Name: Microscopie intravitale à deux photons du glioblastome dans un modèle murin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Découvrez la microscopie intravitale à deux photons pour visualiser la distribution de nanoparticules fluorescentes dans un modèle murin de glioblastome. Cette technique permet d'étudier le passage de la barrière hémato-encéphalique et d'optimiser les stratégies de livraison thérapeutique.

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Nous tenons à remercier le service de microscopie en neurosciences Wu Tsai de Stanford, le Stanford Center for Innovations in Vivo Imaging (SCi3) - centre d’imagerie des petits animaux, la subvention d’instrumentation partagée NIH S10 (S10RR026917-01, PI Michael Moseley, Ph.D.) et le Stanford Preclinical Imaging Facility à Porter Drive pour avoir fourni l’équipement et l’infrastructure nécessaires à ce projet. Ce travail a été soutenu par une subvention de l’Institut national pour la santé de l’enfant et le développement humain, numéro de subvention R01HD103638. Nous tenons à remercier le groupe Schnitzer, l’Université de Stanford ; le laboratoire Zuo, Université de Santa Cruz ; et le Neurovascular Imaging Laboratory, Boston Photonic Center, Université de Boston, pour des discussions éducatives sur l’imagerie à deux photons et les modèles de fenêtres crâniennes.

Suivi en temps réel de nanoparticules dans les tumeurs cérébrales à l’aide de la 2P-IVM chez la souris

