Name: Test de biomarqueur urinaire synthétique multianalyte médié par CRISPR-Cas pour les diagnostics portables (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 33 s
Description: Découvrez un test de biomarqueurs urinaires synthétiques multianalytes médié par CRISPR-Cas pour le diagnostic du cancer au point de soins. Cette méthode améliore la sensibilité de détection grâce à des outils moléculaires ingénierisés.

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Cette étude a été financée en partie par une subvention de soutien de l’Institut Koch P30-CA14051 de l’Institut national du cancer (Swanson Biotechnology Center), une subvention du centre de base P30-ES002109 de l’Institut national des sciences de la santé environnementale, le Marble Center for Cancer Nanomedicine de l’Institut Koch, le programme de recherche exploratoire de l’Institut Koch via le Kathy and Curt Marble Cancer Research Fund, et le Fonds de Virginie et D. K. Ludwig pour la recherche sur le cancer. L’A.E.V.H. est soutenue par une bourse de formation prédoctorale (T32GM130546) financée par les NIH. S.N.B. est un chercheur de l’Institut médical Howard Hughes. L.H. est soutenu par un prix K99/R00 Pathway to Independence du National Cancer Institute et le financement de démarrage de l’Université de Boston.

Toutes les études sur les animaux sont approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’établissement des auteurs. Des installations standard de soins aux animaux, y compris des chambres d’hébergement, des cagoules stériles, une anesthésie et une euthanasie éthique, sont nécessaires pour mener à bien ces expériences. Toutes les expériences sont menées conformément aux directives institutionnelles et nationales et supervisées par le personnel vétérinaire de l’établissement. Les souris femelles BALB/c, utilisées pour les expériences, proviennent d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux) et étaient âgées de 6 à 8 semaines au début de l’étude. Les séquences de l’ADN synthétisé sur mesure, de l’ARNcr, des sondes de substrat peptidique à base de FRET et des peptides capteurs sont fournies dans le tableau supplémentaire 1.
1. Sélection du substrat peptidique activé par la protéase
<ol><li>Collecter et préparer des échantillons de tissus pulmonaires sains ou de tissus pulmonaires avec des nodules tumoraux conformément à un rapport publié précédemment13.<ol><li>Homogénéiser les tissus dans une solution saline tamponnée au phosphate pré-refroidie (PBS, pH 7,4) (200 mg de tissu/mL de PBS) avec des tubes de dissociation tissulaire pour la dissociation automatisée des tissus en suspensions unicellulaires.</li>
		<li>Centrifuger les tissus s’homogénent à 6 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Conservez le surnageant dans un nouveau tube.</li>
		<li>Centrifuger le surnageant à 14 000 x g pendant 25 min à 4 °C.</li>
		<li>Mesurez la concentration en protéines à l’aide d’un kit de dosage de protéines d’acide bicinchoninique (BCA) (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Ajouter du PBS à l’échantillon pour préparer une solution à 0,33 mg/mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Évaluez l’activité protéolytique en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Dans une plaque de 384 puits, ajoutez des sondes de substrat peptidique à base de FRET de 5 μL et 6 μM à chaque puits. Pour chaque sonde, effectuez la réaction en trois exemplaires. REMARQUE : La sonde de substrat peptidique à base de FRET contient une courte séquence peptidique (6 à 8 acides aminés, conçue pour être spécifique à une protéase cible ou à un groupe de protéases) terminée par une paire fluorophore et trempante. Deux sondes FRET sont décrites dans le tableau supplémentaire 1 à titre d’exemple. La bibliothèque complète des sondes peut être trouvée dans Hao et al.13.</li>
		<li>Centrifuger la plaque du puits pendant 10 s à température ambiante à 180 x g pour s’assurer que les sondes sont au fond de la plaque.</li>
		<li>Ajouter 25 μL 0,33 mg/mL d’échantillon de tissu ou 40 μM de protéaserecombinante 13 dans chaque puits. REMARQUE : La concentration finale de l’échantillon de tissu ou de la protéase recombinante peut devoir être optimisée en fonction de leur activité protéolytique intrinsèque. Par exemple, les tissus hautement protéolytiques tels que les intestins peuvent nécessiter des facteurs de dilution plus élevés pour permettre la surveillance du clivage enzymatique initial.</li>
		<li>Centrifuger brièvement la plaque à 180 x g (à température ambiante) pour mélanger les sondes et les lysats tissulaires.</li>
