Quantification rapide des formes oxydées et réduites de glutathion à l’aide de l’ortho-phtalaldéhyde dans des cellules de mammifères en culture in vitro
28 juin 2024
La quantification des formes oxydées et réduites du glutathion (GSSG et GSH, respectivement) a été réalisée grâce à l’utilisation d’ortho-phtalaldéhyde (OPA). L’OPA devient très fluorescent une fois conjugué au GSH, mais il est incapable de conjuguer le GSSG jusqu’à ce qu’il soit réduit. Ici, nous décrivons un test multiparamétrique pour quantifier les deux en utilisant la quantification des protéines pour la normalisation.
Notre objectif est de proposer un nouveau moyen de quantifier la concentration de thiols, en mettant l’accent sur les concentrations de GSH et de GSSG des différentes lignées cellulaires qui peuvent être réalisées in situ. Nous considérons qu’il s’agit d’un protocole utile pour la communauté scientifique. De nombreux efforts ont été déployés pour détecter des biomarqueurs de niche et spécifiques d’intérêt des espèces réactives de l’oxygène, et plusieurs ont révélé un grand intérêt pour la détection des espèces réactives de l’oxygène à courte durée de vie, telles que la détection radicalaire et les petites molécules telles que les hydroxyles et l’oxygène singulet.
L’un des principaux défis pour plusieurs institutions a été de détecter avec précision et précision les biomarqueurs d’intérêt sans avoir besoin d’équipement coûteux ou de processus laborieux. Ce protocole permet une analyse multiparamétrique, ce qui permet de normaliser les données sans avoir besoin de protocoles distincts, et de supprimer plusieurs étapes trouvées dans d’autres tests qui prennent beaucoup de temps, présentent des réactifs incompatibles ou utilisent des réactifs dangereux pour la santé. Le Groupe sur la sécurité des nanomatériaux continuera d’évaluer l’effet qu’ils peuvent avoir sur la santé humaine de divers nanomatériaux et polymères.
Nous considérons ce protocole comme une partie essentielle de notre boîte à outils pour atteindre cet objectif, car il peut potentiellement être multiplexé pour détecter des biomarqueurs supplémentaires.
Aperçu
Cette étude présente un protocole nouveau pour quantifier les concentrations de glutathion réduit (GSH) et oxydé (GSSG) dans diverses lignées cellulaires. La méthode utilise l'ortho-phtalaldéhyde (OPA) pour la détection par fluorescence, permettant une normalisation efficace des données sans nécessiter de procédures complexes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biochimie
- Biologie cellulaire
Contexte
- Les espèces réactives de l'oxygène sont des biomarqueurs importants dans divers processus biologiques.
- La détection précise du GSH et du GSSG est cruciale pour comprendre le stress oxydatif.
- Les méthodes existantes peuvent être coûteuses et longues.
- Ce protocole vise à simplifier le processus de quantification.
Objectif de l'étude
- Fournir une méthode fiable pour quantifier les concentrations de GSH et de GSSG.
- Permettre l'analyse in situ dans différentes lignées cellulaires.
- Réduire la complexité et le temps nécessaires aux dosages existants.
Méthodes utilisées
- Préparation des étalons et gammes de calibration de GSH.
- Lavage et incubation des culots cellulaires avec des réactifs spécifiques.
- Utilisation de l'OPA pour la détection par fluorescence du glutathion.
- Lecture de la fluorescence aux longueurs d'onde d'excitation et d'émission spécifiées.
Résultats principaux
- Les cellules A-549 ont présenté des rapports GSH/GSSG variables lorsqu'elles ont été traitées avec différents nanomatériaux.
- Les concentrations les plus élevées de GSSG ont été observées avec un traitement à 125 µg/mL d'argent.
- Le test a démontré une normalisation efficace de la quantification des protéines.
- Les résultats indiquent un potentiel de multiplexage pour la détection de biomarqueurs supplémentaires.
Conclusions
- Ce protocole propose une approche simplifiée pour la quantification du glutathion.
- Il peut être intégré à des études plus larges sur le stress oxydatif et les biomarqueurs.
- La méthode est accessible et ne nécessite pas d'équipement coûteux.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'évaluation quantitative du glutathion réduit et oxydé dans des cellules de mammifères en culture est essentielle pour analyser l'état redox cellulaire et la réponse au stress oxydatif lors des premières étapes de la découverte de médicaments. Ce dosage fondé sur l'OPA permet une quantification rapide et multiplexée du GSH et du GSSG, facilitant une analyse robuste de biomarqueurs sans nécessiter d'instrumentation spécialisée. La compatibilité du protocole avec les dosages de normalisation et de cytotoxicité simplifie l'intégration des données dans les flux de travail de découverte et précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation des cibles
- Permet la mesure directe de la capacité antioxydante cellulaire pour la caractérisation mécanistique des risques.
- Permet la validation fonctionnelle des voies de stress oxydatif dans des modèles pertinents pour la maladie.
- Facilite le test rapide d'hypothèses concernant l'interaction avec la cible et la modulation de la voie.
Développement de tests et criblage
- Offre une lecture normalisée et quantitative pour le criblage à haut débit de composés.
- Permet une évaluation reproductible de la modulation redox dans diverses lignées cellulaires.
- Intègre la normalisation protéique et l'évaluation de la cytotoxicité pour des sorties multiparamétriques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne la quantification des biomarqueurs de stress oxydatif avec des critères d'évaluation translationnels.
- Permet une continuité allant de la découverte in vitro à la validation dans des modèles précliniques.
- Facilite les décisions d'orientation tenant compte des risques, fondées sur l'état redox cellulaire.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode de quantification du glutathion basée sur l'OPA s'inscrit dans la continuité entre la phase de découverte précoce et la phase préclinique, permettant une intégration fluide de l'analyse des biomarqueurs redox dans l'identification des composés candidats et les études mécanistiques.
- Biologie de la découverte : Soutient l'interrogation fondée sur des hypothèses des voies de stress oxydatif et la validation des cibles.
- Criblage : Fournit des résultats quantitatifs et reproductibles adaptés au tri des composés et à la standardisation des tests.
- Analytique : Offre des mesures robustes basées sur la fluorescence pour l'analyse comparative du statut redox cellulaire.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les résultats in vitro et les stratégies de biomarqueurs précliniques lorsque le stress oxydatif constitue un critère d'évaluation pertinent.
- Réutilisation en entreprise : Propose une plateforme évolutible et adaptable pour la quantification de biomarqueurs redox dans plusieurs programmes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la modulation de la voie du stress oxydatif et la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Réduit la complexité, la durée et l'utilisation de réactifs dangereux dans les tests, tout en permettant des sorties multiplexées.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/ne pas aller » en intégrant des biomarqueurs redox aux données de cytotoxicité et de normalisation protéique.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des actifs en se fondant sur des connaissances mécanistiques et pilotées par des biomarqueurs.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la mise en place d'essais basés sur la fluorescence et l'interprétation des données.
- Requiert un accès à un lecteur de plaques à fluorescence et aux infrastructures standards de culture cellulaire.
- Exige une standardisation inter-équipes pour l'intégration de la normalisation et de l'évaluation de la cytotoxicité.
- Adaptable à diverses lignées cellulaires de mammifères moyennant une optimisation du protocole.
- Le potentiel de multiplexage pour des biomarqueurs supplémentaires dépend de la compatibilité des réactifs et de leur validation.
