Name: Imagerie calcique en direct de monocouches organoïdes intestinaux humains infectés par un virus à l’aide d’indicateurs de calcium codés génétiquement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Découvrez l'imagerie calcique en direct d'organoides intestinaux humains infectés par un virus à l'aide d'indicateurs de calcium codés génétiquement. Cette méthode permet d'étudier les perturbations du signal calcique dans l'épithélium intestinal.

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Ces travaux ont été financés par des subventions R01DK115507 et R01AI158683 (PI : J. M. Hyser) des National Institutes of Health (NIH). Le soutien aux stagiaires a été fourni par des subventions des NIH F30DK131828 (PI : J.T. Gebert), F31DK132942 (PI : F. J. Scribano) et F32DK130288 (PI : K.A. Engevik). Nous tenons à remercier le Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core pour avoir fourni le milieu d’entretien des organoïdes.

Imagerie calcique de monocouches d’organoïdes intestinaux humains infectés par un virus

<ol><li>Bootman, M. D., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+cellular+calcium+signaling%3A+A+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li>
<li>Danese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+as+a+result+of+calcium+signaling+modulation%3A+A+cancer-centric+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061(2021).</li>
<li>Harr, M. W., Distelhorst, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+autophagy%3A+Decoding+calcium+signals+that+mediate+life+or+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579(2010).</li>
<li>Barak, P., Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+Ca2%2B+microdomains+from+store-operated+CRAC+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097(2020).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP%2C+a+family+of+single-fluorophore+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Evol+Biochem+Phys%22%5BJournal%5D)">GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators.</a> J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).</li>
<li>Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+indicators+for+organellar+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging.</a> Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).</li>
<li>Nászai, M., Cordero, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cells%3A+Got+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cells: Got calcium.</a> Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).</li>
<li>Barrett, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+chloride+secretion+in+the+intestinal+epithelium%3A+Significance+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation.</a> Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensing+receptor+regulates+intestinal+dipeptide+absorption+via+Ca2%2B+signaling+and+IKCa+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation.</a> Physiol Rep. 8 (1), e14337(2020).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+CRISPR%E2%80%93Cas9-mediated+genetic+knockout+human+intestinal+tissue%E2%80%93derived+enteroid+lines+by+lentivirus+transduction+and+single-cell+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning.</a> Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).</li>
<li>Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+to+dissect+gastrointestinal+virus-host+interactions%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned.</a> Viruses. 13 (6), 999(2021).</li>
<li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FPbase%3A+a+community-editable+fluorescent+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).</li>
<li>Lai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calcium-triggered+secretion+by+hydrocarbon-stapled+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides.</a> Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+induces+intercellular+calcium+waves+through+ADP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling.</a> Science. 370 (6519), eabc3621(2020).</li>
<li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoctamin+1%2FTMEM16A+controls+intestinal+Cl%E2%88%92+secretion+induced+by+carbachol+and+cholera+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin.</a> Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).</li>
<li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+TMEM16A+control+luminal+chloride+secretion+in+a+NHERF1+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner.</a> Biochem Biophys Rep. 25, 100912(2021).</li>
<li>Mroz, M. S., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+chronically+upregulates+Ca2%2B-dependent+Cl%E2%88%92+conductance+and+TMEM16A+expression+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells.</a> J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).</li>
<li>Sui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+Ca2%2B-activated+Cl%E2%88%92+channel+transmembrane+member+16A+in+lipopolysaccharide-induced+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 404(2020).</li>
<li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).</li>
<li>Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+as+a+key+for+pathogens+invasion+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (5), 2506(2021).</li>
<li>Samak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2FAsk1%2FMKK7%2FJNK2%2Fc-Src+signalling+cascade+mediates+disruption+of+intestinal+epithelial+tight+junctions+by+dextran+sulfate+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium.</a> Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+by+Ca2%2B+regulates+intestinal+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity.</a> Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).</li>
