-165 (2012).</li>
<li>Rauf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+tetrameric+peptides+allow+in+situ+3D+bioprinting+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Self-assembling tetrameric peptides allow in situ 3D bioprinting under physiological conditions.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (4), 1069-1081 (2021).</li>
<li>Bilalis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipeptide-based+photoreactive+instant+glue+for+environmental+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dipeptide-based photoreactive instant glue for environmental and biomedical applications.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (40), 46710-46720 (2023).</li>
<li>Abdelrahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+cues+on+the+metabolomic+and+transcriptomic+profiles+of+human+dermal+fibroblasts+cultured+in+ultrashort+self-assembling+peptide+3D+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds.</a> ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).</li>
<li>Moretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectively+positioned+catechol+moiety+supports+ultrashort+self-assembling+peptide+hydrogel+adhesion+for+coral+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Selectively positioned catechol moiety supports ultrashort self-assembling peptide hydrogel adhesion for coral restoration.</a> Langmuir. 39 (49), 17903-17920 (2023).</li>
<li>Alhattab, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+three-dimensional+bone+marrow+niche-like+acute+myeloid+Leukemia+disease+model+by+an+automated+and+controlled+process+using+a+robotic+multicellular+bioprinting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Research%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a three-dimensional bone marrow niche-like acute myeloid Leukemia disease model by an automated and controlled process using a robotic multicellular bioprinting system.</a> Biomaterials Research. 27 (1), 111(2023).</li>
<li>Abdelrahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+cues+on+the+metabolomic+and+transcriptomic+profiles+of+human+dermal+fibroblasts+cultured+in+ultrashort+self-assembling+peptide+3D+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds.</a> ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).</li>
<li>Habibi, N., Kamaly, N., Memić, A., Shafiee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+peptide-based+nanostructures%3A+smart+nanomaterials+toward+targeted+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Self-assembled peptide-based nanostructures: smart nanomaterials toward targeted drug delivery.</a> Nano Today. 11 (1), 41-60 (2016).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+osteogenesis+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+by+a+functionalized+silk+fibroin+hydrogel+for+bone+defect+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Enhanced osteogenesis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells by a functionalized silk fibroin hydrogel for bone defect repair.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (3), 1801043(2018).</li>
<li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division%3A+implications+for+cartilage+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (15), 9996-10001 (2002).</li>
<li>Hogrebe, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+control+of+matrix+adhesiveness+and+stiffness+within+a+3D+self-assembling+peptide+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Independent control of matrix adhesiveness and stiffness within a 3D self-assembling peptide hydrogel.</a> Acta Biomaterialia. 70, 110-119 (2018).</li>
<li>Wu, F. J., Lin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+self-assembly%2C+and+cell+responses+of+aromatic+IKVAV+peptide+amphiphiles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis, self-assembly, and cell responses of aromatic IKVAV peptide amphiphiles.</a> Molecules. 27 (13), 4115(2022).</li>
<li>Cringoli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioadhesive+supramolecular+hydrogel+from+unprotected%2C+short+d%2Cl-peptides+with+Phe-Phe+and+Leu-Asp-Val+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Bioadhesive supramolecular hydrogel from unprotected, short d,l-peptides with Phe-Phe and Leu-Asp-Val motifs.</a> Chemical Communications. 56 (20), 3015-3018 (2020).</li>
<li>Pulat, G. O., Gökmen, O., Çevik, Z. B. Y., Karaman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+functionalized+self-assembled+peptide+hydrogels+in+in+vitro+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Role of functionalized self-assembled peptide hydrogels in in vitro vasculogenesis.</a> Soft Matter. 17 (27), 6616-6626 (2021).</li>
<li>Pérez-Pedroza, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+lumen-forming+colorectal+cancer+organoids+using+a+newly+designed+laminin-derived+bioink%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Fabrication of lumen-forming colorectal cancer organoids using a newly designed laminin-derived bioink.</a> International Journal of Bioprinting. 9 (1), 633(2022).</li>
<li>Ashley, N., Yeung, T. M., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+differentiation+and+lumen+formation+in+colorectal+cancer+cell+lines+and+primary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell differentiation and lumen formation in colorectal cancer cell lines and primary tumors.</a> Cancer Research. 73 (18), 5798-5809 (2013).</li>
<li>Yeung, T. M., Gandhi, S. C., Wilding, J. L., Muschel, R., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+colorectal+cancer-derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from colorectal cancer-derived cell lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3722-3727 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Pachitariu, M., Stringer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose+2.0%3A+how+to+train+your+own+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose 2.0: how to train your own model.</a> Nature Methods. 19 (12), 1634-1641 (2022).</li>
<li>Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose%3A+a+generalist+algorithm+for+cellular+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation.</a> Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).</li>
<li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li>
<li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+adhesion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate adhesion assays.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).</li>
<li>Munevar, S., Wang, Y. -l, Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+frontal+and+rear+cell-substrate+adhesions+in+fibroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of frontal and rear cell-substrate adhesions in fibroblast migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (12), 3947-3954 (2001).</li>
<li>Djomehri, S., Burman, B., González, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+scaffold-free+3D+organoid+model+to+study+neoplastic+progression+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2018).</li>
<li>Puschhof, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoid+cocultures+with+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoid cocultures with microbes.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).</li>