		<li>Commencez immédiatement à détecter le clivage de la sonde en mesurant la fluorescence avec le lecteur de plaques à 37 °C toutes les 2 min pendant 1 h (λex : 485 nm ; λem : 535 nm) pour surveiller le clivage. REMARQUE : Utilisez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées pour des paires de fluorophores et de trempe spécifiques. Dans le cas de cette étude, des paramètres (λex : 485 nm et λem : 535 nm) sont définis pour le fluorophore FAM.</li>
		<li>Pour analyser les données de mesure fluorescentes, utilisez le package Python (voir Tableau des matériaux) pour l’analyse cinétique enzymatique disponible à https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Ce script calcule la vitesse de réaction initiale (V0) en utilisant la pente de l’ajustement linéaire des 8 à 10 premiers points temporels initiaux.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Formulation et caractérisation des capteurs
<ol><li>Synthétiser le conjugué de l’ADN et du peptide activé par la protéase (PAP).<ol><li>Incuber des rapporteurs d’ADN phosphorothioés de 20 mères avec un groupe 3'-DBCO (1,1 eq., voir le tableau des matériaux) avec des PAP terminés par des azides avec une extrémité C-terminale de cystéine dans un tampon phosphate de 100 mM (pH 7,0) à température ambiante pendant >4 h. Si vous laissez cuire toute la nuit, incubez à 4 °C.</li>
		<li>Purifier le produit sur un système de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) équipé d’une colonne idéale pour les biomolécules (voir Tableau des matériaux). Réglez le gradient HPLC pour qu’il commence à partir d’un tampon A de 5 % (0,05 % TFA dans H2O), maintenez l’isocratie pendant 20 min et atteignez un tampon B de 80 % (0,05 % TFA, 99,95 % d’acétonitrile) à 65 min avec un débit de 0,3 mL min-1, et collectez le produit conjugué avec un temps de rétention à ~31 min.</li>
		<li>Valider les conjugués purifiés par spectrométrie de masse MALDI-TOF (désorption/ionisation laser assistée par matrice) en utilisant l’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique comme matrice14 (voir le tableau des matériaux).</li>
	</ol></li>
	<li>Synthétisez les nanocapteurs basés sur l’activité codés par l’ADN.<ol><li>Dissoudre 2 mg de PEG multivalent (40 kDa, 8 bras, voir le tableau des matières) avec le groupe réactif au maléimide dans 1 mL de tampon phosphate à 100 mM (pH 7,0) et filtre (seuil : 0,2 μm).</li>
		<li>Ajouter les conjugués ADN-peptide terminés par la cystéine (2 eq., voir Tableau des matériaux) au PEG et réagir à température ambiante pendant >4 h. Si vous laissez cuire toute la nuit, incubez à 4 °C.</li>
		<li>Éliminer les matériaux non conjugués par chromatographie d’exclusion stérique avec une colonne de matrice composite dextran-agarose disponible dans le commerce sur une chromatographie liquide protéique rapide (FPLC) (voir le tableau des matériaux). Analysez des échantillons dans le PBS et surveillez l’absorbance à 260 nm pour l’ADN et à 280 nm pour le peptide.</li>
		<li>Concentrer les nanocapteurs synthétisés avec des tubes filtrants centrifuges (MWCO = 10 kDa) selon la vitesse recommandée par le fabricant (voir Tableau des matériaux).</li>
		<li>Quantifier la concentration d’ADN à l’aide d’un kit de dosage de l’ADNsb (voir le tableau des matériaux) et d’un lecteur de plaques à λex : 485 nm et λem : 535 nm. Stockez les nanocapteurs à 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Caractériser les nanocapteurs basés sur l’activité codés par l’ADN.<ol><li>Mesurez la taille hydrodynamique des particules de nanocapteurs codés par l’ADN par diffusion dynamique de la lumière (DLS). REMARQUE : La gamme de taille attendue des nanocapteurs est de 15 à 50 nm, avec une taille moyenne de 20 à 30 nm. Si une gamme de tailles limitée est souhaitée, la FPLC (à l’étape 2.3) peut être utilisée pour isoler des fractions plus étroites avec des poids moléculaires différents.</li>
		<li>Concentrer les nanocapteurs à 0,5 mg/mL (par concentration d’ADN) avec des tubes filtrants centrifuges (MWCO = 10 kDa) et charger les échantillons sur une grille de cuivre recouverte d’un film de carbone montée sur un cryosupport. Observez la morphologie à l’aide de la microscopie électronique à transmission cryogénique (200 kV, grossissement de 10 000 à 60 000)14.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Injection par capteur et collecte d’urine
<ol><li>Prélevez l’urine pour la mesure de base.<ol><li>Placez la souris dans une chambre de boîtier personnalisée (voir Figure supplémentaire 1) avec une plaque à 96 puits comme base.</li>
