Name: Une méthode simple, rapide et efficace pour l’analyse de la xénotransplantation tumorale dans les embryons de poisson-zèbre transparent (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Découvrez une méthode rapide de xénotransplantation tumorale dans les embryons de poisson-zèbre transparent. Cette technique utilise la cytométrie en flux pour évaluer la progression tumorale et la charge pathologique en oncologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par des subventions des NIH R37AI110985 et P30CA006927, une affectation du Commonwealth de Pennsylvanie, de la Leukemia and Lymphoma Society et du Bishop Fund. Cette étude a également été soutenue par les installations centrales de Fox Chase, y compris la culture cellulaire, la cytométrie en flux et l’installation d’animaux de laboratoire. Nous remercions la Dre Jennifer Rhodes d’avoir maintenu l’installation de poisson-zèbre et de micro-injection au FCCC.

Utilisation de larves de poisson-zèbre pour des études efficaces de tumeurs in vivo

<ol><li>Sharma, G., Goyal, Y., Bhatia, S. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSharma%2C+G+%22Preclinical+Animal+Models+of+Cancer%3A+Applications+and+Limitations%22">Preclinical Animal Models of Cancer: Applications and Limitations</a>. , Springer. Singapore. (2022).</li>
<li>Singhal, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancement+in+breast+cancer+research%3A+Insights+from+model+organisms-Mouse+models+to+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Recent advancement in breast cancer research: Insights from model organisms-Mouse models to zebrafish.</a> Cancers. 15 (11), 2961(2023).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models+in+cancer+therapy%3A+technologies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 8 (1), 160(2023).</li>
<li>Fuochi, S., Galligioni, V. Disease Animal Models for Cancer Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuochi%2C+S+%22Cancer+Cell+Culture%3A+Methods+and+Protocols%22">Cancer Cell Culture: Methods and Protocols</a>. , Springer, Humana. New York, NY. (2023).</li>
<li>Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+intraperitoneal%2C+orthotopic%2C+and+metastatic+xenograft+models+of+human+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer.</a> Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).</li>
<li>Deroose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+imaging+of+tumor+xenografts+and+metastases+in+mice+with+combined+small-animal+PET%2C+small-animal+CT%2C+and+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging.</a> J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).</li>
<li>Zeng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+evolution%2C+interfering+factors%2C+applications%2C+and+challenges+of+patient-derived+xenograft+models+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice.</a> Cancer Cell Int. 23 (1), 120(2023).</li>
<li>Adhish, M., Manjubala, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+zebrafish+models+in+understanding+human+diseases-A+review+of+models%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models.</a> Heliyon. 9 (3), e14557(2023).</li>
<li>MacRae, C. A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+mainstream+model+for+in+vivo+systems+pharmacology+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology.</a> Ann Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).</li>
<li>Choe, S. -K., Kim, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+powerful+model+for+genetics+and+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A powerful model for genetics and genomics.</a> Int J Mol Sci. 24 (9), 8169(2023).</li>
<li>White, R., Rose, K., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cancer%3A+the+state+of+the+art+and+the+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward.</a> Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).</li>
<li>Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cancer+avatars%3A+A+translational+platform+for+analyzing+tumor+heterogeneity+and+predicting+patient+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes.</a> Int J Mol Sci. 24 (3), 2288(2023).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>Hill, D., Chen, L., Snaar-Jagalska, E., Chaudhry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+zebrafish+xenograft+assay+of+human+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Embryonic zebrafish xenograft assay of human cancer metastasis.</a> F1000Res. 7, 1682(2018).</li>
<li>Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukaemia+xenotransplantation+in+zebrafish--chemotherapy+response+assay+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo.</a> Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinically+relevant+in+vivo+zebrafish+model+of+human+multiple+myeloma+to+study+preclinical+therapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy.</a> Blood. 128 (2), 249-252 (2016).</li>
<li>Grissenberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+drug+screening+in+zebrafish+xenografts+reveals+high+efficacy+of+dual+MCL-1%2FBCL-XL+inhibition+against+Ewing+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma.</a> Cancer Lett. 554, 216028(2023).</li>
<li>Baxi, D. Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaxi%2C+D+%22Handbook+of+Animal+Models+and+its+Uses+in+Cancer+Research%22">Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research</a>. , Springer. Singapore. (2022).</li>
<li>Li, X., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+zebrafish+patient-derived+xenograft+tumor+models+in+the+development+of+antitumor+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents.</a> Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+patient-derived+xenograft+model+as+a+preclinical+platform+for+uveal+melanoma+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery.</a> Pharmaceuticals. 16 (4), 598(2023).</li>
<li>Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+screening+to+identify+anti-metastatic+drugs+in+Twist1a-ER%28T2%29+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish.</a> Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).</li>
<li>Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish%2C+Danio+rerio%3A+a+gene+expression+profiling%2C+in+situ+hybridization+and+immunological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).</li>
<li>Nicoli, S., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish%2Ftumor+xenograft+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.</a> Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).</li>
<li>Casey, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+zebrafish+pediatric+brain+tumors+into+immune-competent+hosts+for+long-term+study+of+tumor+cell+behavior+and+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response.</a> J Vis Exp. (123), e55712(2017).</li>
<li>Soh, G. H., Kögler, A. C., Müller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+effective+transplantation+device+for+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (174), e62767(2021).</li>
<li>Martinez-Lopez, M., Póvoa, V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+zebrafish+larval+xenografts+and+tumor+behavior+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis.</a> J Vis Exp. (172), e62373(2021).</li>
<li>Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+behavior+of+human+breast+cancer+cells+in+embryonic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish.</a> J Vis Exp. (122), e55459(2017).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+xenograft+model+in+zebrafish+for+high-resolution+investigating+dynamics+of+neovascularization+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors.</a> PloS One. 6 (7), e21768(2011).</li>
<li>Cabezas-Sáinz, P., Pensado-López, A., Sáinz Jr, B., Sánchez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+cancer+using+zebrafish+xenografts%3A+drawbacks+for+mimicking+the+human+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment.</a> Cells. 9 (9), 1978(2020).</li>
<li>Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-imaging+analyses+using+small+fish+models+reveal+new+mechanisms+that+regulate+primary+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Yakugaku+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis.</a> Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Oregon. (2000).</li>
<li>Rao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+ribosomal+protein+L22+promotes+transformation+by+induction+of+the+stemness+factor%2C+Lin28B%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B.</a> Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).</li>
<li>Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+survival+analysis%3A+Kaplan-Meier+estimate%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Ayurveda+Res%22%5BJournal%5D)">Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate.</a> Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).</li>
<li>Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+zebrafish+patient-derived+xenografts+from+pancreatic+cancer+for+chemosensitivity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing.</a> J Vis Exp. (195), e63744(2023).</li>
<li>Murali Shankar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+assessment+of+CAR-NK+cell-mediated+killing+efficacy+and+pharmacokinetics+in+a+rapid+zebrafish+xenograft+model+of+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer.</a> Front Immunol. 14, 1254821(2023).</li>
<li>Takahi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenograft+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+lineage+cells+on+zebrafish+embryo+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart.</a> Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).</li>
<li>Rudner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+acquired+genomic+changes+in+zebrafish+and+human+T-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL.</a> Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).</li>
<li>Regan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+long-term+label-retaining+colon+cancer+stem+cells+identifies+novel+regulators+of+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence.</a> iScience. 24 (6), 102618(2021).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.