<li>Matthews, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OrganoID%3A+A+versatile+deep+learning+platform+for+tracking+and+analysis+of+single-organoid+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">OrganoID: A versatile deep learning platform for tracking and analysis of single-organoid dynamics.</a> PLOS Computational Biology. 18 (11), 1010584(2022).</li>
<li>Herpers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+patient-derived+organoid+screenings+identify+MCLA-158+as+a+therapeutic+EGFR+%C3%97+LGR5+bispecific+antibody+with+efficacy+in+epithelial+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR × LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors.</a> Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).</li>
<li>Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+brightfield+morphometry+of+3D+organoid+populations+by+OrganoSeg%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5319(2018).</li>
<li>Bergdorf, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+of+cancer+spheroids+and+fine-needle+aspiration-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100578-100578 (2021).</li>
<li>Yang, Z., Xu, H., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+peptide+hydrogels+to+engineer+3D+cell+microenvironments+for+cell+constructs+formation+and+precise+oncology+remodeling+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling peptide hydrogels to engineer 3D cell microenvironments for cell constructs formation and precise oncology remodeling in ovarian cancer.</a> Advanced Science. 7 (9), 1903718(2020).</li>
<li>Yadav, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+peptide-based+hydrogel+for+the+healing+of+critical+bone+defects+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Ultrashort peptide-based hydrogel for the healing of critical bone defects in rabbits.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (48), 54111-54126 (2022).</li>
<li>Alshehri, S., Susapto, H. H., Hauser, C. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolds+from+self-assembling+tetrapeptides+support+3D+spreading%2C+osteogenic+differentiation%2C+and+angiogenesis+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Scaffolds from self-assembling tetrapeptides support 3D spreading, osteogenic differentiation, and angiogenesis of mesenchymal stem cells.</a> Biomacromolecules. 22 (5), 2094-2106 (2021).</li>
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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Le vaste potentiel des PAS dans la recherche biomédicale est souligné par leur malléabilité et leur adaptabilité par biofonctionnalisation. Avec un tel éventail de permutations, le défi se pose de tester et de déterminer efficacement les configurations les plus prometteuses pour des applications spécifiques, en particulier dans la recherche sur les organoïdes. Une solution rapide et rentable est primordiale. La lignée cellulaire SW1222, dérivée de l’adénocarcinome colorectal humain, apparaît comme un candidat pivot pour une évaluation aussi intensive. Ici, nous avons présenté une méthode d’évaluation et de caractérisation d’organoïdes cultivés dans une matrice à base de peptides. Ce protocole promet une stratégie intégrative et rentable qui se concentre sur la surveillance et l’analyse des organoïdes à l’aide d’évaluations de la viabilité et de la prolifération, de tests d’adhésion, d’analyse de forme et d’immunocytochimie. La sélection de différentes concentrations de peptides dans nos expériences de culture cellulaire est étayée par une logique soigneusement étudiée qui s’aligne sur des objectifs expérimentaux spécifiques et contribue de manière significative à faire progresser notre compréhension de la culture d’organoïdes dans le contexte des matrices peptidiques. Notre parcours de recherche a évolué au fil du temps, ce qui a nécessité une approche diversifiée pour explorer différentes formulations. Premièrement, l’utilisation d’une gamme de concentrations peptidiques, allant de 1,5 mg/mL à 4,5 mg/mL, a été motivée par le désir d’étudier un éventail de résultats potentiels. En utilisant des concentrations plus faibles, nous avons cherché à évaluer la concentration minimale de peptides nécessaire pour soutenir efficacement la croissance et le développement des organoïdes. Ces informations sont essentielles pour comprendre la faisabilité d’applications rentables et nécessitant peu de ressources. À l’inverse, des concentrations plus élevées ont été choisies pour examiner les limites supérieures de la concentration peptidique et son impact potentiel sur le comportement des organoïdes, en abordant les questions concernant les effets de saturation et les inconvénients potentiels des concentrations excessives de peptides.
Deuxièmement, des objectifs expérimentaux spécifiques ont guidé nos choix. Par exemple, lors de l’étude de l’adhésion cellulaire, les concentrations peptidiques ont été utilisées pour diminuer la fracture de l’hydrogel sous contrainte. À l’inverse, dans les études axées sur la viabilité à long terme et la maturation des tissus, des concentrations plus faibles ont été utilisées pour obtenir les valeurs rhéologiques les plus basses possibles tout en fournissant un gel. De plus, les valeurs de prolifération ont été choisies pour montrer les différents profils obtenus au fil du temps sur la culture d’organoïdes en utilisant des formulations similaires. L’importance de cette approche diversifiée réside dans sa capacité à produire un ensemble de données complet qui englobe un large éventail de conditions et de résultats. En examinant les effets de différentes concentrations de peptides sur la culture d’organoïdes, nous pouvons mieux comprendre l’interaction nuancée entre les propriétés de la matrice et le comportement des organoïdes.
L’évaluation initiale consiste à surveiller la progression des cellules SW1222 pendant une semaine dans une plaque de 24 puits à l’aide de l’imagerie en fond clair. L’analyse générale de la morphologie et de la densité cellulaire est une technique de routine pour les lignées d’organoïdes9 qui est appliquée à la lignée cellulaire. La nature non invasive de ce protocole permet une observation ininterrompue de la culture cellulaire, ce qui nous permet de capturer des données cruciales sur les changements morphologiques et la densité cellulaire pour chaque colonie particulière. Cette analyse initiale peut fournir des informations précieuses sur la pertinence de la matrice peptidique ultracourte auto-assemblée. Ces observations jettent les bases d’analyses plus approfondies, démontrant l’adéquation de la matrice peptidique en tant qu’échafaudage efficace pour soutenir le développement et la croissance des organoïdes du cancer colorectal. De plus, le suivi de la croissance et des changements dans chaque colonie peut faire des observations intéressantes. Par exemple, dans la figure 4, nous pouvons observer que les colonies qui poussent à Matrigel peuvent entrer en collision les unes avec les autres, mais il semble qu’une limite soit constamment maintenue. Cependant, les cellules cultivées dans les peptides réorganisent le peptide de telle sorte qu’au jour 7, les emplacements cellulaires ne sont plus exactement les mêmes qu’auparavant. C’est quelque chose à prendre en compte si ce protocole a été exporté vers un système automatisé qui étiqueterait et suivrait la croissance des organoïdes.