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transpupillary+two-photon+in+vivo+imaging+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina.</a> J Vis Exp. 168, 61970(2021).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+microscopy+reveals+the+contribution+of+Sox9%2B+to+kidney+regeneration+in+a+mouse+model+with+extracellular+vesicle+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment.</a> J Biol Chem. 295 (34), 12203(2020).</li>
<li>Jang, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+of+Paneth+cells+in+the+small+intestine+of+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice.</a> Sci Rep. 8 (1), 14174(2018).</li>
<li>Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+allows+imaging+and+characterization+of+cochlear+microvasculature+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo.</a> Biomed Res Int. 2015, 154272(2015).</li>
<li>Matsuura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+with+two-photon+microscopy+reveals+cellular+dynamics+in+the+ischeamia-reperfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart.</a> Sci Rep. 8 (1), 15991(2018).</li>
<li>Veres, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-free+in+vivo+imaging+of+the+tracheal+mucosa+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 7 (1), 694(2017).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+two-photon+calcium+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice.</a> Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).</li>
<li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 17 (1), (2019).</li>
<li>Birkner, A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+two-photon+imaging+in+vivo+with+a+red-shifted+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator.</a> Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).</li>
<li>Busche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+hippocampal+neurons+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models.</a> Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+two-photon+probe+to+selectively+detect+monoamine+oxidase+B+activity+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models.</a> Nat Commun. 5, 3276(2014).</li>
<li>Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+imaging%3A+live+imaging+of+glioma+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).</li>
<li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+dynamics+of+microglial+and+monocyte-derived+cells+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice.</a> Sci Rep. 6, 26381(2016).</li>
<li>Soubéran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+VEGF+blockade+on+the+dynamics+of+the+inflammatory+landscape+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice.</a> J Neuroinflammation. 16 (1), 191(2019).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+vivo+reveals+specific+nanoparticle+target+binding+in+a+syngeneic+glioma+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model.</a> Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).</li>
<li>Wartchow, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+cyclic+AMP+activators+reduces+glioblastoma+growth+and+invasion+as+assessed+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy.</a> Cells. 10 (3), 556(2021).</li>
<li>Jiang, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+fibrillar+collagen+deposition+associated+with+vascular+elements+in+glioblastoma+multiforme+by+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).</li>
<li>Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+2-photon+imaging+reveals+distinct+morphology+and+infiltrative+properties+of+glioblastoma-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).</li>
<li>Zhang, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+human+mesenchymal+stem+cells+with+gold+nanocages+for+in+vitro+and+in+vivo+tracking+by+two-photon+microscopy+and+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy.</a> Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+thermal+damage+from+robot-drilled+craniotomy+for+cranial+window+surgery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice.</a> J Vis Exp. 189, 64188(2022).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soft%2C+transparent%2C+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Sci Rep. 6, 27818(2016).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+optical+access+to+an+estimated+one+million+neurons+in+the+live+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex.</a> Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).</li>
<li>Kılıç, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cranial+windows+for+long+term+multimodal+neurovascular+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice.</a> Front Physiol. 11, 612678(2021).</li>
<li>Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+optical+properties+of+the+mouse+cranium-implications+for+in+vivo+multi+photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy.</a> J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).</li>
<li>Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+albumin-conjugated+pegylated+nanoparticles+allow+gene+delivery+into+brain+tumors+via+intravenous+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration.</a> Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDLR-mediated+peptide-22-conjugated+nanoparticles+for+dual-targeting+therapy+of+brain+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma.</a> Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+anti-glioblastoma+efficacy+by+PTX-loaded+PEGylated+poly%28%C9%9B-caprolactone%29+nanoparticles%3A+In+vitro+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation.</a> Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).</li>
<li>Valable, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+MRI+tracking+of+exogenous+monocytes%2Fmacrophages+targeting+brain+tumors+in+a+rat+model+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma.</a> Neuroimage. 40 (2), 972(2008).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototheranostics%3A+Active+targeting+of+orthotopic+glioma+using+biomimetic+proteolipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles.</a> ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).</li>