La xénotransplantation de poisson-zèbre est apparue comme une alternative rapide, robuste et rentable aux études sur les souris12. Bien que plusieurs approches de xénotransplantation de poisson-zèbre aient été rapportées, notre adaptation a entraîné des améliorations significatives. En plus de normaliser les paramètres autour de la procédure, ces améliorations se concentrent spécifiquement sur l’accélération de la vitesse à laquelle les injections tumorales peuvent être effectuées, permettant ainsi une augmentation du nombre d’animaux par bras d’étude et l’utilisation du marquage tumoral pour surveiller la qualité de l’injection et le comportement post-injection. 
Bien que les améliorations apportées à cette méthode décrites ici aient un grand potentiel, l’exécution réussie de cette stratégie nécessitera un praticien qualifié et une optimisation pour l’application spécifique. Nous avons utilisé des cellules leucémiques. Par conséquent, l’utilisation de cancers solides peut présenter des défis supplémentaires. De telles tumeurs peuvent être sujettes à l’agrégation, ce qui créerait une variabilité dans l’administration du bolus cellulaire ; cependant, même dans de telles circonstances, l’étiquetage RFP devrait permettre un contrôle adéquat de la qualité du bolus après l’injection. Ceci est supérieur au marquage GFP ou aux colorants verts, qui sont obscurcis par l’autofluorescence. Enfin, la standardisation décrite ici de la plupart des paramètres ayant un impact sur le succès (santé de l’embryon, température de l’aquaculture, orifice de l’aiguille, pression d’injection, etc.) minimise la variabilité de ce processus. 
Le site d’injection est une considération majeure pour les expériences de xénotransplantation chez le poisson-zèbre. Ici, nous avons montré que les injections dans le vitellin sont assez faciles par rapport à d’autres sites plus difficiles sur le plan technique, comme l’espace périviteline34, le canal de Cuvier35 et l’injection intracardique (ventricule cardiaque)36. L’inconvénient de l’injection de vitellin est qu’il s’agit d’un organe vital pour les embryons en croissance, il faut donc veiller à ce que le diamètre et la pression de l’aiguille soient soigneusement contrôlés afin que l’embryon ne meure pas en raison d’un traumatisme par injection. L’approche décrite ici atténue cette préoccupation en minimisant les blessures et en éliminant toute blessure évidente ou la mort de 1 dpi, car ces problèmes ne sont pas liés à la croissance tumorale. La dernière considération concernant le site d’injection est que des microenvironnements distincts peuvent avoir une capacité plus ou moins grande à soutenir la propagation des tumeurs xénotransplantées. Par conséquent, peut-être que les injections de vitellus peuvent être effectuées en premier avant de passer à des injections orthotopiques plus difficiles. Le principal avantage de l’injection de vitellus est qu’elle ne nécessite pas de stadification précise de l’embryon et permet ainsi une injection plus rapide d’un plus grand nombre d’embryons, préservant ainsi mieux leur santé et augmentant la puissance statistique pour résoudre les différences de comportement des cellules tumorales transplantées.
La surveillance post-injection de la progression de la maladie est généralement évaluée à l’aide des effets sur la survie à l’aide de l’analyse de Kaplan-Meier37 ; Cependant, le dépistage de la charge de morbidité peut également être très informatif. Pour les cellules transplantées qui restent au site d’injection, la charge tumorale peut être quantifiée à l’aide de diverses méthodes de microscopie, à condition que la méthode de marquage des cellules tumorales ne soit pas obscurcie par l’autofluorescence29. La coloration CM-Dil est facilement résolue et n’est pas affectée par l’autofluorescence, elle fonctionne donc bien pour quantifier la charge tumorale des cellules localisées. Le défi se produit lorsque les cellules tumorales ne restent pas au site d’injection et se desserrent. Dans de tels cas, la cytométrie en flux, associée à un marquage génétique indélébile à l’aide de protéines fluorescentes rouges, est un moyen très efficace de surveiller la charge de morbidité dans les couvées standardisées d’embryons, car la tumeur marquée peut être analysée en utilisant des colorants spécifiques à l’espèce différents de ceux des cellules de poisson-zèbre. L’une des inconvénientes de CM-Dil est qu’il est dilué par la division cellulaire38. En conséquence, l’adaptation à l’aide du marquage génétique des tumeurs à l’aide de RFP ou de mCherry présente des avantages significatifs. L’expression de mCherry, associée à un anticorps spécifique de la tumeur, permet d’identifier avec certitude les cellules transplantées parmi ce qui peut être un modèle complexe de signaux de fond fournis par les cellules de poisson-zèbre hôte. 
Ensemble, l’approche optimisée de xénotransplantation de poisson-zèbre et la méthode d’analyse utilisée dans cette étude apportent une amélioration substantielle à une plate-forme expérimentale déjà puissante.