L’examen ultérieur consiste à évaluer la viabilité et la prolifération cellulaires à l’aide d’un test de viabilité basé sur la calcéine et l’homodimère d’éthidium. Le test de viabilité fournira des informations qualitatives sur la population de cellules vivantes par rapport aux cellules mortes. L’essai de prolifération fournira des informations quantitatives concernant l’état métabolique des cellules afin d’évaluer la division cellulaire31. Il s’agit de tests standard largement utilisés en culture cellulaire et qui fournissent un aperçu général de l’état prolifératif des cellules. Bien qu’il ait été largement démontré que les matrices SAP sont biocompatibles, on sait que les organoïdes présentent une viabilité réduite en raison de conditions de culture sous-optimales, y compris la matrice dans laquelle ils sont intégrés. De plus, les propriétés mécaniques des matrices peptidiques peuvent influencer la viabilité cellulaire. Si la matrice est trop rigide ou rigide, elle peut soumettre les cellules à des contraintes mécaniques, ce qui peut entraîner des dommages cellulaires. À l’inverse, si la matrice est trop molle ou instable, elle peut ne pas fournir un soutien suffisant pour l’adhésion cellulaire et la survie. De plus, les motifs bioactifs ou les groupes fonctionnels présents dans les peptides peuvent interagir avec des récepteurs cellulaires ou des voies de signalisation spécifiques, entraînant potentiellement la mort cellulaire. Par conséquent, il est crucial de surveiller en permanence la viabilité et la prolifération des cellules.
Dans des études antérieures25, le peptide 1 et le peptide 2 ont montré des niveaux de mort cellulaire similaires à ceux du Matrigel (Figure 5). Cependant, des fluctuations ont été observées dans les profils de prolifération des cellules du peptide parent à des concentrations variables. Notamment, le taux de prolifération du jour 4 au jour 7 est resté constant plutôt qu’il n’a augmenté, ce qui suggère que les cellules pourraient entrer dans une phase moins active. De plus, les changements dans la viabilité cellulaire observés entre le jour 4 et le jour 7 sont également restés relativement constants, ce qui laisse entrevoir un plateau potentiel de croissance et de reproduction.
Pour procéder à l’évaluation et à la caractérisation, nous avons utilisé un test d’adhésion adapté à la culture 3D, qui s’appuie sur le stress mécanique pour évaluer les effets de détachement cellulaire32. La méthode pour induire une contrainte mécanique doit être choisie en fonction des propriétés mécaniques de l’hydrogel. L’efficacité de la méthode est intrinsèquement liée au système modèle choisi, et les informations obtenues dépendent de la façon dont elle représente le contexte biologique. La variabilité de l’adhérence et des caractéristiques des organoïdes peut résulter de nombreuses interactions physiques et chimiques, qui peuvent être influencées par des facteurs tels que la composition de l’hydrogel et les propriétés adhésives des nanofibres. Ces facteurs ont le potentiel d’influer sur la généralisabilité de nos constatations33. Cependant, si le lecteur devait adapter ce protocole pour des hydrogels plus rigides ou très ductiles, envisager d’utiliser une méthode de contrainte plus robuste.
Nous avons utilisé cette technique pour évaluer l’adhérence globale fournie au PAS par le motif biofonctionnel (Figure 6). Nous avons observé deux phénomènes. Tout d’abord, les peptides présentaient des propriétés adhésives initiales variables. Plus précisément, le motif IKVAV et les hydrogels contenant une forte concentration du peptide biofonctionnalisé ont adhéré aux cellules sur plus de 40 % de leur surface. Deuxièmement, après l’application d’un stress induit, certains peptides ont subi une perte significative de cellules adhérentes. Notamment, la capacité de rétention était relativement élevée dans les peptides contenant de fortes concentrations de peptide non biofonctionnalisé. Ainsi, le ligand IKVAV et le SAP offrent différents types d’adhérence des cellules à la matrice. Cette méthode permet de trouver des motifs et d’élucider le mécanisme d’adhérence du matériau. D’autres techniques pourraient être utilisées, telles que la mesure de l’adhérence à l’aide de la microscopie à force atomique, qui peut être utilisée pour sonder les forces d’adhérence entre la pointe d’une sonde et la surface d’un échantillon au niveau nanométrique, fournissant ainsi des informations précieuses sur les propriétés d’adhérence des matériaux et des échantillons biologiques.
La capacité de divers matériaux peptidiques à induire la formation d’organoïdes a été évaluée au moyen de la circularité des colonies et de la surface lumineuse relative des organoïdes cultivés dans de tels hydrogels peptidiques. La circularité fait référence à la rondeur ou à la forme d’un objet. Dans le contexte des organoïdes, la circularité peut être utilisée pour évaluer la morphologie et la symétrie de la structure. Plusieurs études ont évoqué les morphologies circulaires des organoïdes. Par exemple, les organoïdes du cancer du sein ont tendance à avoir des morphologies circulaires strictes avec des périphéries basolatérales en forme de cordon34. Cela suggère que la circularité peut être utilisée comme paramètre pour évaluer la forme des organoïdes. La taille de la lumière fait référence à la cavité centrale ou à l’espace à l’intérieur d’un organoïde. C’est une caractéristique essentielle car elle reflète la différenciation et la maturation de l’organoïde. Au cours du processus de différenciation, les organoïdes subissent une diminution de la taille de la lumière et une augmentation de l’épaisseur de la couche épithéliale35. Cela indique que la taille de la lumière peut être utilisée comme indicateur du stade de développement de l’organoïde. L’évaluation de la circularité et de la taille de la lumière peut fournir des informations précieuses sur les caractéristiques structurelles et fonctionnelles des organoïdes. Les organoïdes circulaires avec des lumières bien définies sont plus représentatifs de l’architecture tissulaire native et peuvent mieux imiter la fonction des organes36.
Ces propriétés peuvent être évaluées en obtenant des images de fluorescence du cytosquelette et des noyaux à partir des échantillons précédemment colorés. Les images ont été segmentées à l’aide de Cellpose, et les mesures de forme des masques résultants ont été obtenues à l’aide d’ImageJ. L’analyse de la forme d’échantillons colorés au cytosquelette après 4 jours de culture a révélé des caractéristiques organoïdes. Des méthodes similaires, principalement axées sur l’imagerie en fond clair, ont été employées pour déterminer les réponses des organoïdes à leur environnement sur la base de l’analyse de forme et de la détermination des caractéristiques de l’organoïde par analyse d’image 36,37,38. Enfin, nous avons utilisé l’immunocytochimie pour évaluer la polarité cellulaire avec divers marqueurs de polarité. Notamment, l’utilisation d’un hydrogel peptidique réduira la manipulation de l’échantillon, car cela ne nécessite pas le retrait de la matrice et la récupération des organoïdes39.