<li>Asan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+correlates+of+gray+matter+volume+changes+in+magnetic+resonance+morphometry+identified+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 11, 4234(2021).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Nous présentons une méthode de suivi in vivo des NP en temps réel à l’aide de la 2P-IVM à travers une fenêtre crânienne pour évaluer l’administration tumorale de NP d’oxyde de fer marquées par fluorescence. La technique chirurgicale pour cette procédure nécessite une main ferme et des compétences chirurgicales expérimentales avancées. Il est conseillé de s’entraîner à utiliser des carcasses ou des fantômes avant de passer à l’expérience des animaux vivants. Comme alternative, Hoeferlin et al. ont mis en œuvre une foreuse robotisée pour réduire les dommages thermiques, minimiser la variabilité des techniques chirurgicales et normaliser la chirurgie22.
La taille de la fenêtre représente un autre paramètre critique. Une fenêtre plus grande permettrait d’imager une plus grande partie de la tumeur avec la 2P-IVM. Dans la littérature, des tailles comprises entre 3 et 7 mm ont été décrites23. Cependant, des fenêtres plus grandes ne peuvent pas s’adapter à la courbure du cerveau, ce qui peut entraîner une augmentation de la pression régionale24. Pour surmonter cette contrainte, un soi-disant « crâne de verre » peut être utilisé à la place25. Par rapport aux fenêtres en verre traditionnelles, cette méthode utilise du verre incurvé, s’adaptant à la courbure du cerveau et permettant ainsi de créer des fenêtres plus grandes tout en réduisant la pression focale sur le cortex. Ce type de verre incurvé n’est pas disponible dans le commerce et n’a que des applications limitées dans la 2P-IVM, car la surface incurvée provoque des artefacts de réflexion, limitant la zone de la fenêtre qui pourrait être imagée. Une autre alternative est une fenêtre24 à base de silicium. D’une part, cette méthode offre plus de flexibilité quant à la taille et à la forme de la fenêtre à créer. De plus, des résultats comparables en termes de taux de défaillance et d’inflammation des fenêtres en verre classiques ont été rapportés. D’autre part, il a été démontré que la qualité de l’imagerie à 2 photons dans les fenêtres à base de polymères diminue plus rapidement que dans les fenêtres en verre, ce qui la rend impossible pour les applications à long terme26. Une fenêtre crânienne amincie représente une autre alternative. Bien qu’il soit moins invasif que la fenêtre en verre classique, il ne permet pas l’implantation de cellules GBM en utilisant la même technique que celle décrite ici. De plus, il est difficile d’obtenir une épaisseur de crâne constante, ce qui peut provoquer des artefacts importants dans 2P-IVM27.
La lignée cellulaire et la quantité de cellules GBM implantées sont d’autres considérations importantes lors de la planification du calendrier de l’étude. La lignée cellulaire de gliome de rat C6 est l’une des lignées cellulaires les plus utilisées dans la recherche sur le GBM. Chez le rat et la souris, un nombre de cellules compris entre 5 x 104 et 5 x 106 a été rapporté pour les implantations intracrâniennes 27,28,29,30,31. En règle générale, lors de l’implantation d’un plus grand nombre de cellules, il faut s’attendre à une croissance tumorale plus rapide. Dans ce protocole, 1 x 105 cellules ont été implantées et l’imagerie a été réalisée les jours 11 et 12 après l’implantation. Xin et al. ont implanté 1 x 105 cellules C6 chez des souris nues BALB/c et ont signalé la détection d’un GBM avancé en IRM le 7e jour après l’implantation et une mortalité accrue après 15 jours30. En comparaison, Jia et al. ont utilisé un plus grand nombre de cellules (1 x 106) et la même souche de souris et ont détecté une petite masse tumorale au jour 7 en IRM avec une barrière hémato-encéphalique (BHE) légèrement perturbée, comme le démontre une tache bleue d’Evans pâle dans le tissu GBM32. Le jour 14, la tache bleue d’Evans était plus forte que le jour 7, indiquant que la BHE était fortement perturbée. À son tour, la croissance tumorale affecte également la durée pendant laquelle les animaux peuvent être gardés dans l’expérience. Il s’agit d’une considération importante du bien-être animal pour les études d’imagerie longitudinale. Les fenêtres crâniennes chroniques se prêtent à l’imagerie jusqu’à 6 mois après l’implantation26.
Les nanoparticules utilisées dans ce protocole sont constituées d’oxyde de fer et de composants fluorophores. Les applications possibles comprennent l’étude de l’administration tumorale de nouveaux médicaments thérapeutiques, des thérapies cellulaires et des interventions sur le système vasculaire tumoral et le microenvironnement tumoral. Différents médicaments candidats et thérapies combinées peuvent être évalués au niveau cellulaire et moléculaire. La composante d’oxyde de fer des NP permet une imagerie multimodale avec IRM ou imagerie par particules magnétiques en plus de la 2P-IVM. Bien que l’IRM représente une modalité d’imagerie cliniquement pertinente, sa résolution anatomique est inférieure à celle de la microscopie intravitale33.
Cette méthode présente également certaines limites. Les coordonnées cérébrales selon un atlas cérébral de souris sont standardisées pour les souris C57BL/6J et doivent être ajustées en fonction de la souche, du sexe et de l’âge de la souris. De plus, avec l’imagerie à deux photons, seule une profondeur limitée d’environ 450 μm est accessible9. Par conséquent, seule une caractérisation partielle de la tumeur est possible avec la 2P-IVM, et les différences régionales dans les caractéristiques tumorales pourraient être manquées. De plus, seuls deux points temporels après l’administration de NP ont été inclus. Des études futures, y compris plus de points temporels après l’administration intraveineuse, permettront une analyse plus détaillée du comportement spatio-temporel des NP dans le microenvironnement tumoral.
Pour conclure, nous avons évalué l’administration tumorale de nanoparticules d’oxyde de fer marquées par fluorescence à l’aide de la 2P-IVM dans un modèle murin de GBM. Cette méthode peut être facilement modifiée pour s’adapter à divers domaines de recherche et représente un outil important pour l’imagerie cérébrale in vivo dans le domaine des neurosciences.