		<li>Retenez la souris et appliquez une légère pression sur la vessie pour évacuer l’urine restante sur la plaque.</li>
		<li>Pipeter l’urine recueillie (~100-200 μL) de la plaque à 96 puits dans un tube de 1,5 mL après avoir placé la souris dans le boîtier normal.</li>
	</ol></li>
	<li>Établir un modèle préclinique de tumeur murine.<ol><li>Inoculer des souris femelles BALB/c âgées de 6 à 8 semaines par injection intraveineuse avec une lignée cellulaire MC26-Fluc exprimant la luciférase (100k cellules/souris) (voir le tableau des matières). Surveiller la progression tumorale chaque semaine à l’aide d’un système d’imagerie par fluorescence in vivo . REMARQUE : La charge tumorale visible indiquée par un signal luminescent se produit environ à la semaine 2 de l’injection de cette lignée cellulaire particulière. Vérifiez soigneusement et régulièrement les animaux porteurs de tumeurs pendant la progression de la tumeur.</li>
	</ol></li>
	<li>Injecter des nanocapteurs à différents moments après l’implantation de la tumeur.<ol><li>Préparer une solution injectable (volume maximum de 200 μL) contenant des nanocapteurs à une concentration de 1 nmol par code-barres ADN dans du PBS stérile.</li>
		<li>Injecter 200 μL de solution de capteur dans du PBS dans chaque souris expérimentale par voie intraveineuse.</li>
	</ol></li>
	<li>Prélevez des échantillons d’urine de souris témoins et tumorales saines 1 h après l’injection du capteur, comme décrit aux étapes 1.1 à 1.3. REMARQUE : Les échantillons d’urine frais peuvent être traités directement pour l’analyse des codes-barres ADN ou congelés immédiatement sur de la glace.</li>
</ol>4. Détection CRISPR des codes-barres ADN : basée sur la fluorescence
<ol><li>Utilisez des échantillons d’urine fraîche ou décongelez des échantillons congelés sur de la glace. Centrifuger des échantillons d’urine à 800 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Combinez les réactifs du tableau supplémentaire 2, ajoutez l’enzyme Cas12a (voir tableau des matériaux) en dernier et mélangez doucement la réaction en pipetant de haut en bas. Incuber la réaction à 37 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Exécutez la réaction rapporteure, comme indiqué dans le tableau supplémentaire 3, en trois exemplaires en utilisant le produit de l’étape 2. Ajoutez la réaction de l’étape 2 en dernier et amenez-la rapidement au lecteur de plaques.</li>
	<li>Détecter l’activation de LbaCas12a en mesurant la fluorescence avec un lecteur de plaques à 37 °C toutes les 2 min pendant 3 h (λex : 485 nm et λem : 535 nm) pour surveiller la cinétique de clivage du rapporteur d’ADN.</li>
	<li>Pour analyser les données de mesure fluorescentes, utilisez le package Python pour l’analyse cinétique enzymatique disponible à https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Ce script calcule la vitesse de réaction initiale (V0) en utilisant la pente de l’ajustement linéaire des 8 à 10 premiers points temporels initiaux.</li>
</ol>5. Détection CRISPR des codes-barres ADN : sur papier
<ol><li>Centrifuger des échantillons d’urine à 800 x g pendant 5 min à température ambiante. REMARQUE : Analysez les échantillons d’urine pour la détection CRISPR par fluorescence et sur papier en parallèle.</li>
	<li>Combinez les réactifs dans le tableau supplémentaire 2. Incuber à 37 °C pendant 30 min. REMARQUE : Cette étape d’incubation est identique à celle de la détection CRISPR par fluorescence.</li>
	<li>Exécutez la réaction de rapporteur à l’aide d’un rapporteur d’ADN marqué à la biotine FAM pour le test de flux latéral sur une bandelette de papier (voir Tableau des matériaux). Combiner les réactifs du tableau supplémentaire 4 dans une plaque à 96 puits en utilisant le produit de l’étape 2. Couvrir de papier aluminium et incuber à 37 °C pendant 1 h. REMARQUE : Sélectionnez le temps d’incubation optimal en fonction de la surveillance cinétique en temps réel dans le test de détection CRISPR basé sur la fluorescence décrit ci-dessus.</li>
	<li>Dans un puits frais d’une plaque de 96 puits, ajoutez 80 μL de PBS. Ajoutez 20 μL d’échantillon de l’étape 3 dans ce puits.</li>
	<li>Placer une bande de papier à flux latéral dans chaque puits et attendre que le liquide atteigne le haut de la bande (<5 min). Recherchez l’apparence de la ou des bandes de contrôle et/ou d’échantillon sur la bande de papier.</li>
	<li>Prenez une photo de la bande d’écoulement latéral et quantifiez l’intensité de la bande à l’aide d’ImageJ.</li>
</ol>