L’importance de cette méthode repose sur la polyvalence des hydrogels SAP biofonctionnels par rapport à d’autres matrices d’origine animale pour développer des méthodes qui permettent la traduction d’hydrogels peptidiques en matrices pour la culture d’organoïdes. La comparaison de la matrice peptidique ultracourte auto-assemblée avec des matrices traditionnelles telles que le Matrigel ou le collagène révèle de nombreux avantages. Tout d’abord, la matrice peptidique offre une reproductibilité supérieure car la séquence peptidique peut être contrôlée et synthétisée avec précision, garantissant des propriétés et des performances constantes entre différents lots40. De plus, il présente une grande stabilité en termes de propriétés mécaniques et de résistance à la dégradation, maintenant l’intégrité structurelle sur de longues périodes et fournissant un microenvironnement stable pour la croissance des organoïdes41. De plus, la matrice peptidique ultra-courte permet un contrôle précis et un réglage précis du microenvironnement. La séquence peptidique peut être modifiée pour incorporer des motifs bioactifs spécifiques ou des groupes fonctionnels, présentant les indices souhaités pour la différenciation cellulaire42.
En résumé, l’importance de la méthode réside dans son potentiel à éclairer la conception rationnelle d’hydrogels à base de peptides pour favoriser la culture d’organoïdes. En évaluant systématiquement les comportements cellulaires, ce protocole facilite l’identification de compositions peptidiques prometteuses pour optimiser la croissance des organoïdes. Ces connaissances sont sur le point de s’étendre à des domaines de recherche plus larges, contribuant ainsi à l’avancement des études basées sur les organoïdes et des approches de médecine régénérative.

Ces dernières années, les peptides auto-assemblés (SAP) sont apparus comme des biomatériaux prometteurs pour des applications d’ingénierie tissulaire. Les SAP possèdent des propriétés uniques, notamment la formation spontanée de nanofibres, la biocompatibilité, la biodégradabilité et la non-immunogénicité, ce qui en fait des candidats attrayants pour le développement d’échafaudages1. Les SAP ont déjà été utilisés avec divers types de cellules, et notamment, les SAP ultracourts ont facilité l’encapsulation des cellules souches tout en maintenant leur pluripotence sur des périodes prolongées englobant plus de 30 passages et avec une incidence minimale d’aberrations chromosomiques 2,3,4. Par conséquent, l’adaptation des PAS à leur utilisation en culture d’organoïdes a constitué une étape ultérieure rationnelle.
Les organoïdes sont des structures tridimensionnelles complexes qui résultent de cellules pluripotentes uniques. Ces structures donnent naissance à divers types de cellules, qui s’auto-organisent ensuite pour reproduire les processus de développement de la croissance embryonnaire et tissulaire in vitro5. Ce cadre innovant est devenu un formidable outil pour les investigations in vitro, conservant efficacement les attributs génétiques, phénotypiques et comportementaux caractéristiques des organes in vivo 6. Néanmoins, l’un des principaux obstacles à la transition du laboratoire au chevet des patients des résultats basés sur les organoïdes est la nécessité de reproductibilité7. Cette variation des résultats est principalement attribuée à la difficulté de différencier complètement les cellules souches pluripotentes humaines en lignées cellulaires spécialisées, aggravée par l’absence d’architecture tissulaire authentique et la complexité inhérente rencontrée dans les modèles organoïdes. Compte tenu de la popularité croissante des études basées sur des cellules souches et des organoïdes8, il y a eu une demande accrue de biomatériaux dotés de propriétés mécaniques dynamiques et de sites d’adhésion ou d’échafaudages similaires à ceux de l’intégrine à dégradabilité contrôlée 7,9. Ces attributs peuvent être ajustés efficacement grâce à l’utilisation stratégique de PAS biofonctionnalisés.
Les SAP sont de courtes séquences d’acides aminés ayant la capacité inhérente de s’organiser spontanément en structures bien définies10. Ces peptides contiennent souvent une alternance de résidus hydrophobes et hydrophiles, qui entraînent leur auto-assemblage par des interactions non covalentes, notamment les liaisons hydrogène, les interactions électrostatiques et les effets hydrophobes11,12. Le processus d’auto-assemblage de ces peptides est principalement motivé par la nécessité de minimiser l’énergie libre du système. Lorsqu’ils sont dans un environnement aqueux, les résidus hydrophobes ont tendance à se regrouper pour minimiser leur exposition à l’eau, tandis que les résidus hydrophiles interagissent avec les molécules d’eau environnantes. Ce phénomène conduit à la formation de diverses nanostructures. Dans ce cas, les peptides ultracourts auto-assemblés forment des nanofibres dont les caractéristiques dépendent de la séquence peptidique et des conditions environnementales 2,12,13,14,15,16. Ces peptides adoptent une conformation en β-tour, où les brins peptidiques individuels s’alignent parallèlement ou antiparallèlement les uns aux autres, stabilisés par des liaisons hydrogène (Figure 1). La présence d’ions positifs accélère les processus d’auto-assemblage qui conduisent à la formation de nanofibres.
Les nanofibres peptidiques ont été identifiées comme possédant une capacité innée à piéger des volumes importants d’eau. Cette caractéristique facilite la génération d’un hydrogel, qui se manifeste par la suite par un espace tridimensionnel biocompatible et biodégradable propice à la prolifération et à la croissance cellulaires. Ces nanofibres peptidiques auto-assemblées émulent de manière complexe les caractéristiques topographiques inhérentes à l’environnement de la matrice extracellulaire naturelle (MEC)1. Cette ressemblance dote les cellules d’un environnement qui imite leur habitat physiologique, favorisant ainsi des activités cellulaires optimales17. De plus, la polyvalence inhérente à ces peptides permet un degré considérable de réglage4. Une telle adaptabilité permet de modifier les propriétés de la matrice, telles que la rigidité, la cinétique de gélification et la porosité. Ces adaptations sont réalisées par des modifications de la séquence peptidique. Par conséquent, les peptides auto-assemblés (SAP) sont devenus des composants essentiels de la science contemporaine des biomatériaux, largement utilisés comme échafaudages pour la régénération des tissus et la culture cellulaire13,17.