La microscopie intravitale à deux photons (2P-IVM) est une technique d’imagerie par fluorescence qui permet de visualiser les tissus vivants1.
Développé pour la première fois dans les années 1990, le 2P-IVM a été utilisé pour l’analyse in vivo de la rétine2, du rein3, de l’intestin grêle4, de la cochlée5, du cœur6, de la trachée7 et du cerveau dans divers modèles précliniques 8,9. Dans le domaine des neurosciences, la 2P-IVM a gagné en importance en tant que technique d’imagerie en temps réel du cerveau sain chez les animaux éveillés10, ainsi que pour l’étude des maladies du système nerveux telles que la maladie d’Alzheimer11, la maladie de Parkinson12 et le glioblastome (GBM)13,14,15,16.
La 2P-IVM offre une solution élégante pour étudier le microenvironnement tumoral pendant le développement du GBM. Alors que certaines études antérieures se sont concentrées sur des modèles in vitro17 et ex vivo 18, d’autres ont mis en œuvre des modèles orthotopiques19 et xénotropes20 in vivo pour examiner le GBM. Madden et al. ont effectué une imagerie native de la lignée cellulaire de gliome de rat CNS-1 dans un modèle murin13. À l’aide d’un modèle murin orthotopique GL261-DsRed, Ricard et al. ont effectué une administration intraveineuse d’un fluorophore pour améliorer les vaisseaux sanguins de la région tumorale dans 2P-IVM14.
Ici, nous appliquons la 2P-IVM pour suivre l’administration tumorale de nanoparticules d’oxyde de fer (NP) marquées par fluorescence dans un modèle murin orthotopique de GBM. À l’aide d’une fenêtre crânienne, cette méthode nous permet d’étudier en détail la distribution spatio-temporelle en temps réel des NPs dans le cerveau.

<table><tbody><tr><td>solution pour perfusion de chlorure de sodium à 0,9 %</td><td>Baxter Corp</td><td>533-JB1301P</td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco’s Modified Eagle Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Seringues de 1 mL</td><td></td><td>Seringue BD Luer-Lok, REF309628</td><td></td></tr><tr><td>10 %&nbsp ; FBS</td><td>Thermo fisher</td><td>Cytiva SH30910.03HI</td><td></td></tr><tr><td>10 % DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à 2 photons</td><td>Prairie Technologies, Bruker</td><td>Prairie Ultima IV</td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs d’alcool, 70 %</td> <td>Medline Industries, LP</td><td>MDS093810</td><td></td></tr><tr><td>Alcool, flacon pulvérisateur</td><td>Decon Labs Inc</td><td>Decon SaniHol, 04-355-122</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>Reynold Brands</td><td>Reynold Wrap feuille d’aluminium</td><td></td>antiadhésive</tr><tr><td>Machine d’anesthésie</td><td>Patterson Scientific</td><td>SAS3</td><td></td></tr><tr><td>Surveillance de l’anesthésie&nbsp ;</td><td>Kent Scientific&nbsp ;</td><td>MouseSTAT Jr. Pulsoxymètre</td><td></td>pour rongeurs</tr><tr><td>Antibiotique-Antimycosique (100x), liquide</td><td>Invitrogen</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs de bétadine</td><td>Professional Disposables International, Inc</td><td>S41125</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie, 5 mm&nbsp ;</td><td>Miltex</td><td>Taille 5</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine à libération prolongée</td><td>Zoo Pharm</td><td>Bup SR Lab, 1,0 mg/mL</td><td>Un médicament générique peut être utilisé à la place.&nbsp ;</td></tr><tr><td>C6 gliome de rat lignée cellulaire</td><td>ATCC (American Tissue Culture Collection)</td><td>CCL-107</td><td></td></tr><tr><td>Canules</td><td>BD</td><td>16 G, 1.1/2 », 30 G, 1 »</td><td></td></tr><tr><td>Carprofène</td><td>Pfizer&nbsp ;</td><td>Rimadyl, 50 mg/ml</td><td>Un médicament générique peut être utilisé à la place.</td></tr><tr><td>Cefazoline</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25021-101-10, 1 g/flacon</td><td>Un médicament générique peut être utilisé à la place.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Crépine à cellules, 40 & micro ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>87711</td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs à embout en coton, 6" &nbsp ;</td><td>Dyad Medical Sourcing, LLC</td><td>HCS1005</td><td></td></tr><tr><td>Ciment dentaire</td><td>Stoelting Co</td><td>51459</td><td>Kit de ciment dentaire, transparent, 2 composants</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Bimeda</td><td>138RX, 2 mg/mL</td><td>Un médicament générique peut être utilisé à la place.&nbsp ;</td></tr><tr><td>DietGel</td><td>ClearH2O</td><td>Recovery, 72-06-502</td><td></td></tr><tr><td>Drapé&nbsp ;</td><td>Cardinal Health</td><td>Bio Shield Wrap</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Saeyang Microtech</td><td>Escort Pro, B08350</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de foret&nbsp ;</td><td>Hager & Meissinger GmbH</td><td>REF310104001001005</td><td>Taille 005, US 1/4</td></tr><tr><td>FIJI Logiciel</td><td>d’analyse d’imagerie National Institute of Health</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr> <tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td></td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Fisher HealthCare</td><td>Compresse de gaze de coton stérile, 4 x 4", 22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam&nbsp ;</td><td>Ethicon Inc.&nbsp ;</td><td>Éponge en gélatine résorbable Surgifoam, Réf. 1972</td><td></td></tr><tr><td>Germinator&nbsp ;</td><td>Cellpoint Scientific&nbsp ;</td><td>Germinator 500, n° 11688</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles en verre, 5 mm de diamètre</td><td>Fisher Scientific</td><td>Menzel Cover glass&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Gants, non stériles</td><td>Fisher Scientific</td> Gants <td></td><td>d’examen médical en nitrile non poudrés</td></tr><tr><td>Gants stériles</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS104070</td><td></td></tr><tr><td>Crème dépilatoire</td><td>Church & Dwight</td><td>Nair Lotion décapante&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Hamilton</td><td>Hamilton Company Inc</td><td>Gastight #1701, 10 & micro ; </td><td></td>L</tr><tr><td>HBSS sans Ca, Mg Fisher</td><td>Scientific</td><td>PI88284</td><td></td></tr><tr><td>Barre de tête</td><td>Hongway</td><td>Diamètre intérieur de 5 mm Joints</td><td></td>toriques</tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Stoelting Co.</td><td>Chauffe-rongeurs X2</td><td></td></tr><tr><td>Seringues à insuline</td><td>Exel International Medical Products&nbsp ;</td><td>29G x 1/2&Prime ;</td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticules d’oxyde de fer</td><td>Covis Pharma GmbH</td><td>Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Dechra</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Souris</td><td>Jackson Laboratories</td><td>NSG, Strain 005557</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (chirurgie)</td><td>Seiler</td><td>Medical Seiler IQ Q-100-220</td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticules</td><td>sur mesure</td><td></td><td>Nanoparticules d’oxyde de fer (Ferumoxytol) marquées à la fluorescéine isothiocyanate</td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique</td><td>Principaux produits pharmaceutiques</td><td>Lubrifresh P.M. pommade de nuit, 203964</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>Linde Gas & Équipement Inc.&nbsp ;</td><td>Cylindre en acier haute pression de style K, 249CF, 2000PSIG, CGA 540</td><td></td></tr><tr><td>Gobelets en plastique</td><td>Georgia-Pacirif Consumer Products</td><td>Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastique, Transparent, PK2400</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène</td><td>Braintree Scientific</td><td>50-195-5494</td><td></td></tr><tr><td>Échelle</td><td>Ohaus Corp</td><td>CR2200</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Integra Life Sciences Production Corp</td><td>Integra Miltex Scalpel</td><td></td>jetable en acier inoxydable</tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-804-18</td><td></td></tr><tr><td>Scellant</td><td>Henkel Corp</td><td>Loctite 4014</td><td></td></tr><tr><td>Blouse de laboratoire à usage unique</td><td>High Tech Conversions</td><td>17-444-081</td><td></td></tr><tr><td>Cadre stéréotaxique</td><td>Stoelting Co.&nbsp ;</td><td>Stoelting New Standard TM</td><td></td></tr><tr><td>Systèmes de filtration par le haut des bouteilles stériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2GPU05RE, MilliporeSigma NO. :S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Boîte en polystyrène</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gants chirurgicaux Cardinal</td><td>Health</td><td>19-163-108</td><td></td></tr><tr><td>Colle chirurgicale, adhésif pour tissus 3M Vetbond</td><td>3M Animal Care Prodcuts</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Tail cathéter veineux</td><td>Custom</td><td></td><td>Se compose de deux canules de 30 G reliées à un tube en sillicone&nbsp ;</td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x), sans rouge phénol</td><td>Invitrogen</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>Torche ultraviolette</td><td>Technologie d’ensoleillement printanier</td><td>Consciot</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopie intravitale à deux photons du glioblastome dans un modèle murin

Two-Photon Intravital Microscopy of Glioblastoma in a Murine Model

L’administration de traitements anticancéreux administrés par voie intraveineuse aux tumeurs cérébrales est limitée par la barrière hémato-encéphalique. Une méthode permettant d’imager directement l’accumulation et la distribution des macromolécules dans les tumeurs cérébrales in vivo améliorerait considérablement notre capacité à comprendre et à optimiser l’administration de médicaments dans des modèles précliniques. Ce protocole décrit une méthode de suivi in vivo en temps réel de nanoparticules marquées par fluorescence administrées par voie intraveineuse avec microscopie intravitale à deux photons (2P-IVM) dans un modèle murin de glioblastome (GBM).
Le protocole contient une description en plusieurs étapes de la procédure, y compris l’anesthésie et l’analgésie des animaux de laboratoire, la création d’une fenêtre crânienne, l’implantation de cellules GBM, la mise en place d’une barre de tête, la réalisation d’études 2P-IVM et les soins post-chirurgicaux pour les études de suivi à long terme. Nous montrons des sessions d’imagerie 2P-IVM représentatives et des analyses d’images, examinons les avantages et les inconvénients de cette technologie et discutons des applications potentielles.
Cette méthode peut être facilement modifiée et adaptée à différentes questions de recherche dans le domaine de l’imagerie cérébrale préclinique in vivo .

Ici, nous avons effectué une chirurgie de la fenêtre crânienne et greffé des cellules C6 dans un modèle murin NSG de GBM (n = 5). Une bonne étanchéité entre tous les composants impliqués dans la création de la fenêtre (Figure 1A) assurera la durabilité des fenêtres pour l’imagerie à long terme et, en outre, réduira la morbidité. En utilisant la platine adaptée à la 2P-IVM in vivo (Figure 2), nous avons pu imager des animaux sous anesthésie jusqu’à 2 h sans aucun artefact de mouvement majeur. Environ 10 minutes après l’application intraveineuse des nanoparticules chez des souris porteuses de GBM, la 2P-IVM montre le signal vert et fluorescent des vaisseaux dans la région de la tumeur, ce qui correspond à la localisation intravasculaire des nanoparticules marquées par la FITC. Seule une petite quantité de signal fluorescent vert est notée à l’extérieur des vaisseaux sanguins, indiquant le début de l’extravasation des NP (Figure 3A). Une augmentation du signal FITC provenant de l’espace extravasculaire est observée, ce qui correspond à une extravasation avancée (Figure 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig01.jpg"> Graphique 1. Placement de fenêtres crâniennes, craniotomie, implantation et imagerie. (A) Coupe transversale de l’emplacement anatomique d’une fenêtre crânienne. Comme la barre de tête est sans métal, il est possible d’effectuer une imagerie par résonance magnétique ou une imagerie par particules magnétiques en plus de la microscopie intravitale à deux photons. (B) Vue d’ensemble (rangée du haut) et vue détaillée (rangée du bas) de la craniotomie (à gauche), de l’implantation cellulaire (au milieu) et de la microscopie intravitale à 2 photons (à droite). Lors de l’ouverture du crâne, un saignement superficiel se produit (à gauche) et est rapidement résorbé (au milieu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig02.jpg"> Graphique 2. Conception assistée par ordinateur (CAO) de la scène. CAO de la platine utilisée pour la microscopie intravitale in vivo à 2 photons, y compris une barre d’occlusion, une stabilisation de la barre de tête et des vis pour les réglages de hauteur et d’angle. Le fichier CAO 3D se trouve dans le fichier de codage supplémentaire 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig03.jpg"> Graphique 3. Images de microscopie intravitale à 2 photons in vivo. Images acquises (A) 10 min et (B) 24 h après l’administration de nanoparticules par voie intraveineuse. Alors que les cellules GBM émettent des signaux fluorescents dans le spectre rouge (à gauche), les nanoparticules dans le tissu cérébral sont visualisées en vert (à droite). # indique des NP extravasées, * indique un vaisseau sanguin. Seul un nombre limité de particules ont subi une extravasation et sont visibles à proximité des cellules tumorales 10 minutes après l’administration de NP. Une abondance de particules est visible dans la région des cellules GBM, suggérant une extravasation 24 heures après l’administration de NP. Les nanoparticules sont constituées d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et de nanoparticules d’oxyde de fer (Ferumoxytol). Les barres d’échelle représentent 100 μm. Abréviations : 2P-IVM : microscopie intravitale à 2 photons, RFP : protéine fluorescente rouge, GBM : glioblastome, FITC : isothiocyanate de fluorescéine, NP : nanoparticules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier de codage supplémentaire 1 : fichier CAO 3D de la scène. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/custom%20stage%203D%20CAD.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Nous présentons une nouvelle approche pour la microscopie à deux photons de l’administration tumorale de nanoparticules d’oxyde de fer marquées par fluorescence au glioblastome dans un modèle murin.