CRISPR-CAS Test de biomarqueurs urinaires synthétiques pour le diagnostic du cancer

<ol><li>Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+diagnostics%3A+an+emerging+paradigm+for+disease+detection+and+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring.</a> Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).</li>
<li>Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+diagnostics%3A+recent+advances+in+the+development+of+probes+for+use+with+diverse+detection+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-based diagnostics: recent advances in the development of probes for use with diverse detection modalities.</a> ACS Chem Biol. 17 (2), 281-291 (2022).</li>
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<li>Dudani, J. S., Warren, A. D., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+protease+activity+to+improve+cancer+care%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Canc+Biol%22%5BJournal%5D)">Harnessing protease activity to improve cancer care.</a> Annu Rev Canc Biol. 2, 353-376 (2018).</li>
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<li>Kwong, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-encoded+synthetic+biomarkers+for+multiplexed+urinary+monitoring+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 63-70 (2013).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li>
<li>Choi, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+clearance+of+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Renal clearance of quantum dots.</a> Nat Biotechnol. 25 (10), 1165-1170 (2007).</li>
<li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas-amplified+urinary+biomarkers+for+multiplexed+and+portable+cancer+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics.</a> Nat Nanotechnol. 18 (7), 798-807 (2023).</li>
<li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-triggered+multimodal+precision+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-triggered multimodal precision diagnostics.</a> Nat Mater. 20 (10), 1440-1448 (2021).</li>
<li>Ghanta, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27-Modifications+improve+potency+and+efficacy+of+DNA+donors+for+precision+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">5'-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing.</a> Elife. 10, e72216(2021).</li>
<li>Bekkevold, C. M., Robertson, K. L., Reinhard, M. K., Battles, A. H., Rowland, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dehydration+parameters+and+standards+for+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Dehydration parameters and standards for laboratory mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (3), 233-239 (2013).</li>
</ol>

S.N.B., L.H. et R.T.Z. sont inscrits comme inventeurs sur une demande de brevet liée au contenu de cet ouvrage. S.N.B. détient des actions dans Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio, et est administrateur chez Vertex ; est consultant pour Moderna et reçoit des fonds de recherche parrainés par Johnson & Johnson, Revitope et Owlstone.

Voici une plateforme hautement personnalisable pour la détection multiplexée du cancer avec un test d’urine portable qui évalue l’activité protéolytique associée à la maladie à l’aide d’un capteur injecté mini-invasif. Lorsqu’il est activé par les protéases tumorales, le clivage du substrat peptidique est amplifié par la libération d’un code-barres d’ADN dans l’urine. Les rapporteurs d’ADN synthétique dans un échantillon d’urine peuvent être lus par une amplification enzymatique secondaire médiée par CRISPR-Cas,...

Malgré les efforts importants déployés pour identifier les biomarqueurs tumoraux tels que les protéines excrétées et l’ADN, le domaine du diagnostic du cancer a été mis à rude épreuve par leur faible abondance ou leur dégradation rapide dans la circulation1. En tant que stratégie complémentaire, les biomarqueurs synthétiques issus de la bio-ingénierie qui répondent sélectivement aux caractéristiques de la maladie pour générer des signaux amplifiés représentent de nouvelles voies vers des diagnostics précis et accessibles 2,3. Pour faciliter la détection, ces biomarqueurs synthétiques exploitent les mécanismes d’activation dépendants de la tumeur tels que l’amplification enzymatique pour produire des analytes avec un rapport signal/bruit amélioré4. Ici, une classe d’enzymes associées au cancer, les protéases, est exploitée pour activer des capteurs injectables à l’échelle nanométrique afin de libérer des rapporteurs de maladies détectables à partir des biofluides tels que le sang ou l’urine 5,6. Compte tenu de l’hétérogénéité tumorale, le développement d’un panel de capteurs activés par la protéase permet d’effectuer des tests multianalytes qui combinent différents événements de clivage de la protéase en une « signature de la maladie » pour évaluer l’incidence et la progression du cancer d’une manière plus spécifique et multiplexée.
Des biomarqueurs synthétiques activés par la protéase ont été développés qui comprennent des substrats peptidiques conjugués à la surface d’un support inerte7. Lorsqu’ils sont injectés in vivo, ces peptides sont transportés vers la tumeur, après quoi le clivage enzymatique par les protéases tumorales libère des rapporteurs dans le sang ou l’urine pour détection. La détection multiplexée avec des biomarqueurs synthétiques activés par la protéase nécessite que chaque biomarqueur synthétique d’un cocktail soit marqué avec un code-barres moléculaire unique. À cette fin, diverses approches ont été développées, notamment des codes-barres de masse et des rapporteurs codés par ligands 8,9,10. Contrairement à ces méthodes de multiplexage qui peuvent être limitées à quelques possibilités de signaux différentes, le codage à barres de l’ADN offre beaucoup plus de combinaisons en fonction de la grande complexité et de l’hétérogénéité des états pathologiques humains. Pour étendre la multiplexité des biomarqueurs synthétiques, les capteurs sont codés à barres en étiquetant chaque rapporteur avec une séquence d’ADN unique pour la détection via la nucléase CRISPR-Cas afin d’amplifier le signal biofluidique ex vivo. Ces codes-barres d’ADN simple brin (ADNss) sont conçus pour se lier à des ARN guides CRISPR complémentaires (ARNcr), activant l’activité des nucléases collatérales déclenchées par la cible de CRISPR-Cas12a11. Cette activité nucléase peut être utilisée pour cliver un brin d’ADN rapporteur détecté par cinétique de fluorescence ou à l’aide de bandes de papier.
En plus de l’amplification moléculaire via des protéases (in vivo) et CRISPR-Cas (ex vivo), une autre caractéristique clé de la conception des biomarqueurs synthétiques activés par la protéase consiste à exploiter la pharmacocinétique des nanomatériaux pour augmenter la concentration du signal diagnostique dans les biofluides10. Une approche consiste à utiliser un transporteur de nanoparticules pour augmenter le temps de circulation des substrats peptidiques conjugués à la surface. Un dendrimère en polyéthylène glycol (PEG) est sélectionné comme nanotransporteur avec un diamètre hydrodynamique et une multivalence relativement petits pour augmenter l’administration aux tumeurs. Bien qu’elle soit suffisamment petite pour favoriser l’administration de la tumeur, la taille du porteur de PEG est supérieure à la coupure de ~5 nm de la barrière de filtration glomérulaire rénale, de sorte que seuls les substrats peptidiques clivés peuvent être éliminés dans l’urine, en profitant de la filtration par les reins12. Dans ce protocole, le flux de travail en plusieurs étapes est décrit pour la synthèse et l’application de nanocapteurs basés sur l’activité à code-barres de l’ADN dans un modèle murin préclinique, mettant en évidence la configuration du test de biomarqueur urinaire synthétique multianalyte médié par CRISPR-Cas, qui a été utilisé par ce groupe pour classer l’état de la maladie dans des modèles murins de plusieurs types de cancer13. Grâce au principe de conception polyvalent, les trois composants fonctionnels du nanocapteur - le nanotransporteur (polymère PEG), le module sensible aux stimuli (substrat activé par la protéase) et le rapporteur biofluidique (code-barres ADN) - peuvent être interchangés avec précision en fonction des besoins spécifiques de l’application, ce qui permet une modularité en adaptant les spécificités de la cible et de la libération.

<table><tbody><tr><td>10x NEB Buffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B6002SVIAL</td><td></td></tr><tr><td>20 rapporteurs d’ADN phosphorothioé en mer avec groupe 3'-DBCO</td><td>IDT</td><td></td><td>Système</td></tr> de <tr><td>chromatographie liquide haute performance Agilent 1100 avec colonne Vydac 214TP510 C4</td><td>. Agilent</td><td></td><td>HPLC</td></tr> <tr><td>et Auml ; KTA chromatographie liquide protéique rapide (FPLC)</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)</td><td>EMD millipore</td><td></td><td>Différents volumes disponibles</td></tr><tr><td>PAP terminés par l’azoture avec cystéine C-terminale</td><td>CPC Scientific</td><td></td> CrRNA <td>peptidiques personnalisés</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>IDT</td><td></td><td>Voir le tableau supplémentaire 1</td></tr><tr><td>Microscopie électronique à transmission cryogénique</td><td>JEM-2100F</td><td>JEOL</td><td>cyroTEM</td></tr><tr><td>Conjugués ADN-peptide à terminaison cystéine</td><td>CPC Scientific</td><td></td><td>Peptide personnalisé</td></tr><tr><td>Diffusion dynamique de la lumière (DLS)</td><td></td><td></td><td>DLS</td></tr><tr><td>EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 &micro ; M</td><td>New England Biolabs</td><td>M0653T</td><td></td></tr><tr><td>Animaux d’expérimentation</td><td>Taconic Biosciences</td><td>BALB/cAnNTac</td><td>6&ndash ; 8&thinsp ; semaines d’âge</td></tr><tr><td>douxTubes MACS C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>homogénéisation tissulaire</td></tr><tr><td>HybriDetect Universal Lateral Flow Assay</td><td>Kit Miltenyi Biotec</td><td>MGHD 1</td><td></td></tr><tr><td>Désorption/ionisation laser assistée par matrice&ndash ; temps de vol (MALDI&ndash ; TOF) spectrométrie de masse&nbsp ;</td><td>Bruker</td><td></td><td>Microflex MALDI&ndash ; Lignée cellulaire TOF</td></tr><tr><td>MC26-Fluc</td><td>Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital</td>PEG multivalent (40 kDA, 8 bras) avec groupe réactif aux maléimides JenKem A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g Python, Version 3.9 https://www.python.org/ Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit et Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent Invitrogen O11492 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>kit de dosage de l’ADNss</td></tr><tr><td>ssDNA FAM-T10-Quencher et&nbsp ; FAM-T10-Substrats rapporteurs de biotine</td><td>IDT</td><td></td><td>Custom DNA</td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL colonne</td><td>GE Healthcare</td><td>GE28-9909-44</td><td>Pour FPLC</td></tr><tr><td>Tecan Infinite Pro M200 lecteur de plaques</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

test de biomarqueur urinaire synthétique multianalyte médié par crispr-cas pour les diagnostics portables