L’un des avantages essentiels des peptides auto-assemblés est leur capacité à être facilement synthétisés et modifiés au niveau moléculaire. Cet avantage permet d’incorporer des groupes fonctionnels spécifiques ou des motifs bioactifs dans la séquence peptidique, ce qui permet de concevoir des peptides avec des propriétés et des fonctionnalités adaptées 18,19,20 (Figure 1B). Par exemple, les SAP biofonctionnalisés peuvent être conçus pour imiter l’ECM et favoriser la différenciation à l’aide du peptide RGD19,21. Il a également été rapporté que le peptide Ben-IKVAV augmente considérablement l’expression des marqueurs neuronaux spécifiques en raison de sa motiété spécifique au ligand22. Ces peptides peuvent également être modifiés pour afficher des molécules bioactives, telles que des peptides liant l’intégrine, afin d’améliorer la survie cellulaire23. Enfin, d’autres SAP biofonctionnalisés ont été développés pour favoriser l’angiogenèse en incluant les motifs IKVAV et YIGSR dans leurs structures24.
Les SAP biofonctionnalisés rapportés dans une publication antérieure montrent que l’auto-assemblage peut être davantage modifié en incluant le peptide naïf à partir duquel le SAP biofonctionnalisé a été dérivé25. Ces mélanges de SAP peuvent également fournir un large éventail de formulations de SAP dont l’activité biochimique et les propriétés physicochimiques varient. Par exemple, le peptide amphiphile IIFK est un SAP ultracourt qui peut résister à la biofonctionnalisation avec divers motifs, comme en témoigne l’incorporation du motif IKVAV (Figure 1B). Les deux peptides peuvent former des nanofibres, à la fois seules et combinées. Chaque formulation donne des hydrogels aux propriétés physiques variables (Figure 2)
Cependant, en raison de la vaste gamme de permutations et d’alternatives potentielles obtenues à partir de la biofonctionnalisation des PAS, il est nécessaire de fournir une option rapide et rentable pour les tests d’organoïdes. La lignée cellulaire SW1222, dérivée de l’adénocarcinome colorectal humain, est un candidat pour une évaluation aussi intensive et rentable des organoïdes26,27. Les cellules SW1222 possèdent des caractéristiques qui permettent leur agrégation en structures 3D ressemblant à des organoïdes, ce qui en fait un modèle idéal pour l’étude du développement tissulaire et des applications de la médecine régénérative. Les cellules SW1222 ont été identifiées comme capables de générer des organoïdes en raison de leur surexpression intrinsèque du gène LGR5 27. La création d’organoïdes à partir de cellules souches LGR5+ individuelles a déjà été démontrée de manière convaincante, ainsi que la propension des cellules SW1222 à obtenir les caractéristiques morphologiques d’un organoïde de cancer colorectal28.
Dans cet article méthodologique, nous présentons des protocoles détaillés pour évaluer et caractériser les effets de divers peptides biofonctionnels sur l’adhésion cellulaire et la formation de lumière à l’aide de cellules SW1222 (Figure 3). En fournissant des procédures étape par étape et des méthodes d’analyse d’imagerie, nous espérons offrir des informations précieuses sur la biofabrication des organoïdes et l’évaluation de matrices SAP simplistes pour la culture d’organoïdes.

<table><tbody><tr><td>1x plaque PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>6 puits, traitée pour culture tissulaire</td><td>Corning</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, sans calcium, sans magnésium</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>16 % de formaldéhyde (w/v), sans méthanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>24 puits, traitée pour culture tissulaire</td><td>Corning</td><td>09-761-146</td><td></td></tr><tr><td>Plaque noire à 96 puits, traitée par culture tissulaire</td><td>Corning</td><td>07-200-565</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue Cell Viability Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Ezrin, monoclonal de lapin</td><td>Abcam</td><td>ab40839</td><td>Utilisation secondaire : anti-lapin Dylight 633</td></tr><tr><td>Anticorps anti-pan cadhérine, polyclonal de lapin</td><td>Abcam</td><td>ab16505</td><td>Utilisation secondaire : anti-lapin Alexa 488</td></tr><tr><td>Anticorps anti-ZO1 à jonction serrée, chèvre polyclonale</td><td>Abcam</td><td>ab190085</td><td>Utilisation secondaire : anti-chèvre Alexa 488</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cellpose 2.0</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Obtenu à partir d’https://github.com/MouseLand/cellpose</td></tr><tr><td>microscope confocal à balayage laser avec Airyscan</td><td>ZEISS</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) d’âne, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Cytiva</td><td>GE17-1323-01</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-IgG de lapin (H+L), DyLight 633</td><td>Invitrogen</td><td>35562</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (HI FBS)</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 1.54f</td><td>NIH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Kit</td> de <td></td> viabilité/cytotoxicité Gibco 12440079 <td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD, pour cellules de mammifères</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium, hexahydraté (MgCl2 6 H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel pour la culture organoïde, sans rouge de phénol</td><td></td><td>356255</td><td>Désigné dans le manuscrit sous le nom de Matrigel ou matrice de membrane basale.</td></tr><tr><td>Microscope, Microscope à fond</td><td></td><td></td><td></td>clair</tr><tr><td>, EVOS</td><td>Thermo Scientific</td><td>EVOS M7000</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2023 (64 bits) 10.0.0.154</td><td>OriginLab Corp</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)</td>Fabriqué <td>en laboratoire</td><td>NA</td><td>Peut être fabriqué sur mesure par peptide fabricants tels que Bachem.</td></tr><tr><td>Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)</td>NA <td>fabriqué</td><td></td><td>en laboratoire Peut être fabriqué sur mesure par des fabricants de peptides tels que Bachem.