<li>Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+host+cell+calcium+signaling+during+viral+infections%3A+Emerging+paradigm+with+high+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance.</a> Mol Aspects Med. 81, 101004(2021).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+calcium+dysregulation+manifests+as+dynamic+calcium+signaling+in+the+cytoplasm+and+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum.</a> Sci Rep. 9 (1), 10822(2019).</li>
<li>Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+disrupts+calcium+homeostasis+by+NSP4+viroporin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity.</a> mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).</li>
<li>Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rotavirus+NSP4+viroporin+domain+is+a+calcium-conducting+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel.</a> Sci Rep. 7, 43487(2017).</li>
<li>Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+hijacked+through+viroporin-activated+calcium%2Fcalmodulin-dependent+kinase+kinase-%CE%B2+signaling+is+required+for+rotavirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).</li>
<li>Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPII+vesicle+transport+is+required+for+Rotavirus+NSP4+interaction+with+the+autophagy+protein+LC3+II+and+trafficking+to+viroplasms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms.</a> J Virol. 94 (1), e01341(2019).</li>
<li>Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+calcium+on+the+early+steps+of+Rotavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection.</a> Virology. 295 (1), 190-200 (2002).</li>
<li>Hyser, J. M., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+consequences+of+calcium-conducting+viroporins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins.</a> Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).</li>
<li>Strtak, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovirus+NS1-2+has+viroporin+activity+that+induces+aberrant+cellular+calcium+signaling+to+facilitate+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication.</a> mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).</li>
<li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens%2C+commensals%2C+and+host+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> J Vis Exp. (146), 59357(2019).</li>
<li>Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+intestinal+organoid+technology+and+personalized+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling.</a> Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).</li>
<li>Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+rotavirus+entry+and+release+from+differentiated+small+intestinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells.</a> Virology. 499, 65-71 (2016).</li>
<li>Mirabelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Norovirus+efficiently+replicates+in+differentiated+3D-human+intestinal+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids.</a> J Virol. 96 (22), e0085522(2022).</li>
<li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy%2C+and+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> Bioessays. 39 (8), 28749075(2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+NEMO+as+calcium+indicators+with+large+dynamics+and+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity.</a> Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents à divulguer.

Les altérations des taux cytosoliques de Ca2+ peuvent être à la fois une cause et un effet de pathologies au sein de l’épithélium 10,16,17. L’augmentation du calcium cytosolique peut entraîner directement la sécrétion via l’activation du canal chlorure dépendant du calcium TMEM16A18,19. L’activation de TMEM16A en réponse au Ca2+ permet l’efflux apical du chlorure, établissant un gradient osmotique qui favorise la sécrétion de liquide20,21. De plus, l’augmentation du Ca2+ dans les cellules entéroendocrines déclenche la libération de sérotonine, qui stimule les neurones sensoriels afférents qui peuvent moduler l’activité du système nerveux entérique22. Les signaux Ca2+ peuvent également moduler les jonctions serrées pour influencer la fonction barrière23,24 et réguler la prolifération dans les cellules souches intestinales25. Ainsi, la dérégulation du Ca2+ peut avoir des effets étendus et de grande portée.
De nombreux virus manipulent le Ca2+ cytosolique pour créer un environnement cellulaire propice à la réplication26. Le rotavirus en est un excellent exemple dans l’épithélium intestinal27. La protéine non structurale 4 du rotavirus (NSP4) est un canal conducteur de Ca2+ qui permet l’écoulement de Ca2+ du réticulum endoplasmique dans le cytosol28,29. Cela stimule l’autophagie et facilite l’assemblage de la capside externe 30,31,32. L’infection à rotavirus induit également la libération d’ADP, déclenchant des ondes intercellulaires de Ca2+ qui contribuent à la pathogenèse17. D’autres virus entériques, y compris les calicivirus et les entérovirus, codent pour des viroporines conductrices de Ca2+ qui déclenchent une dérégulation similaire de Ca2+ dans les cellules infectées33,34.
L’imagerie Ca2+ d’organoïdes intestinaux humains sur cellules vivantes offre une plate-forme polyvalente pour étudier la signalisation induite par le virus dans l’épithélium. Cependant, la force des conclusions tirées des données d’imagerie dépend inextricablement de la santé et de la qualité des DOI, des paramètres d’imagerie appropriés et d’une approche analytique solide.
