Name: Fabrication de grilles d’affinité de streptavidine pour la préparation d’échantillons de cryo-microscopie électronique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: Découvrez la fabrication de grilles d'affinité de streptavidine pour la cryo-microscopie électronique. Cette méthode stabilise les échantillons biotinylés et réduit la dénaturation protéique.

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T.C. a été soutenu par la subvention de formation en biophysique moléculaire GM-08295 du National Institute of General Medical Sciences et la bourse de recherche de la National Science Foundation sous le numéro de subvention DGE 2146752. R.G. et B.H. ont été soutenus par la subvention R21-GM135666 de l’Institut national de la santé accordée à R.G. et B.H. Ce travail a été partiellement financé par la subvention R35-GM127018 du National Institute of General Medical Sciences accordée à E.N. E.N. est un chercheur de l’Institut médical Howard Hughes.

Fabrication de grilles d’affinité de streptavidine pour les études structurales Cryo-EM

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<li>Han, B. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+shelf-life+streptavidin+support-films+suitable+for+electron+microscopy+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules.</a> Journal of Structural Biology. 195 (2), 238-244 (2016).</li>
<li>Han, B. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+biotinylated+protein+complexes+bound+to+streptavidin+monolayer+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals.</a> Journal of Structural Biology. 180 (1), 249-253 (2012).</li>
<li>Domínguez-Martín, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+a+phycobilisome+in+light-harvesting+and+photoprotected+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states.</a> Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).</li>
<li>Kasinath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JARID2+and+AEBP2+regulate+PRC2+in+the+presence+of+H2AK119ub1+and+other+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications.</a> Science. 371 (6527), eabc3393(2021).</li>
<li>Lahiri, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3.1+structure+of+yeast+RNA+polymerase+II+elongation+complex+stalled+at+a+cyclobutane+pyrimidine+dimer+lesion+solved+using+streptavidin+affinity+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids.</a> Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).</li>
<li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+carbon+films+with+%7E+500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li>
<li>Levine, M. J., Schwarz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+guidelines+for+producing+molecular+assemblies+by+Langmuir-Blodgett+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Education%22%5BJournal%5D)">Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques.</a> Journal of Chemical Education. 65 (7), 638(1988).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li>
</ol>

Notre protocole décrit comment fabriquer et utiliser des grilles d’affinité de streptavidine et comment traiter les données contenant le signal de diffraction de la streptavidine. Plusieurs étapes critiques du protocole nécessitent une attention particulière.
Les lots de grille infructueux peuvent être attribués à plusieurs erreurs courantes. La source d’erreur la plus courante provient de l’utilisation de réactifs obsolètes ou de mauvaise qualité. Il est particulièrement important de préparer la solution lipidique biotinylée exactement comme décrit dans le protocole. De plus, toute impureté, telle que les résidus de détergent sur le matériel de laboratoire ou les huiles naturellement présentes sur la peau, peut affecter la qualité des cristaux de streptavidine et, par conséquent, la qualité des images résultantes. Il est donc recommandé d’effectuer trois cycles de lavage des grilles avant la première évaporation du carbone afin d’éliminer toute contamination éventuelle par le fabricant de la grille (étape 2.1). De plus, la contamination ou l’impureté de l’huile de ricin a été observée pour entraver la formation de cristaux sur la grille.
La fabrication et le ramassage de la monocouche lipidique est une tâche qui doit être pratiquée plusieurs fois pour avoir une idée des petits volumes lipidiques. Il n’est pas rare que cette étape échoue les deux ou trois premières fois avant qu’une monocouche lipidique adéquate puisse être produite, comme en témoigne la qualité des cristaux de streptavidine que l’on observe dans les grilles colorées négativement (Figure 4C).