L’analyse du comportement des tumeurs en réponse à une altération génétique ou à un traitement médicamenteux in vivo est un élément essentiel de la recherche sur le cancer 1,2,3,4. De telles études impliquent le plus souvent l’utilisation de modèles de souris immunodéprimées (Mus musculus)5 ; Cependant, les études de xénotransplantation chez la souris sont limitées à bien des égards, notamment en raison de leur capacité limitée, de leur durée prolongée, de leurs dépenses importantes et de la nécessité d’un équipement d’imagerie sophistiqué pour surveiller la progression des tumeurs internes 6,7. En revanche, le modèle du poisson-zèbre (Danio rerio) permet une plus grande capacité, une durée plus courte, des dépenses moindres et, en raison de sa transparence, un suivi simple de la progression de la maladie 8,9.
Le poisson-zèbre est un système modèle de vertébré bien développé avec un développement ex-utero et une fécondité élevée, avec des femelles individuelles produisant plus de 100 embryons10. De plus, les embryons de poisson-zèbre sont transparents, ce qui permet de visualiser facilement les processus de développement à l’aide de techniques liées à la fluorescence telles que les rapporteurs. Enfin, la conservation des processus de développement critiques en fait un modèle idéal pour de nombreux types d’études, y compris le comportement des cellules malignes transplantées11,12. Les embryons de poisson-zèbre de type sauvage développent des mélanocytes, ce qui les rend optiquement opaques à l’âge de 2 semaines, mais cela a été surmonté par la génération d’embryons de casper (roya9 ; mitfaw2), qui restent transparents tout au long de leur vie13. En raison de leurs propriétés optiques, les poissons-zèbres casper sont des receveurs idéaux de cellules tumorales transplantées 14,15,16. La xénotransplantation de cellules tumorales chez le poisson-zèbre a gagné en importance au cours des 2 dernières décennies 17,18,19,20,21. Les embryons de poisson-zèbre ont une immunité innée ; Cependant, ils n’ont pas d’immunité adaptative au cours de leur stade larvaire, ce qui les rend fonctionnellement immunodéprimés, ce qui leur permet de servir d’hôtes efficaces pour les xénogreffes tumorales transplantées22.
Des protocoles ont été développés pour la greffe tumorale chez les embryons de poisson-zèbre ainsi que chez les adultes qui ont pris en compte un certain nombre de variables différentes 23,24,25,26,27. Ceux-ci ont exploré de nombreux sites de dépôt tumoral chez le poisson zèbre, y compris des injections dans le vitellus, l’espace périvitellin et le cœur et à différents stades de développement16,28. La température ambiante de l’aquaculture pour les xénogreffes de poisson-zèbre est également importante, car l’élevage du poisson-zèbre se produit généralement à 28 °C, tandis que les cellules de mammifères se développent à 37 °C. Par conséquent, il faut utiliser une température de compromis qui soit tolérée par le poisson tout en favorisant la croissance tumorale, et 34 °C semble atteindre les deux objectifs29. L’analyse du comportement et de la progression des tumeurs après une xénotransplantation est un autre domaine d’intérêt majeur, et cela implique l’utilisation d’une variété de modalités d’imagerie ainsi que l’analyse de survie30. L’un des principaux avantages du modèle du poisson-zèbre est la disponibilité d’un grand nombre d’animaux à l’étude pour fournir une immense puissance statistique aux études in vivo du comportement tumoral ; Cependant, les approches précédentes ont considérablement limité ce potentiel en raison de l’exigence de procédures de montage fastidieuses pour les injections.
Ici, nous remédions à cette limitation en développant une méthode simple et rapide pour stadifier les embryons qui permet un débit élevé et un suivi de la qualité de l’injection à l’aide de la lignée transparente de poisson-zèbre casper . Cela implique l’injection de xénogreffes dans le sac vitellin des embryons de poisson-zèbre casper 2 jours après la fécondation (dpf). Nous observons la survie des embryons après une xénotransplantation dans le cadre de l’analyse du comportement tumoral. Nous montrons en outre l’évaluation de la charge de morbidité après une xénotransplantation en faisant des suspensions de cellules uniques et en analysant par cytométrie en flux (Figure 1).