</td></tr><tr><td>Peptide P2 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Ile, Lys, Val, Ala, Val, NH2)</td> Fabriqué <td>en laboratoire</td><td></td><td>NA Peut être fabriqué sur mesure par des fabricants de peptides tels que Bachem.</td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Round Cover Slip, diamètre 10 mm</td><td>VWR</td><td>631-0170</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage</td><td>Thermo Fisher - FEI</td><td>TENEO VS</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 30 &mu ; m passoire</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>SW1222 lignée cellulaire</td><td>ECACC</td><td>12022910</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0.25 %</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Eau UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication et caractérisation d’organoïdes de cancer colorectal à partir de la lignée cellulaire sw1222 dans une matrice peptidique auto-assemblée ultracourte

Fabrication and Characterization of Colorectal Cancer Organoids from SW1222 Cell Line in Ultrashort Self&#45;Assembling Peptide Matrix

Les peptides ultracourts à s’assembler automatiquement (SAP) peuvent former spontanément des nanofibres qui ressemblent à la matrice extracellulaire. Ces fibres permettent la formation d’hydrogels biocompatibles, biodégradables et non immunogènes. Nous avons précédemment prouvé que les SAP, lorsqu’ils sont biofonctionnalisés avec des motifs dérivés de protéines, peuvent imiter les caractéristiques de la matrice extracellulaire qui soutiennent la formation d’organoïdes colorectaux. Ces hydrogels peptidiques biofonctionnels conservent les propriétés mécaniques, l’accordabilité et l’imprimabilité du peptide parent d’origine tout en incorporant des indices qui permettent aux interactions cellule-matrice d’augmenter l’adhésion cellulaire. Cet article présente les protocoles nécessaires pour évaluer et caractériser les effets de divers hydrogels peptidiques biofonctionnels sur l’adhésion cellulaire et la formation de lumière à l’aide d’une lignée cellulaire cancéreuse d’adénocarcinome capable de former des organoïdes de cancer colorectal de manière rentable. Ces protocoles permettront d’évaluer les effets de l’hydrogel peptidique biofonctionnel sur l’adhésion cellulaire et la formation luminale à l’aide de l’immunomarquage et de l’analyse d’images de fluorescence. La lignée cellulaire utilisée dans cette étude a déjà été utilisée pour générer des organoïdes dans des matrices dérivées d’animaux.

Tout d’abord, nous avons évalué les cellules cultivées dans une plaque à 24 puits pendant 7 jours à l’aide de l’imagerie en fond clair. Nous avons identifié de petits groupes de cellules s’assemblant en organoïdes au cours de la semaine, comme le montre la figure 4. Une méthode de balayage contrôlé permet de suivre la mobilité des cellules et des organoïdes entre différents jours. En général, nous avons regardé l’évolution de la morphologie des cellules pendant toute la semaine. Les organoïdes dérivés de SW1222 doivent avoir une morphologie ronde et un aspect léger. Une apparence plus foncée indique une densité cellulaire plus élevée indésirable, comme on le voit dans certaines des colonies cultivées dans le peptide P, jour 7 (figure 4).
La figure 5 montre les résultats des tests de viabilité cellulaire (figure 5A) et de prolifération (figure 5B), qui indiquent respectivement la quantité de cellules mortes et vivantes et l’activité métabolique. Ici, nous avons utilisé un test de viabilité basé sur l’homodimère de calcéine et d’éthidium et avons remarqué que ces cellules présentaient une petite population de cellules mortes au jour 7 lorsqu’elles étaient cultivées dans Matrigel. Ce phénomène était également présent dans tous les hydrogels à base de peptides, mais pas dans la culture 2D. Les résultats de la prolifération ont montré une augmentation totale de l’activité métabolique entre le jour 1 et le jour 7. De plus, nous avons constaté de légères diminutions de l’activité entre le jour 4 et le jour 7 pour plusieurs conditions. Cette observation est corrélée à l’augmentation de la population de cellules mortes observée dans le test de viabilité (Figure 5A).
Pour une évaluation préliminaire de l’interaction entre les cellules et de la biofonctionnalisation des hydrogels peptidiques, nous avons effectué un test d’adhésion basé sur le stress mécanique pour induire le détachement cellulaire. Comme on peut l’observer sur la figure 6, l’utilisation de différentes concentrations du peptide biofonctionnel P2 a affecté de manière significative le nombre de cellules conservées avant et après le processus de détachement. Ici, nous avons utilisé un peptide qui ne contient que le motif biofonctionnel du peptide P2 comme contrôle positif. Nous avons également utilisé le peptide P non biofonctionnel comme témoin négatif. Comme on peut l’observer sur le graphique, les cellules ensemencées dans le peptide P avaient une adhérence initiale relativement faible ainsi qu’une faible valeur de rétention. De plus, la modification du rapport du peptide biofonctionnel P2 était corrélée à la quantité de cellules conservées après le stress. Par conséquent, en utilisant ce test, nous pouvons conclure que le peptide P2 a affecté l’adhésion cellulaire qui peut ou non être déterminée par le motif biofonctionnel, mais qui était corrélée à la quantité de peptide biofonctionnel présente dans le mélange.
Ensuite, nous avons étudié l’effet des matrices dans les organoïdes fabriqués. Nous avons évalué la circularité de la colonie et la taille relative de la lumière par rapport à la taille de la colonie en effectuant une analyse de forme d’échantillons colorés au cytosquelette cultivés pendant 4 jours. Les points de données avaient une distribution particulière le long des axes x et y, et chaque condition avait un centroïde avec une valeur particulière pour la circularité et la surface lumineuse relative. La figure 7 montre que les cellules cultivées en 2D présentaient une très forte variation de circularité des colonies. En revanche, les cellules cultivées dans Matrigel avaient une distribution plus étendue pour la taille relative de la lumière.