Une transduction lentivirale efficace est souvent l’étape limitante lors de l’établissement de nouvelles lignées GIO, mais un lentivirus à titre élevé et des transductions multiples aident à assurer une expression suffisante du transgène. Il est important de noter que cela devra être équilibré avec le potentiel de stress cellulaire important lors de la transduction. Celle-ci est le plus souvent temporaire et disparaît après la sélection et de multiples passages. Néanmoins, il est essentiel que les OIS conçus pour exprimer les GECI affichent une croissance et une prolifération normales avant de commencer les expériences. De même, la dispersion des HIO tridimensionnels et leur reformation sous forme de monocouches induisent un stress cellulaire. Il est préférable d’attendre trois jours ou plus pour que les monocouches s’adaptent après le placage. Le revêtement des plaques avec du collagène IV est essentiel pour l’intégrité de la monocouche35,36. L’aliquotage du collagène IV et son stockage à -80 °C entre les utilisations permettent d’assurer l’adhérence de la monocouche. La détermination de la densité de semis optimale pour chaque lignée de DOI peut également aider à améliorer la cohérence. Enfin, il est indispensable d’inclure les contrôles appropriés et de les comparer d’une expérience à l’autre pour s’assurer que toute observation représente une réponse à la variable en question, plutôt qu’un facteur de confusion technique.
Bien que le marquage d’une monocouche puisse causer des dommages cellulaires indésirables, il améliore considérablement l’infection RV des HIO 2D. La figure 2 illustre cela, car presque toutes les cellules infectées sont directement adjacentes à l’égratignure. Des preuves expérimentales suggèrent que la RV infecte le plus efficacement à la surface basolatérale des cellules épithéliales intestinales37. Ainsi, il est prédit que le marquage d’une monocouche améliore l’infectivité en exposant la surface basolatérale. Une infection monocouche efficace peut également être obtenue en plaquant des HIO sur des membranes en polycarbonate suspendues dans des puits contenant un milieu de culture, qui permettent d’accéder à la surface basolatérale. Cependant, la distance relativement longue entre la plaque et la membrane en polycarbonate, la membrane en polycarbonate elle-même et la surface en plastique à la base du puits les rendent inappropriées pour l’imagerie par épifluorescence. Ainsi, la méthode de scoring décrite dans ce protocole reste l’approche privilégiée. Étant donné que la notation elle-même peut conduire à des perturbations de signalisation, l’inclusion du témoin non infecté et noté est essentielle pour l’interprétation. Pour les virus, tels que les norovirus humains, qui infectent efficacement via la membrane apicale, il n’est pas nécessaire de marquer la monocouche38.
Comme pour tout système d’imagerie en direct, la phototoxicité peut facilement confondre les expériences utilisant des monocouches GIO. Tout au long d’une expérience d’imagerie, il est important de surveiller la vacuolisation inattendue, le saignement de la membrane ou d’autres indicateurs morphologiques de stress39. Si l’un de ces signes est détecté, la durée, la fréquence ou la puissance de l’excitation doivent être réduites. L’augmentation du rapport signal/bruit se fait souvent au détriment de la santé cellulaire à long terme, il est donc crucial d’optimiser empiriquement les paramètres. Le photoblanchiment, comme l’indique une diminution de l’intensité de fluorescence de base au fil du temps, est un signe avant-coureur du stress cellulaire et doit être évité.
La visualité des données d’imagerie peut amener les chercheurs à privilégier les analyses qualitatives plutôt que quantitatives. Cependant, comme pour toute modalité, les conclusions reproductibles nécessitent une quantification. L’analyse quantitative d’images contient beaucoup plus de complexité que ce qui peut être couvert dans un seul manuscrit, mais il vaut la peine de souligner quelques points clés. Tout d’abord, une quantification cohérente nécessite une acquisition cohérente. Un pipeline d’analyse développé pour un ensemble donné de paramètres d’acquisition peut ne pas être efficace pour les images acquises à des fréquences, des temps d’exposition, des puissances laser ou des longueurs d’onde différents. Deuxièmement, la multiplicité des infections a une influence démesurée sur la fréquence des signaux calciques induits par le virus. En tant que tel, il est important d’évaluer le nombre de cellules infectées par champ de vision et d’assurer la cohérence entre les conditions de traitement. Alternativement, la normalisation de la fréquence du signal au nombre de cellules infectées par champ de vision peut aider à réduire les erreurs. Enfin, alors que l’indicateur calcique à base de mNG (NEMO) récemment mis au point offre une approche prometteuse pour déterminer les concentrations absolues de Ca2+ dans les cellules40, la plupart des biocapteurs ne transmettent que des informations relatives sur les systèmes biologiques. Ainsi, la soustraction de l’arrière-plan, la normalisation et la comparaison avec un contrôle sont essentielles.
Bien que ce protocole se concentre sur l’imagerie calcique lors d’une infection virale, l’approche générale est facilement adaptable. L’infection virale peut facilement être remplacée par une autre condition de traitement, et il existe une litanie sans cesse croissante de biocapteurs pour surveiller de nombreuses voies et processus cellulaires différents. Lors de toute adaptation de protocole, les chercheurs doivent garder l’analyse à l’esprit, en concevant des expériences avec des résultats clairs et quantifiables.
Dans l’ensemble, l’imagerie en direct offre une résolution temporelle inégalée, améliorant ainsi la caractérisation de processus hautement dynamiques. L’incorporation d’organoïdes dans des expériences d’imagerie en direct permet d’observer ces processus dans un modèle physiologiquement pertinent et fidèle aux tissus. Nous espérons que le protocole décrit ici facilitera la conception et l’optimisation expérimentales, permettant aux chercheurs de découvrir de nouveaux aspects de la signalisation cellulaire et tissulaire.

Le calcium est un deuxième messager largement conservé qui joue un rôle essentiel dans la régulation de la physiologie cellulaire1. Compte tenu de sa forte charge, de sa petite taille et de sa grande solubilité dans des conditions physiologiques, le calcium est un manipulateur idéal de la conformation des protéines. Cela fait du calcium un moyen puissant de transduire les signaux électrochimiques en altérations enzymatiques, transcriptionnelles ou post-transcriptionnelles. Les gradients stricts de concentration de calcium à travers le réticulum endoplasmique (RE) et les membranes plasmiques créent une force motrice élevée qui permet des changements rapides de la concentration de calcium cytosolique. De multiples mécanismes, y compris la mise en mémoire tampon et le transport actif, maintiennent étroitement ce gradient. Bien que nécessaire aux fonctions cellulaires normales, cet entretien est coûteux en énergie, ce qui le rend particulièrement sensible aux états de stress 2.
En tant que tel, la dérégulation du calcium dans le cytosol est un signal quasi universel de nombreux types de stress cellulaire. Les perturbations métaboliques, les toxines, les agents pathogènes, les dommages mécaniques et les perturbations génétiques peuvent tous perturber la signalisation du calcium. Quel que soit le stimulus, au niveau de la cellule entière, des augmentations soutenues et incontrôlées du calcium cytosolique peuvent favoriser l’apoptose et éventuellement la nécrose 3,4. Cependant, les altérations des taux de calcium cytosolique de plus faible amplitude ou de fréquence plus élevée ont des effets variables2. De même, les résultats des fluctuations calciques peuvent différer en fonction du microdomaine spatial dans lequel elles se produisent5. La surveillance des niveaux de calcium peut donc donner un aperçu des processus de signalisation dynamiques, mais cela nécessite un échantillonnage avec une résolution temporelle et spatiale relativement élevée.
