Analyse quantitative de la stabilisation de la membrane endoplasmique du réticulum (MAM) associée aux mitochondries dans un modèle neuronal de la maladie d’Alzheimer (MA)

Nous essayons de mesurer quantitativement la stabilité des membranes RE associées aux mitochondries de différentes épaisseurs ou largeurs d’espace, ce qui est important dans la régulation de la physiopathologie de plusieurs maladies neurodégénératives, y compris la MA. Des études récentes sur les membranes du RE associées aux mitochondries, souvent appelées MAM, les ont décrites comme l’un des facteurs clés dans l’initiation de la pathologie amyloïde au stade précoce de la MA. Les résultats ont conduit à l’élaboration d’une nouvelle hypothèse appelée hypothèse MAM, qui suggère que la MA est exclusivement une maladie liée à la MAM.

Notre protocole est le premier à fournir un outil quantitatif pour mesurer la stabilisation de la MAM dans les cellules vivantes, ce qui est resté difficile jusqu’à présent. Le plus grand avantage de notre protocole est qu’il utilise la propriété dynamique intrinsèque des mitochondries pour mesurer quantitativement les changements de stabilisation de la MAM lors du resserrement ou du relâchement de la largeur de l’espace MAM dans les cellules vivantes.

Dans l’avenir immédiat, notre objectif est d’améliorer et d’utiliser notre technologie de pointe d’imagerie cellulaire vivante et de kymographie pour cribler une série de modulateurs synthétiques ou naturels de petites molécules de MAM ou de récepteurs sigma one liés à MAM approuvés par la FDA, en utilisant une plateforme de criblage de médicaments contre la MA récemment développée, et de comprendre leur mécanisme d’action.

[Narrateur] Pour transfecter les cellules avec des stabilisants MAM, remplacez le mélange mononucléaire de moelle osseuse par deux millilitres de milieu DMEM-F12 à température ambiante dans chaque puits. Combiner le réactif nucléofector avec le supplément un dans un rapport de 4,5 pour un. Ajoutez 100 microlitres de réactif nucleofector au mélange. Puis vortex la solution d’ADN. Ajoutez un à cinq microgrammes d’ADN par traitement dans des microtubes à centrifuger séparés d’un millilitre pour chaque transfection. Après avoir aspiré le milieu existant des cellules, lavez une fois les cellules avec 10 millilitres de PBS. Aspirez le PBS et ajoutez un millilitre d’accutase directement dans les cellules. Incuber les cellules pendant cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius. Tapotez ensuite doucement le côté du plat pour déloger les cellules. Au microscope, vérifiez que les cellules sont desserrées et qu’elles s’écoulent librement. Neutralisez les acutants avec 10 millilitres de milieu DMEM-F12 et transférez la suspension cellulaire dans un tube propre de 15 millilitres. Ensuite, prenez 10 microlitres de cellules en suspension et ajoutez-les au côté A d’une chambre de comptage de cellules. Insérez ensuite le côté A de la chambre remplie dans la fente principale à l’avant du compteur de cellules. Appuyez sur mesurer et notez le nombre de cellules par millilitre. Centrifugez le nombre requis de cellules à 300 G pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant et remettez le granulé en suspension dans 100 microlitres de mélange de nucléofecteur pour chaque électroporation. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de suspension cellulaire en suspension dans l’un des tubes contenant de l’ADN. Mélanger en pipetant la solution plusieurs fois. Transférez ensuite le mélange de cellules d’ADN dans une cuvette d’électroporation et fermez-le avec le couvercle fourni. Sélectionnez le programme nucleofector approprié sur l’appareil. Ajoutez immédiatement environ 500 microlitres de DMEM à partir d’une plaque préremplie à six puits dans la cuvette à l’aide de pipettes stériles. Mélangez doucement une fois et transférez les cellules électroporées et le fluide dans le puits correspondant. Pour commencer, placez la plaque à six puits contenant les cellules dans la chambre du microscope et ajustez la mise au point du microscope jusqu’à ce que les cellules deviennent visibles. Pour capturer le signal de la protéine fluorescente rouge, excitez le fluorophore à l’aide d’un laser de 594 nanomètres et réglez l’émission sur 570 à 640 nanomètres. Pour les protéines fluorescentes vertes, utilisez un laser de 488 nanomètres pour l’excitation avec une émission de 510 à 540 nanomètres. Recadrez la zone de balayage pour l’adapter autour de l’axone. Une zone de balayage plus petite réduira le temps de traitement et simplifiera la génération de kymographie. Réglez l’intervalle sur une image par seconde et la durée totale sur 181 secondes. Cliquez sur Exécuter pour démarrer le processus. La vitesse axonale des mitochondries liées au RE marquées MAM 1X a été réduite de 50 % par rapport aux mitochondries libres et liées à MAM 9X. 26,6 % des mitochondries MAM 1X étaient mobiles contre 53,82 % des mitochondries libres et 44,79 % des mitochondries MAM 9X. Le mouvement rétrograde était plus faible pour les mitochondries MAM 1X que pour les mitochondries Mito-RFP et les mitochondries MAM 9X. Le mouvement antérograde des mitochondries MAM 1X a également été réduit par rapport à Mito-RFP. Le pourcentage stationnaire de mitochondries MAM 1X était significativement plus élevé que celui des mitochondries MAM 9X, reflétant une réduction de la motilité, tandis que la vitesse globale des mitochondries MAM 1X était significativement inférieure à celle des mitochondries MAM 9X.