Utilisation de l’imagerie de cellules vivantes pour mesurer les effets de protéines pathologiques sur le transport axonal dans les neurones primaires de l’hippocampe
22 décembre 2023
Ici, nous démontrons comment combiner la transfection des neurones primaires de rongeurs de l’hippocampe avec l’imagerie confocale de cellules vivantes pour analyser les effets induits par les protéines pathologiques sur le transport axonal et identifier les voies mécanistes médiant ces effets.
Les neurones dépendent du transport bidirectionnel de la cargaison le long de l’axone pour maintenir la synapse fonctionnelle et la connectivité neuronale. On pense que les déficits de transport contribuent de manière critique à la pathogenèse de plusieurs maladies neurodégénératives. Notre objectif est d’identifier les mécanismes par lesquels les modifications de la protéine tau associées à la maladie perturbent le transport axonal.
Nous avons établi que plusieurs formes pathologiques de la protéine tau perturbent le transport axonal normal dans les neurones des mammifères. Cet effet dépend des modifications des voies de signalisation basées sur la phosphorylation qui régulent le transport axonal. Ces perturbations représentent un mécanisme potentiel de neurotoxicité induite par la protéine tau dans la maladie.
Les formes modifiées de protéines spécifiques peuvent perturber le transport axonal rapide normal dans plusieurs maladies neurodégénératives. Cependant, nous ne comprenons pas entièrement les mécanismes sous-jacents de ces effets. Il s’agit d’un protocole simple et reproductible permettant d’identifier comment l’expression des protéines associées à la maladie affecte le transport axonal rapide dans les neurones des mammifères.
Ce protocole fournit un test reproductible pour le transport axonal dans les neurones primaires de mammifères, qui est facilement modifiable pour inclure diverses protéines de transport ainsi que l’expression de protéines d’intérêt avec des modifications pathologiques spécifiques. Il permet également d’éliminer de manière ciblée d’autres composants de la voie pour tester des détails mécanistes particuliers.
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Aperçu
Cette étude illustre la combinaison de la transfection de neurones primaires hippocampiques de rongeur avec l'imagerie confocale en temps réel sur cellules vivantes afin d'explorer les effets des modifications pathologiques des protéines sur le transport axonal. L'objectif est de découvrir les voies mécanistiques qui médient les perturbations causées par les modifications de la protéine tau dans les maladies neurodégénératives.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Transport axonal
- Maladies neurodégénératives
Contexte
- Les neurones assurent le transport bidirectionnel de cargaisons le long des axones pour maintenir leur fonctionnalité.
- Des déficits dans ce transport sont associés à plusieurs maladies neurodégénératives.
- Les formes modifiées de la protéine tau perturbent les mécanismes normaux de transport.
- La compréhension de ces mécanismes pourrait révéler les voies de la neurotoxicité induite par la protéine tau.
Objectif de l'étude
- Identifier les voies de signalisation modifiées par les modifications pathologiques de la protéine tau.
- Établir un protocole pour analyser le transport axonal dans les neurones de mammifères.
- Faciliter le ciblage de diverses protéines affectant les mécanismes de transport.
Méthodes utilisées
- Des neurones hippocampiques primaires ont été transfectés et analysés à l'aide de la microscopie confocale en temps réel.
- Le protocole comprend la dissection du tissu hippocampique de souris embryonnaires et la culture cellulaire ultérieure.
- Aucune analyse multiomique n'est mentionnée dans le texte fourni.
- Les étapes critiques incluent la préparation des lames, le transfection des neurones et l'observation deux jours après le transfection.
- Les détails méthodologiques importants incluent l'utilisation de paramètres d'imagerie spécifiques pour visualiser le transport axonal.
Résultats principaux
- Les formes pathologiques de la protéine tau perturbent les dynamiques normales du transport axonal.
- La perturbation du transport est associée à des modifications des voies de phosphorylation.
- Ces perturbations pourraient contribuer à la neurodégénérescence.
- L'étude établit une approche reproductible pour analyser les altérations du transport induites par des protéines pathologiques.
Conclusions
- La présente étude démontre une méthode permettant d'analyser les effets des protéines modifiées sur le transport neuronal.