<table><tbody><tr><td>1-phényl 2-thiourée (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Passoire à cellules de 70 microns</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>CLS431751-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 90 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S43565</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Apex bioresearch</td><td>20-102GP</td><td></td></tr><tr><td>APC APC anti-souris CD45.2 Anticorps Biolegend</td><td></td><td>109814</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5 Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSymphony A5</td><td></td></tr> calibration <tr><td>capillaires</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>P1424-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Traqueur de cellules CM-dil colorant</td><td>Invitrogen</td><td>C7001</td><td></td></tr><tr><td>Collageanse IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont numéro 55</td><td>Outils de sciences fines</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>35-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td> modèle <td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre (Borosilicate)</td><td>Instruments de précision mondiaux</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>Helix NP Blue</td><td>Biolegend</td><td>425305</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Instant ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique</td> modèle <td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de méthylène</td><td>Sigma</td><td>M9140-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microloader (pointes longues pour laoding des cellules)</td><td>eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>P1000 extracteur de micropipettes</td><td>Sutter instruments</td><td>modèle P-97</td><td></td></tr><tr><td>PM Microinjecteur à 1000 cellules</td><td>MicroData Instruments, Inc. (MDI)</td><td>PM1000</td><td></td></tr><tr><td>Méthanessulfate de tricaïne (méthanesulfatate d’éthyle 3-aminobenzoate)</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,5 %), sans rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Poisson zèbre adulte irradié régime alimentaire (alimentation sèche)</td><td>Zeigler</td><td>388763</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode simple, rapide et efficace pour l’analyse de la xénotransplantation tumorale dans les embryons de poisson-zèbre transparent