Il est important de ne jamais laisser l’arrière (côté or, côté lipidique) de la grille se mouiller pendant le processus de fabrication de la grille (étapes 3.12-3.20). Dans le cas où l’arrière est mouillé, il est recommandé de jeter la grille. Cela peut entraîner l’apparition de grandes vésicules lipidiques qui perturbent la qualité de l’image (Figure 5D) (ligne 3, tableau 1). Des vésicules lipidiques peuvent également être observées en raison d’un lavage insuffisant après l’application de la monocouche lipidique (étape 3.13). Trois lavages ultérieurs à l’aide d’un tampon de cristallisation sont recommandés après avoir touché la monocouche lipidique avant d’ajouter de la streptavidine.
Après qu’une fine couche de carbone ait été évaporée sur des grilles intégrées au tréhalose, l’arrière de la grille peut être mouillé sans endommager la qualité du treillis. Par exemple, le mouillage de l’arrière est fréquemment observé lorsque le tampon d’échantillon contient des quantités même minimes de détergent. Le mouillage de la face arrière par l’échantillon peut entraîner une liaison non spécifique des échantillons à la fine pellicule de carbone à l’arrière, ce qui diminue l’efficacité de la prévention de la diffusion des particules à l’interface air-eau ou l’utilisation de la liaison d’affinité pour les stratégies de purification sur la grille. Si possible, ajoutez l’échantillon à la grille en l’absence de détergent. Le détergent et d’autres additifs peuvent être ajoutés ultérieurement lors des étapes de lavage de la grille ou ajoutés dans une dernière étape avant la vitrification. C’est l’une des limites à l’utilisation des grilles d’affinité de la streptavidine ; Cependant, si l’objectif est d’améliorer l’orientation préférentielle, la préparation des échantillons avec des tampons, y compris des détergents, a été effectuée avec succès11.
Une source d’erreur commune peut être attribuée à l’âge des grilles par rapport aux deux étapes d’évaporation du carbone (étape 2.3 et étape 3.21). Dans ce protocole, la période d’attente recommandée est de 5 à 7 jours après l’évaporation du carbone avant d’utiliser des grilles de streptavidine pour la cryo-EM. Lorsque les grilles sont utilisées trop tôt après la fabrication, on a observé que le réseau et la monocouche lipidique se mobilisent hors des trous de la grille. Une observation similaire peut être faite lorsque les grilles sont trop vieilles et utilisées après six mois (figure 5A) (ligne 1, tableau 1). Nous émettons l’hypothèse que cette observation s’explique par des changements dans l’hydrophobicité du support de carbone appliqué pour stabiliser la monocouche lipidique et les cristaux de streptavidine. De plus, les réseaux de streptavidine peuvent apparaître en mosaïque (figure 5B) (ligne 3, tableau 1) et brisés à la fois en coloration négative et en cryo-EM si la monocouche est appliquée sur des grilles où la première couche d’évaporation du carbone (étape 2.3) n’a pas suffisamment vieilli.
Une autre source d’erreur commune peut être attribuée à la fragilité de la monocouche cristalline de streptavidine (la monocouche lipidique est elle-même fluide et peut se dilater ou se comprimer de manière réversible). L’évaporation du carbone à l’arrière (étape 3.21) assure une stabilité critique à la fois à la monocouche et au réseau de streptavidine pendant le processus d’adsorption, de lavage et de cryo-transfert EM de l’échantillon. En l’absence d’une évaporation suffisante du carbone vers l’arrière de la grille, les réseaux de streptavidine apparaîtront souvent fragmentés après le transfert ou la congélation (figure 5C) (ligne 2, tableau 1). Dans ce protocole, nous suggérons l’utilisation d’un congélateur plongeant automatisé unilatéral pour le transfert unilatéral. Cette méthode permet d’obtenir des conditions de transfert hautement reproductibles qui préservent le réseau de streptavidine pendant le processus de congélation et permettent une optimisation rationalisée de l’application de l’échantillon et des paramètres de transfert. D’autres appareils de congélation en plongée automatisés ont également été utilisés en combinaison avec le transfert manuel. Pour ce faire, la fonction de buvard proprement dite est désactivée dans les paramètres de l’appareil, et la grille est effacée à la place en atteignant une pince à épiler tenant du papier buvard par l’entrée latérale. Cette méthode permet d’obtenir des résultats de haute qualité pour les laboratoires sans dispositif de transfert et de congélation en plongée d’un seul côté ; cependant, la reproductibilité d’une grille à l’autre est difficile.