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

La création de biomarqueurs synthétiques pour le développement de diagnostics de précision a permis de détecter des maladies par des voies autres que celles utilisées pour les mesures traditionnelles des biofluides. Les biomarqueurs synthétiques utilisent généralement des rapporteurs qui fournissent des signaux lisibles dans le biofluide pour refléter les altérations biochimiques dans le microenvironnement local de la maladie au cours de l’incidence et de la progression de la maladie. La concentration pharmacocinétique des rapporteurs et l’amplification biochimique du signal de la maladie sont primordiales pour obtenir une sensibilité et une spécificité élevées dans un test diagnostique. Ici, une plateforme de diagnostic du cancer est construite à l’aide d’un format de biomarqueurs synthétiques : des nanocapteurs basés sur l’activité transportant des rapporteurs d’ADN chimiquement stabilisés qui peuvent être libérés par des signatures protéolytiques aberrantes dans le microenvironnement tumoral. L’ADN synthétique en tant que rapporteur de maladie offre une capacité de multiplexage grâce à son utilisation comme code-barres, permettant la lecture de plusieurs signatures protéolytiques à la fois. Les rapporteurs d’ADN libérés dans l’urine sont détectés à l’aide de nucléases CRISPR par hybridation avec des ARN CRISPR, qui à leur tour produisent un signal fluorescent ou colorimétrique lors de l’activation de l’enzyme. Dans ce protocole, des nanocapteurs basés sur l’activité sont construits et leur application est illustrée dans un modèle murin préclinique de cancer colorectal métastatique. Ce système est hautement modifiable en fonction de la biologie de la maladie et génère plusieurs signaux de maladie simultanément, permettant une compréhension complète des caractéristiques de la maladie grâce à un processus peu invasif ne nécessitant que l’administration de nanocapteurs, la collecte d’urine et un test papier qui permet des diagnostics sur le lieu d’intervention.

Nomination de substrats peptidiques activés par la protéase Pour concevoir des capteurs qui refléteront les changements dans l’activité protéolytique du tissu, l’activité de la protéase dans le tissu est d’abord caractérisée à l’aide d’une bibliothèque de sondes peptidiques13 (Figure 1). Des échantillons de tissus frais et congelés peuvent fournir des informations substantielles sur l’activité protéolytique du microenvironnement tumoral en combinan...

Ce protocole décrit un test de biomarqueur urinaire synthétique multianalyte médié par CRISPR-Cas qui permet de diagnostiquer le cancer au point d’intervention grâce à l’analyse ex vivo des activités protéases associées à la tumeur.

Test de biomarqueur urinaire synthétique multianalyte médié par CRISPR-Cas pour les diagnostics portables

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for ...

Le Heart Lab conçoit des outils moléculaires et cellulaires pour suivre et contrôler avec précision la biologie des maladies. Nous utilisons des informations spéciales sur les tissus malades pour éclairer la conception d’outils de détection, d’imagerie et de traitement réactifs pour les troubles hétérogènes. Les biofluides offrent une occasion pratique de détecter et d’évaluer les maladies, mais celles-ci sont souvent limitées par de faibles quantités d’analytes pertinents.Par conséquent, une grande partie du domaine poursuit des stratégies pour amplifier les signaux associés à la maladie afin d’améliorer la sensibilité des tests de diagnostic, comme le BCR et le plasma de surface sur la résonance. Plutôt que de s’appuyer sur des biomarqueurs de maladies endogènes en circulation, notre approche utilise des biomarqueurs synthétiques pour signaler l’activité de la maladie lorsqu’elle est libérée par des nanocapteurs injectés. Nos biomarqueurs synthétiques sont des codes-barres d’ADN chimiquement stabilisés, qui permettent de détecter plusieurs signaux de microenvironnement pathologique à la fois et d’identifier à l’aide du code-barres correspondant.

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La fabrication des électrochimique de l&#39;ADN des Biocapteurs pour la détection sans réactif d&#39;acides nucléiques, protéines et petites molécules

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Test de biomarqueur urinaire synthétique multianalyte médié par CRISPR-Cas pour les diagnostics portables

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