Il est intéressant de noter que les valeurs centroïdes de tous les hydrogels contenant des peptides avaient une position très similaire. Cependant, la distance entre les points de données a montré des profils de distribution différents. Par exemple, le peptide P3 avait une distribution plus petite parmi les trois hydrogels peptidiques, tandis que les points de données du peptide P non biofonctionnel semblaient avoir une distribution plus grande. Ces données suggèrent que les hydrogels avec P1 et P3 ont le potentiel d’être optimisés pour la culture d’organoïdes.
Enfin, nous avons évalué l’expression de marqueurs spécifiques par immunocytochimie sur un échantillon coloré pour les marqueurs apicaux ZO-1 et ezrin. Ces marqueurs ont permis d’évaluer la polarisation des cellules au sein de chaque organoïde. Nous avons également évalué des marqueurs pan-cadhérine pour visualiser les jonctions cellule-cellule et un marqueur spécifique du cytosquelette (phalloïdine) pour visualiser la lumière. La figure 8A montre les organoïdes trouvés dans le peptide P non biofonctionnel, le peptide biofonctionnalisé P1 et le Matrigel au jour 4 et au jour 7. Les marqueurs ZO-1 et ezrin doivent être localisés dans les membranes apicales et basolatérales de l’organoïde ; Une polarisation cellulaire correcte nous permettra d’observer l’expression des deux molécules au jour 4 près de la zone lumineuse, autrement invisible. En effet, comme le montre la figure 8, les marqueurs ZO-1 et ezrin étaient localisés dans les membranes apicales des organoïdes cultivés dans Matrigel. Il est intéressant de noter que les marqueurs d’ezrine étaient à peine visibles dans le peptide P non biofonctionnel. On en déduit que la polarisation inefficace des cellules a entraîné une faible expression de ces molécules dans le peptide P.
De plus, la dispersion des noyaux avait tendance à être irrégulière dans les hydrogels peptidiques, tandis que les organoïdes intégrés dans Matrigel formaient une seule couche asymétrique de noyaux. Cette description correspond à la morphologie idéale pour un organoïde colorectal ; cependant, bien que l’orientation des noyaux n’ait pas été complètement asymétrique dans les hydrogels peptidiques, des colonies plus denses avec des multicouches de noyaux ont été trouvées principalement dans le peptide P non biofonctionnel. En revanche, les jonctions cellule-cellule doivent être localisées perpendiculairement aux membranes apicale et basolatérale (Figure 8B). Ce marqueur nous a permis d’observer les bords de toutes les cellules situées au sein de la colonie. Lorsqu’elles ont été cultivées à Matrigel, les cellules avaient une distribution presque parfaitement radiale de pan-cadhérine (jonctions cellule-cellule) au 7e jour. En revanche, les colonies non polarisées, telles que celles du peptide P, présentaient un arrangement désordonné des cellules et l’expression de jonctions cellule-cellule près de la membrane basale et apicale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig01.jpg"> Figure 1 : Peptides ultracourts auto-assemblés formant des nanofibres. (A) Représentation du processus d’auto-assemblage des peptides aliphatiques ultracourts. (B) Structure chimique de SAP IIFK ultracourt biofonctionnalisé avec le ligand IKVAV. Cette figure a été modifiée à partir de Loo et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig02.jpg"> Figure 2 : Structure et propriétés des peptides. (A) Les structures chimiques du peptide parent IIFK et du peptide biofonctionnel P2 sont illustrées. (B) Les résultats du test du flacon inversé révèlent des différences critiques de concentration et de temps de gélification. P2 forme un gel translucide avec une CGC plus élevée que le peptide parent IIFK. Notamment, le mélange IIFK :P2 (1:1) présente une CGC encore plus élevée et un temps de gélification plus long que l’un ou l’autre peptide seul. (C) Les micrographies électroniques à balayage fournissent des informations visuelles sur les caractéristiques structurelles de l’IIFK, du P2 et du mélange IIFK :P2 (1:1). (D) Les images de topographie en hauteur de la microscopie à force atomique représentent les peptides gélifiés à une concentration de 8 mM, offrant une vue détaillée de leurs caractéristiques de surface. (E) La spectroscopie de dichroïsme circulaire révèle les changements de conformation du mélange IIFK :P2 à diverses concentrations, mettant en lumière leurs altérations de structure secondaire. (F) Les analyses rhéologiques mesurent la rigidité des peptides gélifiés à différentes concentrations, fournissant des informations précieuses sur leurs propriétés mécaniques. Cette figure est reproduite d’après Perez-Pedroza et al.25. Barres d’échelle = 1 μm (C), 200 nm (D). Abréviation : CGC = concentration critique de gélification. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig03.jpg"> Figure 3 : Schéma illustrant la préparation peptidique et l’ensemencement cellulaire pour la fabrication et la caractérisation des organoïdes par viabilité, adhésion, capacité de formation d’organoïdes et immunocoloration dans les hydrogels peptidiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig04.jpg"> Figure 4 : Images de microscopie en fond clair capturées à partir de cellules SW1222 cultivées dans des hydrogels peptidiques marqués P et P1 par rapport au contrôle Matrigel. Il est intéressant de noter que les organoïdes cultivés dans les hydrogels peptidiques manifestent une morphologie principalement sphérique au septième jour. En revanche, ceux situés à l’intérieur du Matrigel semblent présenter une densité cellulaire réduite, ce qui peut être indiqué par leur corps brillant, par rapport au corps sombre de la culture d’organoïdes dans SAP (pointes de flèches noires). Néanmoins, ils présentent un regroupement apparent entre les colonies adjacentes. De plus, il devient évident que la capacité migratoire des cellules dans l’environnement de Matrigel est comparativement diminuée. Barres d’échelle = 650 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig05.jpg"> Figure 5 : Essais de viabilité et de prolifération des cellules SW1222 dans des SAP biofonctionnalisés à diverses concentrations. (A) Évaluation de la viabilité des cellules cultivées dans les peptides biofonctionnels P1 et P2, par rapport au Matrigel et au 2D. (B) Évaluation de la prolifération de la culture cellulaire dans le peptide non biofonctionnel P1 et le peptide biofonctionnel P2, par rapport au Matrigel et aux témoins 2D. Ici, nous voyons un