Bien que l’utilisation de grilles d’affinité pour la streptavidine présente de nombreux avantages, certaines limites de cette méthode doivent être prises en considération. En raison de la nature de la procédure, il n’est généralement pas possible d’évaluer la qualité du réseau de streptavidine avant que l’ensemble du processus ne soit terminé. Il est suggéré de vérifier rapidement la qualité de chaque lot par coloration négative avant de congeler les échantillons. En raison du signal transmis par le réseau de streptavidine aux images brutes, il peut être difficile dans certains cas d’évaluer, à partir des images seules, s’il y a un nombre suffisant de particules intactes et dispersées. Pour la même raison, le traitement à la volée des données cryo-EM pendant l’acquisition des données n’est pas possible à moins que la procédure de soustraction du signal streptavidine n’ait été incluse dans le pipeline de prétraitement des données. Étant donné que le signal de la streptavidine est généralement soustrait des images corrigées en mouvement et non des images elles-mêmes, le polissage bayésien, tel qu’il est mis en œuvre dans les suites logicielles populaires, peut échouer lors de l’utilisation des procédures de soustraction décrites ci-dessus. Il est donc recommandé d’effectuer une correction de mouvement dans plusieurs patchs pour minimiser le mouvement des particules dès le début du traitement des données16.
Malgré ces limitations, les grilles d’affinité de la streptavidine offrent de nombreux avantages. Les grilles d’affinité de la streptavidine offrent deux avantages majeurs par rapport aux grilles cryo-EM à trou ouvert standard sont un moyen de protéger les échantillons de l’interface air-eau et de concentrer les échantillons de faible abondance (10-100 nM) sur la grille. D’autres couches de support, telles que le carbone et l’oxyde de graphène, peuvent également être utilisées comme stratégies pour surmonter ces goulots d’étranglement dans la préparation des échantillons. Dans un exemple, les grilles d’affinité de la streptavidine étaient la seule solution pour obtenir une reconstruction intacte d’une interaction protéine-acide nucléique incompatible avec les approches de réticulation. 12
Un autre avantage majeur des grilles d’affinité de la streptavidine est une solution pour les échantillons qui s’adsorbent sur d’autres couches de support, telles que l’oxyde de carbone ou de graphène, avec des orientations préférées qui entravent la capacité d’obtenir une reconstruction 3D de l’échantillon d’intérêt. La biotinylation aléatoire d’échantillons à l’aide de kits disponibles dans le commerce permet de fixer de manière aléatoire l’échantillon d’intérêt à la monocouche de streptavidine afin d’obtenir plus de vues potentielles pour surmonter ce défi.
De plus, les grilles d’affinité de la streptavidine offrent des avantages uniques aux grilles d’affinité. La haute affinité et la spécificité de l’interaction streptavidine-biotine permettent le couplage des grilles d’affinité streptavidine avec d’autres flux de travail impliquant la biotine pour purifier les complexes d’intérêt. Dans un exemple publié, les auteurs ont immobilisé un complexe sur des grilles d’affinité streptavidine et ont incubé un partenaire de liaison de stœchiométrie inconnue en grand excès. Après avoir lavé toute protéine non liée, le super-complexe correctement assemblé a été obtenu et a pu être immédiatement analysé avec la cryo-EM11. Une application future possible pourrait être de combiner des marqueurs de protéines de liaison à la streptavidine, le système Avi-tag ou des approches de marquage de proximité avec des grilles d’affinité de streptavidine pour extraire des protéines uniques et/ou des complexes protéiques directement à partir de sources recombinantes ou endogènes sans schémas de purification élaborés standard.