Les indicateurs calciques génétiquement codés (GECI) sont des outils puissants pour l’échantillonnage continu dans les systèmes de cellules vivantes6. Certains des GECI les plus largement utilisés sont des protéines fluorescentes sensibles au calcium à base de GFP, connues sous le nom de GCaMPs7. Le GCaMP canonique est une fusion de trois domaines protéiques distincts : une GFP permutée circulairement (cpGFP), la calmoduline et M136. Le domaine de la calmoduline subit un changement de conformation lors de la liaison du calcium, ce qui permet son interaction avec M13. L’interaction calmoduline-M13 induit un changement conformationnel de la cpGFP qui augmente son émission fluorescente lors de l’excitation. En tant que tel, une augmentation de la concentration de calcium est corrélée à une augmentation de l’intensité de fluorescence GCaMP. Ces capteurs peuvent être cytosoliques ou ciblés sur des organites spécifiques8.
Comme la plupart des tissus, le calcium régule diverses fonctions au sein de l’épithélium gastro-intestinal. L’épithélium intestinal fait partie intégrante de l’absorption des nutriments et des liquides, mais doit également former une barrière étanche et une interface immunitaire pour éviter l’invasion d’agents pathogènes ou les agressions toxiques. Les voies dépendantes du calcium influencent presque toutes ces fonctions vitales 9,10,11. Cependant, la signalisation calcique dans l’épithélium intestinal reste une frontière sous-explorée avec un potentiel prometteur en tant que cible thérapeutique. Alors que la surveillance de la dynamique du calcium dans l’épithélium intestinal in vivo continue de présenter des défis, les organoïdes intestinaux humains (DOI) offrent un système ex vivo adaptable pour l’expérimentation12. Les HIO sont des sphéroïdes tridimensionnels (3D) dérivés de cellules souches intestinales humaines et, lors de la différenciation, récapitulent une grande partie de la diversité cellulaire de l’épithélium intestinal natif12.
Ce protocole décrit des méthodes complètes pour concevoir des OIS qui expriment des GECI, puis préparer des OIS modifiés sous forme de monocouches pour l’imagerie du calcium sur cellules vivantes. Il propose l’infection virale comme exemple d’une manipulation pathologique qui perturbe la signalisation calcique et fournit une approche analytique pour quantifier ces changements.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine EDTA&nbsp ;</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>0,05 % de trypsine EDTA.</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>Tubes microcentrifuges 1,5 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>5408137</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques 15 ml</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>16 % formaldéhyde</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco 15630080</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco 15630080</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de calibre 25</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>1482113D</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-antimycocytaire</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-antimycosique&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplément</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>FisherScientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>BP1600100</tr><tr><td>CellView Lame de culture cellulaire, PS, 75/25 MM, fond en verre, 10 compartiments</td><td>Greiner</td><td>543979</td><td></td></tr><tr><td>Collagène IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin&nbsp ;</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin&nbsp ;</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Fluorobrite</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp ;</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp ;</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique humain</td><td>ProteinTech</td><td>HZ-1326</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>VectorBuilder</td><td>(variable)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosceicen</td><td>356231/CB40230C</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acétylcystéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Culture cellulaire traitée Plaques 24 puits</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>MilliporeSigma</td><td>TR1003G</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S70767</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme TrypLE Express, sans rouge de phénol</td><td>Thermofisher</td><td>Scientific 12604013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Worthington</td><td>NC9811754</td><td></td>biochimique</tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie calcique en direct de monocouches organoïdes intestinaux humains infectés par un virus à l’aide d’indicateurs de calcium codés génétiquement

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

La signalisation calcique est un régulateur intégral de presque tous les tissus. Dans l’épithélium intestinal, le calcium est impliqué dans la régulation de l’activité sécrétoire, de la dynamique de l’actine, des réponses inflammatoires, de la prolifération des cellules souches et de nombreuses autres fonctions cellulaires non caractérisées. En tant que tel, la cartographie de la dynamique de signalisation du calcium dans l’épithélium intestinal peut fournir un aperçu des processus cellulaires homéostatiques et dévoiler des réponses uniques à divers stimuli. Les organoïdes intestinaux humains (HIO) sont un modèle à haut débit, dérivé de l’homme, pour étudier l’épithélium intestinal et représentent donc un système utile pour étudier la dynamique du calcium. Cet article décrit un protocole permettant de transduire de manière stable les HIO avec des indicateurs calciques génétiquement codés (GECI), d’effectuer une microscopie à fluorescence en direct et d’analyser les données d’imagerie pour caractériser de manière significative les signaux calciques. À titre d’exemple représentatif, des HIO tridimensionnels ont été transduits avec des lentivirus pour exprimer de manière stable GCaMP6s, un GECI cytosolique à base de protéines fluorescentes vertes. Les HIO modifiés ont ensuite été dispersés dans une suspension unicellulaire et ensemencés sous forme de monocouches. Après la différenciation, les monocouches de HIO ont été infectées par le rotavirus et/ou traitées avec des médicaments connus pour stimuler une réponse calcique. Un microscope à épifluorescence équipé d’une chambre d’imagerie en direct humidifiée et à température contrôlée a permis d’imager à long terme des monocouches infectées ou traitées par des médicaments. Après l’imagerie, les images acquises ont été analysées à l’aide du logiciel d’analyse gratuit ImageJ. Dans l’ensemble, ces travaux établissent un pipeline adaptable pour caractériser la signalisation cellulaire dans les DOI.

La figure 1A montre un dôme BMM contenant des organoïdes intestinaux humains en 3 dimensions qui ont été transduits pour exprimer de manière stable les GCaMP6. La figure 1B montre la même lignée d’organoïde replaqué en monocouche à 24, 48 et 72 h après le semis. Pour valider la fonction des GCaMP6s, la monocouche a été imagée par microscopie à fluorescence toutes les 2 s pendant 4 min, et 100 nM d’ADP ont été ajoutés au milieu après ~20 s. L’ADP provoque la libération de calcium par le réticulum endoplasmique, augmentant ainsi le calcium cytosolique. L’intensité de fluorescence détectée sur le canal de 488 nm à chaque exposition est représentée à la figure 1C. La trace montre une intensité de fluorescence de base constante, suivie d’une augmentation rapide lors de l’ajout d’ADP et d’un retour progressif vers la ligne de base. Une commande de véhicule est incluse pour vérifier qu’il s’agit d’un véritable événement de signalisation, et non d’un simple changement d’intensité de fluorescence qui peut résulter de l’ajout de milieux.
Le marquage d’une monocouche HIO augmente l’efficacité de l’infection à rotavirus. Bien que les techniques de notation varient, il est plus facile d’obtenir une infection cohérente en utilisant un seul score sur toute la longueur de la monocouche, comme le montre la figure 2A. Lors de l’utilisation de souches recombinantes de rotavirus qui expriment des protéines fluorescentes, l’infection peut être vérifiée lors de l’imagerie en direct (Figure 2B). Lors de l’utilisation d’une souche qui n’exprime pas de marqueur, l’infection peut être détectée par immunofluorescence après imagerie. Compte tenu de la motilité des cellules dans les monocouches de GIO, il est souvent difficile de suivre une seule cellule infectée au fil du temps. Au lieu de cela, utilisez la coloration des points de terminaison comme méthode pour vérifier l’infection et confirmer que la multiplicité de l’infection correspond entre les champs de vision (Figure 2C).
Les ondes calciques intercellulaires dans les DOI peuvent être observées qualitativement, comme le montre la figure 3A. Cependant, la détermination de la fréquence des ondes calciques dans un champ de vision donné nécessite une analyse quantitative. Les étapes d’une segmentation réussie, telles que décrites à l’étape 6 du protocole ci-dessus, sont illustrées à la figure 3A. La figure montre l’image brute (Figure 3Ai), l’image après soustraction des intensités de pixels de l’image précédente (Figure 3Aii), puis l’onde calcique segmentée (Figure 3Aiii).
Une fois que les ondes calciques ont été segmentées et quantifiées pour chaque champ de vision au cours de l’imagerie, il est souvent instructif de comparer la fréquence des ondes dans les monocouches exposées à diverses conditions. Le diagramme en bandes de la figure 3B montre le nombre total d’ondes calciques par champ de vision dans les monocouches simulées et inoculées par le rotavirus. Cet exemple comprend deux souches de RV : une souche de rotavirus humain (Ito HRV) et une souche recombinante de rotavirus simien SA11 qui exprime mRuby (SA11-mRuby). Le témoin infecté simulé est considéré comme la fréquence d’onde calcique de base, les monocouches infectées par le rotavirus non traitées servent de témoins positifs, et les monocouches infectées par le rotavirus et traitées sont les conditions expérimentales. Les monocouches infectées par des simulacres et des RV traitées avec des médicaments, y compris l’inhibiteur du récepteur ADP, BPTU, peuvent ensuite être comparées aux deux conditions de contrôle par ANOVA à un facteur. Les données suggèrent que le BPTU diminue efficacement la fréquence des ondes calciques intercellulaires.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig01.jpg"> Figure 1 : Validation de l’expression de GCaMP6s dans des organoïdes intestinaux humains jéjunaux. (A) Après la transduction des lentivirus, les HIO exprimant GCaMP ont subi une sélection et de multiples passages, montrés ici à 7 jours depuis le passage le plus récent. Lors de la stimulation avec le laser de 488 nm, l’expression de GCaMP6s est évidente dans les HIO transduits plaqués dans une matrice membranaire basale de 15 μL sous forme de sphéroïdes tridimensionnels (Ai). Des expositions de 50 ms ont été acquises à 50 % de la puissance laser à l’aide d’un objectif 20x, puis assemblées pour visualiser l’ensemble du dôme de la matrice de la membrane sous-jacente. Un processus similaire a été réalisé en utilisant des expositions en fond clair de 4 ms (Aii). Sur l’image en fond clair, les HIO sombres au centre du dôme indiquent que les cultures sont prêtes à être traversées. (B) Les HIO ont été digérés enzymatiquement dans une suspension unicellulaire, puis replaqués à une densité de 150 000 cellules par puits (5 mm de diamètre) d’une plaque inférieure d’imagerie pré-enrobée de collagène IV. 72 h après l’ensemencement, la monocouche était confluente et prête pour les applications en aval. Pour valider la fonction de GCaMP, les images ont été acquises à l’aide du jeu de filtres de 488 nm avec des expositions de 50 ms à 50 % de puissance laser toutes les 2 s pendant 4 min. (C) Les traces présentées ici représentent l’intensité de fluorescence du champ entier normalisée à la première acquisition au cours de l’imagerie. Vers 20 s (flèche), après la dixième exposition, 100 nM d’adénosine diphosphate (ADP) ont été ajoutés pour provoquer un pic de calcium cytosolique (rouge). L’ajout d’un volume égal de 1x PBS n’a pas suscité de réponse significative (bleu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig02.jpg"> Figure 2 : Rainage d’une monocouche HIO pour faciliter l’infection par le virus de la RV. (A) La figure illustre une technique appropriée pour marquer une monocouche à l’aide d’une aiguille 25G. (B) Une monocouche HIO a été infectée par une souche recombinante de RV qui exprime la protéine fluorescente mRuby (magenta, flèche), ce qui a permis d’identifier les cellules infectées. Alternativement, lors de l’utilisation d’une souche naturelle de RV, les cellules infectées peuvent être identifiées par immunofluorescence. (C) Les images présentées proviennent de 4 monocouches HIO différentes après fixation, coloration DAPI (bleu) et marquage d’anticorps de l’antigène du rotavirus (magenta). Les deux techniques illustrent l’infection préférentielle du RV près de la partie rainurée de la monocouche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig03.jpg"> Figure 3 : Segmentation et quantification des ondes calciques intercellulaires induites par le RV. Les expositions de 488 nm d’HIO infectés par RV exprimant des GCaMP6 ont été acquises toutes les 1 minute pendant 16 h en utilisant le protocole. (A) La figure illustre le processus de segmentation de l’onde calcique intercellulaire. Tout d’abord, les valeurs de pixel de l’acquisition précédente (t-1) sont soustraites de chaque image brute (Ai) pour quantifier le changement d’intensité de fluorescence (Aii). Un seuil basé sur une augmentation minimale de l’intensité optimisée expérimentalement par rapport à l’image précédente est