- La compréhension de ces mécanismes fournit des éclairages sur le dysfonctionnement neuronal dans les contextes pathologiques.
- Les résultats pourraient améliorer la connaissance du transport axonal dans les affections neurodégénératives.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Le transport axonal perturbé constitue un mécanisme convergent dans la pathogenèse des maladies neurodégénératives, affectant la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques en phase de découverte précoce. L'imagerie en temps réel de neurones hippocampiques primaires permet une évaluation quantitative de la manière dont des protéines pathologiques, telles que la protéine tau mutante, modifient la dynamique des cargaisons, renforçant ainsi la fiabilité prédictive dans des systèmes pertinents pour la maladie. Ce protocole reproductible guide le tri et la priorisation des cibles dans le portefeuille de recherche sur la neurodégénérescence en clarifiant les vulnérabilités mécanistiques.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet d'interroger les modifications des protéines pertinentes pour la maladie sur les mécanismes de transport neuronal.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles en quantifiant les phénotypes de perturbation du transport.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques dans le choix des cibles de neurodégénérescence.
- Offre une plateforme pour tester des stratégies d'inhibition génique ou de modulation de voies.
Tests et développement de dosages
- Établit un test validé sur cellules vivantes pour la quantification du transport axonal dans les neurones primaires.
- Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs tels que la vitesse, la fréquence des pauses et la densité des cargaisons.
- Permet la standardisation du test pour le criblage de composés ou de perturbations génétiques.
- Prend en charge l'évolutivité et l'adaptation à d'autres protéines pertinentes pour les maladies.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des modèles neuronaux pertinents pour la maladie afin d'explorer des biomarqueurs translationnels.
- Assure une continuité allant de la découverte mécanistique à la validation préclinique des phénotypes de transport.
- Éclaire les décisions d'avancement ajustées au risque pour les programmes de neurodégénérescence.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole d'imagerie de cellules vivantes s'intègre dès la phase de découverte précoce jusqu'à l'identification de composés candidats, en soutenant les tests d'hypothèses mécanistiques et le développement de tests pour des cibles de maladies neurodégénératives.
- Biologie de la découverte : Quantifie l'impact des modifications pathologiques des protéines sur le transport axonal, clarifiant ainsi les mécanismes des maladies.
- Écrantage : Fournit des lectures normalisées et reproductibles pour l'écrantage de composés ou de facteurs génétiques dans des neurones primaires.
- Analytique : Génère des métriques quantitatives (vitesse, fréquence des pauses, densité des cargaisons) permettant des comparaisons robustes entre conditions.
- Recherche translationnelle : Conserve une pertinence pathologique en utilisant des systèmes neuronaux primaires et des paramètres phénotypiques.
- Réutilisation en milieu professionnel : Protocole adaptable à diverses cibles protéiques impliquées dans les maladies neurodégénératives et aux études mécanistiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la recherche sur la neurodégénérescence.
- Valeur opérationnelle : Fournit des protocoles d'imagerie en temps réel standardisés, reproductibles et évolutifs.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées d'aller/arrêt et une gestion efficace du portefeuille en termes de capital.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation et l'avancement des cibles de neurodégénérescence ajustés au risque.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture primaire de neurones et en imagerie confocale sur cellules vivantes.
- Requiert un accès à une microscopie avancée et à des outils d'analyse quantitative d'images (par exemple, KymoAnalyzer).
- Exige une standardisation interéquipes pour assurer la reproductibilité et la comparabilité des données.
- Adaptable à diverses protéines pertinentes pour les maladies et à des perturbations génétiques.
- Limité aux systèmes de neurones primaires in vitro ; peut ne pas rendre compte de toutes les complexités in vivo.
F.A.Q. sur la bio-pharmacie
Chapters in this video
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Introduction
1:30
Harvesting of Primary Hippocampal Neurons for Live‐Cell Imaging
4:06
Primary Hippocampal Neuron Dissociation and Plating for the Measurement of the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport
6:38
Live‐Cell Imaging of Primary Hippocampal Neurons for the Measurement of the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport