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

Les études in vivo du comportement tumoral sont un élément essentiel de la recherche sur le cancer ; Cependant, l’utilisation de souris présente des défis importants en termes de coût et de temps. Ici, nous présentons les larves de poisson-zèbre comme un modèle de transplantation qui présente de nombreux avantages par rapport aux modèles murins, notamment la facilité de manipulation, le faible coût et la courte durée d’expérience. De plus, l’absence d’un système immunitaire adaptatif pendant les stades larvaires rend inutile la production et l’utilisation de souches immunodéficientes. Bien qu’il existe des protocoles établis pour la xénotransplantation chez les embryons de poisson-zèbre, nous présentons ici une méthode améliorée impliquant la stadification des embryons pour un transfert plus rapide, l’analyse de la survie et l’utilisation de la cytométrie en flux pour évaluer le fardeau de la maladie. Les embryons sont stagénés pour faciliter l’injection rapide de cellules dans le jaune des larves et le marquage cellulaire pour surveiller la consistance du bolus cellulaire injecté. Après l’injection, l’analyse de la survie embryonnaire est évaluée jusqu’à 7 jours après l’injection (dpi). Enfin, la charge de morbidité est également évaluée par le marquage des cellules transférées avec une protéine fluorescente et l’analyse par cytométrie en flux. La cytométrie en flux est rendue possible par une méthode standardisée de préparation de suspensions cellulaires à partir d’embryons de poisson-zèbre, qui pourrait également être utilisée pour établir la culture primaire de cellules de poisson-zèbre. En résumé, la procédure décrite ici permet une évaluation plus rapide du comportement des cellules tumorales in vivo avec un plus grand nombre d’animaux par bras d’étude et de manière plus rentable.

Xénotransplantation La figure 1 présente une vue d’ensemble de l’ensemble de l’expérience et de l’analyse, allant de la production d’embryons à l’évaluation de la progression de la maladie par analyse de la survie et de la charge de morbidité par cytométrie en flux. Cette approche apporte plusieurs améliorations qui améliorent la reproductibilité et l’évolutivité de la xénotransplantation, ainsi qu’une nouvelle façon d’évaluer le fardeau de la maladie. Le succès de ces expériences dépend fortement de la santé des cellules transplantées, car les cellules qui ne sont pas saines et en phase logarithmique ne se propagent pas lors de la transplantation. La durée de la session d’injection est également un paramètre critique. Une fois les cellules tumorales préparées, il est essentiel de terminer l’injection dans le poisson-zèbre dans les 3-4 heures. L’approche utilisée dans cette étude permet d’injecter un plus grand nombre d’embryons pendant cette période grâce à la simple modification consistant à les stabiliser directement sur le côté sur une plaque d’agarose et à les injecter dans le jaune d’œuf (figure 2C, D). De plus, il est impératif que l’orifice optimal de l’aiguille soit sélectionné de manière à injecter suffisamment de cellules (400 à 600 cellules) mais que l’orifice ne soit pas trop grand pour ne pas endommager les embryons. Une autre considération est la pression d’injection. Nous constatons que des pressions supérieures à 12-13 psi perturbent le jaune des embryons, provoquant la mort. Enfin, une autre variabilité inhérente à cette procédure est la régularité de l’injection. Les cellules à injecter s’installent à l’extrémité de l’aiguille d’injection, ce qui rend difficile un contrôle précis dans le bolus d’injection. Lorsque les cellules sont xénotransplantées, tous les embryons ont le potentiel de recevoir le même bolus d’injection, mais en pratique, ce n’est pas le cas (Figure 3). Le nombre de cellules transférées peut varier considérablement en fonction du comportement des cellules tumorales (par exemple, l’agglutination) et du niveau de compétence de l’opérateur. Nous avons dissipé cette incertitude grâce à la coloration CM-Dil/marquage mCherry, qui permet la catégorisation post-injection des animaux qui ont reçu un bolus cellulaire approprié et cohérent, ainsi que ceux qui ont reçu un bolus inférieur. La coloration CM-Dil, mais plus efficace par une protéine fluorescente, présente l’avantage supplémentaire de faciliter le suivi de la progression de la maladie, soit par microscopie, soit par cytométrie en flux (Figure 4 et Figure 5).
Analyse du comportement tumoral La progression tumorale peut facilement être surveillée à l’aide d’une simple microscopie à fluorescence axée sur la RFP (Figure 4A). De même, le suivi traditionnel de la survie peut être effectué par analyse de Kaplan-Meier (log-rank et test de Wilcoxon) (Figure 4B). De manière impressionnante, contrairement aux études de xénotransplantation sur des souris où il y a généralement 8 à 10 animaux par bras d’étude, en utilisant la méthode du poisson-zèbre décrite ici, il n’est pas difficile d’obtenir des bras d’étude avec plus de 60 animaux chacun (Figure 4B). Cela augmente considérablement le pouvoir de résolution des études in vivo . Enfin, nous avons mis en œuvre une autre approche pour l’analyse de la charge de morbidité à l’aide de la cytométrie en flux. Cela implique la perturbation d’un nombre équivalent d’embryons et l’analyse du contenu en cellules tumorales de la suspension unicellulaire résultante par cytométrie en flux. En combinant un marqueur de surface cellulaire spécifique à la tumeur avec l’indicateur de protéine fluorescente, les souris xénotransplantées/cellules humaines peuvent être identifiées en toute confiance par cytométrie en flux comme approche pour évaluer la charge de morbidité (Figure 5). À cette fin, les protéines fluorescentes rouges sont supérieures car les protéines fluorescentes vertes n’ont pas réussi à fournir un signal sur l’autofluorescence des cellules de poisson-zèbre hôte. Ici, mCherry a été utilisé pour le marquage et la surveillance cellulaires tout au long de la xénotransplantation pour l’analyse FACS avec CD45. Le double marquage nous a permis de mesurer les différences de charge tumorale entre une bonne inoculation en bolus et une inoculation en bolus inférieure (Figure 5B, C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma de l’ensemble des procédures de xénotransplantation et d’analyse post-injection. (A) La configuration de reproduction, la collecte d’embryons et la morphologie 2 jours après la fécondation (dpf) sont schématisées. (B) Préparation, coloration et injections de cellules leucémiques pour la xénotransplantation dans le jaune d’embryons de poisson-zèbre. (C) Analyses post-xénotransplantation, y compris la survie et la cytométrie en flux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig02.jpg"> Figure 2 : Images représentatives des outils utilisés pour les injections. (A) Aiguilles tirées dans une plaque de Pétri. (B) La plaque d’agarose pour la stadification de l’embryon. (C, D) Une plaque montrant les embryons stagénés (schéma représentatif dans le panneau C et les embryons réels (cerclés en rouge) dans le panneau D) pour les injections sur la plaque de chargement d’embryons. L’encart dans le coin inférieur droit du panneau D montre une vue à plus fort grossissement des embryons stagésés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig03.jpg"> Figure 3 : Images représentatives d’embryons xénotransplantés. Des images en fond clair et immunofluorescentes sont montrées des cellules positives à la coloration CM-Dil (rouge) dans le jaune des embryons de casper à 1 dpi (image de couvée). Les embryons avec un bolus inférieur sont indiqués par une flèche jaune, tandis que ceux avec une morphologie perturbée sont indiqués par un astérisque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig04.jpg"> Figure 4 : Évaluation de la progression de la maladie par imagerie par fluorescence et analyse de survie. (A) Image représentative d’embryons xénotransplantés à 4 dpi et 7 dpi. (B) Le graphique de Kaplan Meier montrant l’analyse de survie d’embryons avec deux lignées de leucémie génétiquement distinctes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig05.jpg"> Figure 5 : Analyse cytométrique en flux de la charge de morbidité chez le poisson-zèbre xénotransplanté. (A) Représentation schématique de la préparation de la suspension cellulaire et analyse par cytométrie en flux. En bref, les embryons à 4 dpi sont désagrégés en suspensions unicellulaires à l’aide de trypsine et de collagénase, suivis d’une cytométrie en flux. (B) Graphiques représentatifs pour l’analyse par cytométrie en flux où l’image de gauche dans chaque panneau est un graphique FSC-A v/s SSC-A et l’image de droite est un signal CD45 v/s mCherry. (C) Graphique à barres montrant les statistiques cellulaires pour les cellules xénotransplantées obtenues à partir du graphique CD45 en fonction de mCherry pour les embryons non injectés, bons et inférieurs (n = 45, 40 et 40 pour chaque répétition (n = 3) ; valeur p * ≤ 0,05, calculée à l’aide du test t non apparié avec correction de Welch dans GraphPad Prism 9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Nous décrivons un protocole de xénotransplantation dans le jaune d’embryons de poisson-zèbre transparent qui est optimisé par une méthode de stadification simple et rapide. Les analyses post-injection comprennent la survie et l’évaluation de la charge de morbidité des cellules xénotransplantées par cytométrie en flux.