En fournissant ce protocole, les laboratoires devraient être en mesure de reproduire facilement la fabrication de grilles d’affinité de streptavidine et de les établir comme un outil plus couramment utilisé pour l’analyse structurale des complexes protéiques par cryo-EM.

La cryomicroscopie électronique (cryo-EM) a révolutionné le domaine de la biologie structurale en permettant la détermination de la structure macromoléculaire d’échantillons volumineux, flexibles et hétérogènes qui étaient auparavant inaccessibles par cristallographie aux rayons X ou par résonance magnétique nucléaire1. Cette méthode consiste à congeler rapidement des macromolécules en solution pour créer une fine couche de glace vitreuse qui peut ensuite être imagée à l’aide d’un microscope électronique. Ces dernières années, des progrès significatifs dans le matériel de microscope et les logiciels de traitement d’images ont encore élargi les types d’échantillons adaptés à la détermination de la structure à haute résolution par cryo-EM.
Néanmoins, la préparation d’échantillons minces et vitrifiés reste l’une des étapes les plus critiques de la détermination de la structure macromoléculaire par cryo-EM. Les échantillons biologiques sont souvent dynamiques, fragiles, sujets à la dénaturation, et ne sont parfois disponibles qu’en petites quantités pour les études cryo-EM. Au cours du processus de transfert, ces particules interagissent avec l’interface air-eau hydrophobe, ce qui peut entraîner des orientations préférées des particules, le désassemblage de complexes fragiles, la dénaturation partielle ou complète de l’échantillon et l’agrégation 2,3,4. L’utilisation de détergents ou d’autres tensioactifs, la réticulation chimique et l’adsorption d’échantillons sur les couches de support sont des stratégies courantes pour préserver les échantillons biologiques pendant le processus de congélation. Les couches de support telles que l’oxyde de graphène 5,6,7 ou le carbone8 amorphe ont également pour fonction de concentrer les particules sur la grille par adsorption lorsque l’échantillon est disponible en quantités limitées. Cependant, ces méthodes ne sont ni générales ni fiables, et l’optimisation de la préparation du réseau peut prendre beaucoup de temps ou échouer complètement.
Les grilles d’affinité de la streptavidine 9,10 ont été développées pour surmonter ces lacunes et fournir une méthode douce et généralement applicable pour séquestrer le complexe d’intérêt et le protéger de l’interface air-eau. Ces grilles utilisent un réseau cristallin de streptavidine bidimensionnel (2D) cultivé sur une monocouche de lipides biotinylés sur la grille. Une fois que les échantillons sont eux-mêmes biotinylés (souvent de manière clairsemée et aléatoire, c’est-à-dire une biotine par complexe en moyenne), ils peuvent être appliqués sur la grille recouverte de streptavidine. Comme l’adsorption de l’échantillon repose sur l’affinité extrêmement élevée entre la streptavidine et la biotine, des concentrations d’échantillon aussi faibles que 10 nM peuvent être utilisées avec ces grilles. Les trousses de biotinylation disponibles dans le commerce pour les protéines et les amorces biotinylées pour les complexes contenant de l’ADN permettent de fixer relativement facilement les fractions de biotine nécessaires à la plupart des échantillons d’intérêt. En plus de concentrer l’échantillon et de le tenir à l’écart de l’interface air-eau dommageable pendant le transfert, la biotinylation aléatoire d’un ou de quelques résidus de lysine peut améliorer considérablement la gamme d’orientations de la molécule d’intérêt sur la grille cryo-EM, comme l’ont démontré un certain nombre d’études11. Alors que le signal du cristal de streptavidine sous-jacent est présent dans les images brutes, les schémas de traitement des données impliquant la filtration de Fourier des réflexions de Bragg nettes du cristal peuvent être facilement supprimés lors du traitement précoce des données, permettant finalement des reconstructions à haute résolution de l’échantillon d’intérêt 11,12,13 . Ici, un protocole optimisé, étape par étape, est fourni pour la production robuste de grilles d’affinité de streptavidine et son utilisation ultérieure dans des expériences de cryo-EM. Le protocole fourni devrait être complété sur une période de 2 semaines (figure 1A). Les premières parties du protocole décrivent la préparation des réactifs, le prétraitement des grilles et les premières étapes d’évaporation du carbone. Ensuite, des instructions sont décrites pour la préparation de la monocouche lipidique et la croissance des cristaux de streptavidine sur les grilles EM. De plus, des instructions sont fournies pour l’utilisation des grilles d’affinité de la streptavidine dans les expériences EM et cryo-EM de coloration négative. Enfin, des procédures sont fournies pour éliminer le signal de la streptavidine des micrographies une fois les données cryo-EM acquises.

<table><tbody><tr><td>sel de sodium de 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-(biotinyle)&nbsp ;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870285P</td><td>Se présente sous forme de poudre. Dissoudre à une concentration de 1&ndash ; 10 mg/mL dans un solvant chloroforme/méthanol/eau, 65:35:8 V/v et stocker dans des aliquotes à usage unique à -80 &deg ; Éthanol pur à</td></tr><tr><td>l’épreuve C 200 Fisher</td><td>Scientific</td><td>07-678-005</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu ; L Seringue Hamilton&nbsp ;</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>5 & micro ; L Seringue d’un microlitre modèle 75 RN, petite aiguille amovible, 26 g, 2 po, style de pointe 2</td></tr><tr><td>Huile de ricin</td><td>Sigma Adrich</td><td>259853</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire non traitées (35 mm)</td><td>Bio Basic</td><td>SP22146</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Tréhalose dihydraté, à partir d’amidon, &ge ; 99 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>DUMONT Pince à épiler anti-capillaire inversée (à fermeture automatique) Qualité biologie</td><td>Ted Pella</td><td>510-5NM</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol de qualité HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM ACE600 Coucheuse par pulvérisation cathodique sous vide poussé</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM GP2 Congélateur plongeant automatique</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil R 2/1 Au300&nbsp ;</td><td>Quantifoil</td><td>Q84994</td><td></td></tr><tr><td>Steptavidin</td><td>New England Bioscience</td><td>N7021S</td><td>Se présente sous la forme d’une solution à 1 mg/mL. Diluer à la concentration finale de 0,5 mg /mL dans un tampon de cristallisation avec une concentration finale de tréhalose de 10 %. Peut être congelé en 25&ndash ; 50 &mu ; L aliquotes Poudre de</td></tr><tr><td>talc&nbsp ;</td><td>Carolina</td><td>896060</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grade 1 papier filtre</td><td>Cytiva</td><td>1001-085</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication de grilles d’affinité de streptavidine pour la préparation d’échantillons de cryo-microscopie électronique

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Les grilles d’affinité de la streptavidine fournissent des stratégies pour surmonter de nombreux défis courants en matière de préparation des échantillons par cryo-microscopie électronique (cryo-EM), y compris la dénaturation des échantillons et les orientations préférentielles qui peuvent se produire en raison de l’interface air-eau. Les grilles d’affinité de la streptavidine, cependant, sont actuellement utilisées par quelques laboratoires de cryo-EM car elles ne sont pas disponibles dans le commerce et nécessitent un processus de fabrication minutieux. Des cristaux de streptavidine bidimensionnels sont cultivés sur une monocouche lipidique biotinylée qui est appliquée directement sur des grilles cryo-EM à trous de carbone standard. L’interaction de haute affinité entre la streptavidine et la biotine permet la liaison ultérieure d’échantillons biotinylés qui sont protégés de l’interface air-eau pendant la préparation cryo-EM des échantillons. De plus, ces grilles fournissent une stratégie pour concentrer les échantillons disponibles en quantités limitées et purifier les complexes protéiques d’intérêt directement sur les grilles. Ici, un protocole optimisé étape par étape est fourni pour la fabrication robuste de grilles d’affinité streptavidine à utiliser dans les expériences de cryo-EM et de coloration négative. De plus, un guide de dépannage est inclus pour les défis couramment rencontrés afin de rendre l’utilisation des grilles d’affinité de la streptavidine plus accessible à la communauté cryo-EM au sens large.