ensuite appliqué. Les images sont ensuite filtrées pour une zone de signal contiguë minimale afin de sélectionner les ondes calciques intercellulaires (Aiii) et d’exclure les signaux calciques unicellulaires. Ce traitement permet de quantifier les ondes calciques à chaque champ de vision. Dans cette expérience, les monocouches ont été soit infectées par simulacres, soit infectées par la souche ITO du rotavirus humain (HRV), soit infectées par une souche recombinante de rotavirus simien codant pour mRuby sur le segment de gène 7, en aval de la protéine non structurale 3 (SA11-mRuby). Les monocouches infectées ont été soit traitées avec l’inhibiteur du récepteur ADP BPTU, soit laissées sans traitement. Les monocouches ont ensuite été imagées à 8 positions différentes, et les ondes calciques dans chaque champ de vision ont été quantifiées à l’aide du pipeline décrit dans ce protocole. Les points sur le diagramme à bandes indiquent le nombre d’ondes calciques détectées à chaque position superposées sur un graphique à barres marquant la moyenne et l’écart-type. L’ANOVA à un facteur suivie des tests de Dunnett montre que, bien que l’une ou l’autre souche de RV augmente la fréquence des ondes calciques intercellulaires au-dessus de celle du groupe non infecté, le traitement BPTU empêche l’augmentation de la fréquence des ondes calciques médiée par la RV. **p<0,01, ***p<0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Réactif</td>
			<td>Transduction</td>
			<td>Contrôle</td>
		</tr><tr><td>Y-27632 (stock de 1 mM)</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>4 μL</td>
		</tr><tr><td>Polybrène (1 mg/μL de bouillon)</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>Lentivirus</td>
			<td>variable*</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HighWnt-WRNE *voir notes</td>
			<td>jusqu’à 400 μL</td>
			<td>jusqu’à 400 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Milieu de transduction des lentivirus. Préparer le milieu de transduction et le milieu de contrôle en combinant les réactifs dans les volumes indiqués dans les deuxième et troisième colonnes, respectivement. Visez une multiplicité d’infection (MOI) de 10 unités de transduction de lentivirus par cellule. Pour le LV conditionné en interne, cela nécessite généralement ~25-50 μL de LV concentré. Le titre de la plupart des VG emballés commercialement sera fourni avec le certificat d’analyse.
Fichier de codage supplémentaire 1 : Script macro ImageJ pour permettre la quantification des ondes calciques par traitement par lots. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/Wave_counter.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ce protocole décrit une approche pour effectuer l’imagerie calcique dans les organoïdes intestinaux humains infectés par le virus et propose une approche d’analyse.

Imagerie calcique en direct de monocouches organoïdes intestinaux humains infectés par un virus à l’aide d’indicateurs de calcium codés génétiquement

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

Grâce à nos travaux, nous cherchons à comprendre comment les virus perturbent la signalisation au sein de l’épithélium intestinal. Nous sommes particulièrement intéressés à comprendre comment les cellules infectées par le virus dérèglent les cellules voisines non infectées pour contribuer à la pathogenèse. Nous avons récemment découvert que les cellules infectées par le rotavirus libèrent des impulsions d’ADP, qui dérégulent les cellules voisines non infectées et facilitent la propagation virale et exacerbent la maladie.Bien que l’imagerie calcique soit très populaire dans des domaines comme les neurosciences, elle n’a pas été largement utilisée pour étudier la biologie épithéliale ou la virologie. Ce protocole offre une approche permettant d’adapter les technologies existantes et les systèmes modèles pour étudier la signalisation calcique et les tissus épithéliaux infectés par des virus vivants. En concevant des organoïdes pour exprimer des indicateurs calciques génétiquement codés, notre approche permet une imagerie à long terme cohérente et reproductible dans un système modèle qui récapitule la diversité cellulaire de l’épithélium intestinal humain.Notre objectif est de comprendre les effets de la signalisation purinergique paracrine induite par le virus à la fois pour l’hôte et pour le virus. Nos travaux futurs détermineront également si ce type de signalisation est largement conservé chez d’autres virus et si les effets sont similaires.

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