Une méthode simple, rapide et efficace pour l’analyse de la xénotransplantation tumorale dans les embryons de poisson-zèbre transparent

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Nous cherchons à obtenir des connaissances moléculaires sur le contrôle de l’hématopoïèse normale et maligne, puis à exploiter ces connaissances pour développer de nouvelles thérapies pour le traitement des cancers du sang. Les xénogreffes tumorales sont un outil indispensable pour évaluer l’impact d’une altération génétique ou d’un traitement sur le comportement tutumeur. Cependant, les xénogreffes de souris sont coûteuses, longues et de portée limitée.L’utilisation du poisson-zèbre pour la xénotransplantation tumorale permet de surmonter tous ces inconvénients. Dans ce protocole, nous démontrons un processus de montage facile et rapide pour la xénotransplantation, ce qui augmente le débit. Nous utilisons en outre la coloration cellulaire pour connaître la qualité de l’inoculum, puis la cytométrie en flux pour évaluer la progression tumorale en évaluant ou en quantifiant la charge de la maladie.Nous avons l’intention d’utiliser cette approche pour identifier de nouvelles façons de bloquer la fonction de la cascade de kinases Ras/MAP, qui est à l’origine de la grande majorité des cancers humains. Et nous le ferons non pas en essayant de bloquer l’activité catalytique de la cascade kinase Ras/MAP, mais plutôt en empêchant sa capacité à phosphoryler les substrats cancérigènes qu’elle modifie.

a-simple-rapid-effective-method-for-tumor-xenotransplantation

Research

Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

Cette vidéo décrit une méthode de micro-injection pour l’administration de cellules cancéreuses du sein dans l’espace périvitellin d’embryons de poisson-zèbre transgénique. Après l’incubation, nous visualisons l’embryon au microscope fluorescent pour observer l’invasion, la dissémination et les métastases des cellules cancéreuses.

zPDX-Analyse de l’invasivité : étude du comportement invasif des cellules cancéreuses métastatiques dans les xénogreffes d’embryons de poisson-zèbre

Cette vidéo décrit le test de xénogreffe de poisson-zèbre pour évaluer la formation de tumeurs in vivo et étudier l’effet des agents thérapeutiques.