Après l’évaporation du carbone à l’étape 3.21 (généralement après une semaine), les grilles d’affinité de la streptavidine peuvent être utilisées pour la cryo-EM ou la préparation d’échantillons de coloration négative en suivant les procédures décrites aux étapes 4 et 5. Une micrographie représentative capturée à l’aide d’un détecteur K3 sur un titan Krios à un grossissement de 81 000X avec une taille de pixel de 1,05 Å d’un échantillon biotinylé congelé avec des grilles d’affinité de streptavidine est présentée à la figure 4A. La formation réussie du réseau est observée par le motif de grille continu qui apparaît en arrière-plan de l’image. Cela peut être plus facilement observé par le modèle de diffraction qui apparaît dans la transformée de Fourier rapide (FFT) illustrée à la figure 4A (à droite). Après la collecte des données, en suivant la procédure décrite à l’étape 6 de ce protocole, le signal qui est fourni à l’image par le réseau de streptavidine peut être masqué par calcul pour produire une micrographie soustraite (Figure 4B) qui peut être utilisée pour les étapes ultérieures de traitement des données. La FFT de la figure 4B (à droite) montre que le diagramme de diffraction observé dans la figure 4A (à droite) a été supprimé avec succès de l’image originale.
La figure 4C montre un exemple de micrographie prise sur un microscope Tecnai 12 à un grossissement de 49 000x avec une taille de pixel de 1,6 Å d’un échantillon biotinylé lié à des grilles d’affinité de streptavidine et coloré négativement à l’aide de formiate d’uranyle. Les grilles ont été préparées en suivant la procédure décrite à l’étape 4 de ce protocole, laissant une pellicule de teinture plus épaisse.
Il existe plusieurs observations courantes lorsque la procédure de fabrication de la grille de streptavidine échoue et sont décrites plus en détail dans la section de discussion et le tableau 1. Graphique 5 montre plusieurs exemples de ces observations. La figure 5A montre une micrographie d’une grille d’affinité de streptavidine colorée négativement utilisée à partir d’un lot fabriqué à partir de six mois. La monocouche s’est mobilisée à partir des trous dans la feuille de carbone des grilles quantitatives et est observée avec des dimensions similaires aux trous de la grille. La figure 5B montre un exemple de cristaux de streptavidine qui ont une mosaïque élevée et qui sont facilement perturbés pendant les procédures de préparation des échantillons. La figure 5C montre une micrographie représentative d’une grille d’affinité de la streptavidine dans laquelle l’évaporation du carbone à l’étape 3.21 est trop mince ou omise. Le réseau de streptavidine s’est fragmenté au cours du processus de préparation des échantillons cryo-EM. La figure 5D montre une grille d’affinité de streptavidine colorée négativement qui est contaminée par des vésicules lipidiques, probablement en raison de lavages insuffisants à l’étape 3.13 ou de l’humidité du côté doré de la grille aux étapes 3.13 à 3.20. Veuillez vous référer à la section de discussion et au tableau 1 pour les stratégies permettant de surmonter ces problèmes courants.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma de la procédure de fabrication de la grille d’affinité de la streptavidine. (A) Chronologie générale de la procédure de fabrication de la grille d’affinité de la streptavidine. L’ensemble de la procédure peut être effectué sur deux semaines, nécessitant deux étapes d’évaporation du carbone et une semaine après chacune pour permettre au carbone de vieillir suffisamment. (B) Zoom sur un carré d’une grille d’affinité streptavidine montrant les couches qui composent la grille après l’achèvement du processus de fabrication, y compris la grille cryo-EM standard avec des barres d’or et un film de carbone troué, la première couche de carbone évaporée, la monocouche lipidique, le cristal de streptavidine 2D et la couche de support de carbone évaporé à l’arrière. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig02.jpg"> Figure 2 : Monocouche lipidique et cristallisation de la streptavidine (A) Images montrant comment former avec succès la monocouche lipidique dans la petite boîte de Pétri en utilisant du talc pour créer une limite pour l’huile de ricin qui crée une pression de surface constante tout en formant la monocouche lipidique. (B) Images montrant comment faire pousser des cristaux de streptavidine sur des grilles cryo-EM. Tout d’abord, le côté carbone des grilles est touché à la monocouche lipidique et suivi de trois lavages consécutifs dans le tampon de cristallisation. La streptavidine est ajoutée et les grilles sont incubées dans une chambre d’humidité pendant 2 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig03.jpg"> Figure 3 : Exemples de paramètres pour le fichier process_subtraction.cfg permettant d’effectuer la soustraction du réseau de streptavidine à partir de micrographies (étape 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig04.jpg"> Figure 4 : Résultats représentatifs de la fabrication réussie de grilles d’affinité de streptavidine. (A) Micrographie cryo-EM de complexes protéines/nucléosomes biotinylés préparés avec des grilles d’affinité de streptavidine maison. La FFT est illustrée à droite et montre le motif de diffraction des cristaux de streptavidine. (B) La même micrographie que dans le panneau A est montrée en suivant la procédure de soustraction du réseau pour supprimer le signal du cristal de streptavidine 2D de l’image originale. (C) Un exemple de micrographie obtenue à partir de la coloration négative d’un échantillon biotinylé lié à des grilles d’affinité streptavidine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig05.jpg"> Figure 5 : Résultats représentatifs de l’échec de la fabrication de grilles d’affinité pour la streptavidine. (A) Micrographie montrant la mobilisation de la monocouche de streptavidine à partir des trous de la grille lorsque les grilles ont plus de six mois. (B) Micrographie montrant des réseaux de streptavidine à forte mosaïcité qui sont facilement endommagés lors des procédures de cryo-EM et de préparation d’échantillons à coloration négative. (C) Micrographie montrant la fragmentation du réseau de streptavidine pendant la préparation de l’échantillon cryo-EM lorsque la couche d’évaporation du carbone à l’étape 3.21 est trop mince ou omise. (D) Micrographie représentative contaminée par des vésicules lipidiques, probablement en raison d’un lavage insuffisant à l’étape 3.13 ou de l’humidité du côté doré de la grille aux étapes 3.13 à 3.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Guide de dépannage pour surmonter les difficultés courantes rencontrées lors de la fabrication infructueuse de grilles d’affinité pour la streptavidine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/Table%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Fichier de codage supplémentaire 1 : lsub.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/lsub.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier de codage supplémentaire 2 : process_subtration.sh <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier de codage supplémentaire 3 : process_subtraction.cfg <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction3.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier de codage supplémentaire 4 : bg_drill_hole.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_drill_hole.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier de codage supplémentaire 5 : bg_FastSubtract_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_FastSubtract_standard.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier de codage supplémentaire 6 : bg_Pick_Amp_masked_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_Pick_Amp_masked_standard.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier de codage supplémentaire 7 : bg_push_by_rot.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_push_by_rot.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier de codage supplémentaire 8 : ReadMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/ReadMRC.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier de codage supplémentaire 9 : WriteMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRC.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier de codage supplémentaire 10 : WriteMRCHeader.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRCHeader.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Un protocole étape par étape pour la fabrication de grilles d’affinité de la streptavidine est fourni pour une utilisation dans les études structurales d’échantillons macromoléculaires difficiles par cryo-microscopie électronique.

Fabrication de grilles d’affinité de streptavidine pour la préparation d’échantillons de cryo-microscopie électronique

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...

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