comportement similaire à celui des cellules qui se développent dans Matrigel pour le test vivant/mort. Une légère augmentation des cellules mortes (pointes de flèches jaunes) est observée dans plusieurs conditions, principalement Matrigel. Pour la prolifération, les tendances varient en fonction du type et de la concentration du peptide, mais en général, il y a une tendance positive. Barres d’échelle = 250 μm. Cette figure a été adaptée de Perez-Pedroza et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig06.jpg"> Figure 6 : Effets du peptide sur le nombre de cellules détachées. (A) Images de fluorescence de cellules colorées au DAPI avant et après stress mécanique. Ici, nous utilisons le peptide P, le peptide modifié P2 et le motif IKVAV. (B) La modification de l’adhérence cellulaire a été déterminée en mesurant la surface couverte dans ImageJ. L’analyse comparative a révélé que le peptide biofonctionnalisé P2 avait une capacité de rétention accrue par rapport au peptide P. Barres d’échelle = 100 μm. Cette figure a été adaptée de Perez-Pedroza, et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig07.jpg"> Figure 7 : Évaluation de la capacité de formation des organoïdes par calcul centroïde de l’aire relative de la lumière en fonction de la circularité. Le centroïde et la dispersion des données variaient d’un traitement à l’autre. Comme prévu, la condition la moins performante était celle des mesures 2D, qui s’étendaient à une large gamme de valeurs de circularité et avaient la plus faible surface relative du lumen. Matrigel avait non seulement la circularité la plus élevée, mais aussi la plus grande lumière. Les conditions peptidiques variaient légèrement dans les deux valeurs, mais la condition P3 présentait la variation la plus négligeable des données. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig08.jpg"> Figure 8 : Images de microscopie confocale d’organoïdes au jour 4 et au jour 7 pour divers marqueurs. (A) Les marqueurs ZO-1 (vert), ezrin (rouge) et DAPI (bleu) sont utilisés pour déterminer la distribution apicale des cellules au sein des organoïdes. Comme on le voit dans le contrôle Matrigel, ces molécules sont généralement localisées dans les membranes apicales et basolatérales. Le peptide P non biofonctionnel ne montre l’expression de ces molécules qu’au jour 7. (B) Les marqueurs de jonction cellule-cellule colorés avec des anticorps anti-pan-cadhérine (vert) doivent être perpendiculaires aux membranes basolatérale et apicale des organoïdes. Les noyaux cellulaires (bleu) et le cytosquelette (rouge) sont utilisés comme contre-coloration. Le peptide P non biofonctionnel a induit l’expression de la jonction cellule-cellule dans la membrane basolatérale, contrairement aux deux autres traitements (P3 et Matrigel). Barres d’échelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Ce protocole vise à évaluer les peptides biofonctionnels auto-assemblés pour l’adhésion cellulaire, la morphologie des organoïdes et l’expression génique par immunomarquage. Nous utiliserons une lignée cellulaire de cancer colorectal pour fournir un moyen rentable d’obtenir des organoïdes pour des tests intensifs.

Fabrication et caractérisation d’organoïdes de cancer colorectal à partir de la lignée cellulaire SW1222 dans une matrice peptidique auto-assemblée ultracourte

Ultrashort self-assembling peptides (SAPs) can spontaneously form nanofibers that resemble the extracellular matrix. These fibers allow the formation of ...

Notre recherche vise à évaluer les peptides ultracourts auto-assemblés en tant que matrices pour les cultures organoïdes du cancer colorectal. Nous abordons des questions sur la morphologie des organoïdes, sur la viabilité, la prolifération, l’adhésion et l’impact de la biofonctionnalisation. L’objectif est d’optimiser les compositions matricielles peptidiques pour une croissance efficace des organoïdes et de contribuer à la médecine régénérative.Les technologies de pointe dans notre domaine comprennent la bio-impression 3D pour une fabrication organique précise, des plateformes microfluidiques pour des environnements de culture dynamiques et des outils d’imagerie avancés comme la microscopie à force atomique et la microscopie multiphotonique. L’édition de gènes CRISPR-Cas9 affine la modification génétique, tandis que le séquençage de l’ARN unicellulaire fournit des informations moléculaires approfondies. Les défis expérimentaux actuels comprennent l’amélioration de la reproductibilité des organoïdes, l’affinement de la vascularisation pour des constructions plus grandes et l’imitation de l’architecture tissulaire complexe.Surmonter ces limites dans la culture à long terme et incorporer des composants immunitaires dans les modèles sont des domaines actifs. Établir des protocoles normalisés et répondre aux préoccupations éthiques qui s’opposent aux défis actuels dans ce domaine. Parmi les résultats significatifs dans notre domaine, citons la démonstration de l’adéquation des peptides auto-assemblés ultracourts pour les cultures d’organoïdes.Nous avons montré la polyvalence, la reproductibilité et la stabilité de ces peptides, fournissant une plate-forme pour affiner les micro-environnements. Cela contribue à faire progresser les études basées sur les organoïdes, la médecine régénérative et la recherche sur les hydrogels biofonctionnalisés. Notre protocole comble les lacunes de la recherche, fournissant ainsi une approche systématique de l’évaluation des organoïdes dans des matrices peptidiques auto-assemblées ultracourtes.Il répond au besoin de méthodes standardisées pour évaluer le comportement cellulaire au sein de ces matrices, aidant à la conception durable d’hydrogels à base de peptides pour une croissance optimale des organoïdes et faisant progresser les études de médecine régénérative.

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Apprenez à fabriquer des organoïdes de cancer colorectal à partir de la lignée SW1222 dans une matrice peptidique auto-assemblée ultracourte. Cette méthode optimise la morphologie et la viabilité pour la médecine régénérative.

Fabrication et caractérisation d’organoïdes de cancer colorectal à partir de la lignée cellulaire SW1222 dans une matrice peptidique auto-assemblée ultracourte (Vidéo) | JoVE Journal

Fabrication et caractérisation d’organoïdes de cancer colorectal à partir de la lignée cellulaire SW1222 dans une matrice peptidique auto-assemblée ultracourte

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