Dosage de la xénogreffe de poisson-zèbre : une méthode pour évaluer l’efficacité anticancéreuse des produits thérapeutiques sur la tumorigénicité chez le poisson-zèbre in vivo

Cette vidéo démontre la transplantation orthotopique de cellules tumorales cérébrales de poisson-zèbre dans le quatrième ventricule d’un embryon de poisson-zèbre immunocompétent. Cette procédure permet d’étudier à long terme l’invasion et le comportement des cellules tumorales.

Transplantation orthotopique à long terme de cellules tumorales dans des embryons de poisson-zèbre : une méthode efficace pour délivrer des cellules tumorales dans le quatrième ventricule d’embryons de poisson-zèbre pour l’analyse à long terme du comportement des cellules tumorales

La transplantation de cellules cancéreuses est un outil important pour l'identification des mécanismes du cancer et des réponses thérapeutiques. Les techniques actuelles dépendent des animaux immunitaire incompétents. Ici, nous décrivons une méthode pour transplanter des cellules tumorales de poissons zèbres en embryons immunologiquement compétents pour l'analyse à long terme du comportement des cellules tumorales et des réponses aux médicaments in vivo .

Transplantation de tumeurs cérébrales pédiatriques de poisson zèbre dans des hôtes immunisés pour une étude à long terme du comportement des cellules tumorales et de la réponse aux médicaments

Le but de cette méthode est de générer un modèle in vivo de l'angiogenèse tumorale en xénogreffer les cellules tumorales mammifères dans un embryon de poisson zèbre qui a des vaisseaux sanguins fluorescents étiquetés. En imagerie du xénogreffe et des vaisseaux associés, une mesure quantitative de la réponse angiogénique peut être obtenue.

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts In Vivo

Les modèles de xénogreffe de poisson zèbre permettent le dépistage des médicaments à haut débit et l’imagerie fluorescente des cellules cancéreuses humaines dans un microenvironnement in vivo. Nous avons mis au point un flux de travail pour le dépistage automatisé à grande échelle des médicaments sur des échantillons de leucémie dérivés du patient chez le poisson zèbre à l’aide d’une unité d’imagerie automatisée équipée d’un microscope à fluorescence.

Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre

Ici, nous fournissons un protocole étape par étape, avec des conseils pour générer des xénogreffes et des directives pour l’analyse du comportement tumoral, l’immunofluorescence de montage entier et la quantification de l’imagerie confocale.

Génération de xénogreffes larvaires de poisson zèbre et analyse du comportement tumoral

Les manipulations embryologiques telles que la disparition et la transplantation de cellules sont des outils importants pour étudier le développement précoce. Ce protocole décrit un dispositif de transplantation simple et efficace pour effectuer ces manipulations chez des embryons de poisson zèbre.

Un dispositif de transplantation simple et efficace pour les embryons de poisson zèbre

Les modèles précliniques visent à faire progresser les connaissances sur la biologie du cancer et à prédire l’efficacité des traitements. Cet article décrit la génération de xénogreffes dérivées de patients (zPDX) à base de poisson zèbre avec des fragments de tissu tumoral. Les zPDX ont été traités par chimiothérapie, dont l’effet thérapeutique a été évalué en termes d’apoptose cellulaire du tissu transplanté.

Mise en place de xénogreffes de poisson zèbre provenant de patients atteints d’un cancer du pancréas pour des tests de chimiosensibilité

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour l’implantation automatisée de xénogreffes tumorales dans des larves de poisson-zèbre à l’aide d’un système d’injection robotisé de pointe. De plus, nous présentons des vidéos d’injection et des données de validation démontrant les performances réussies du système.

Automatisation de l’implantation tumorale chez les larves de poisson-zèbre pour la recherche et la médecine du cancer

Découvrez une méthode rapide de xénotransplantation tumorale dans les embryons de poisson-zèbre transparent. Cette technique utilise la cytométrie en flux pour évaluer la progression tumorale et la charge pathologique en oncologie.

Une méthode simple, rapide et efficace pour l’analyse de la xénotransplantation tumorale dans les embryons de poisson-zèbre transparent (Vidéo) | JoVE Journal

Une méthode simple, rapide et efficace pour l’analyse de la xénotransplantation tumorale dans les embryons de poisson-zèbre transparent

Explorer plus de vidéos