Microscopie intravitale à deux photons du glioblastome dans un modèle murin

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the ...

Le glioblastome est l’un des cancers primitifs du cerveau les plus courants et est associé à une croissance rapide et à une faible espérance de vie. Le développement de thérapies efficaces pour le glioblastome reste un défi majeur car l’administration de traitements est limitée par la barrière hémato-encéphalique. Une méthode permettant d’imager directement l’accumulation et la distribution des macromolécules dans le cerveau améliorerait considérablement notre capacité à comprendre et à optimiser l’administration des médicaments.La microscopie à deux photons offre une solution élégante pour étudier la distribution en temps réel des nanoparticules dans le modèle préclinique du glioblastome. En modifiant la nanoparticule utilisée dans cette étude, il est possible d’étudier l’administration de différents médicaments candidats et thérapies combinées au niveau cellulaire et moléculaire. En plus de la microscopie intravitale à deux photons, le composant d’oxyde de fer de ces nanoparticules permet une imagerie multimodale avec IRM ou MPI.À l’avenir, les installations d’imagerie pourraient servir à la réalisation d’une détection précoce du cancer, conduisant ainsi à des thérapies plus efficaces contre les néoplasies malignes. Une voie pour y parvenir consiste à fusionner la microscopie intravitale à deux photons avec d’autres modalités d’imagerie telles que la tomographie par émission de positrons et l’échographie photoacoustique.

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Recherche sur le cancer

L'implantation intracrânienne d'GL261 cellules en souris C57BL / 6 produit gliomes malins qui récapitulent plusieurs des caractéristiques de glioblastome humain. Nous avons utilisé des cellules exprimant de façon stable GL261 luciférase pour nous permettre...

Implantation intracrânienne avec 3D ultérieures In Vivo Bioluminescent imagerie des gliomes murin

Nous décrivons une méthode intégrée pour la précision, l'implantation stéréotaxique de cellules humaines de glioblastome multiforme dans le cerveau des souris nude et de série...

Implantation stéréotaxique intracrânienne et<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie bioluminescente de xénogreffes tumorales dans un système de modèle de souris de glioblastome multiforme

Dans cette vidéo, nous effectuons une imagerie intravitale de cellules cancéreuses pré-injectées dans un modèle murin via une fenêtre crânienne implantée. Cette technique d’imagerie time-lapse à haute résolution permet d’étudier le comportement dynamique des cellules cancéreuses chez la souris vivante.

Imagerie intravitale basée sur la fenêtre crânienne dans un modèle murin : une technique d’imagerie pour étudier le comportement des cellules cancéreuses pré-injectées dans le cerveau d’un modèle murin

Dans cette vidéo, nous décrivons la tomographie moléculaire par fluorescence ou FMT pour l’imagerie in vivo de xénogreffes de glioblastome marquées par des protéines fluorescentes dans des modèles murins. Cette technique est utile pour élucider les effets des thérapies antitumorales au niveau moléculaire.

Tomographie moléculaire à fluorescence : une technique d’imagerie pour l’imagerie in vivo de xénogreffes de glioblastome marquées par des protéines fluorescentes dans un modèle murin

Source : Clark, A.J., et al. Imagerie par bioluminescence d’un modèle animal immunocompétent pour le glioblastome. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo fait la démonstration de l’imagerie par bioluminescence pour suivre la progression du glioblastome dans un modèle murin immunocompétent, en utilisant des cellules tumorales exprimant la luciférase et la luciférine pour quantifier la croissance tumorale de manière non invasive.

Imagerie par bioluminescence d’un modèle murin immunocompétent pour le glioblastome

Nous avons établi un modèle de glioblastome orthotopique corticale chez la souris pour intravitale microscopie à deux photons qui récapitule les contraintes biophysiques normalement en jeu au cours de la croissance de la tumeur. Une fenêtre en verre chronique remplaçant le crâne au-dessus de la tumeur permet le suivi de la progression de la tumeur au cours du temps par microscopie à deux photons.

Un modèle de souris orthotopique glioblastome maintien contraintes physiques et parenchyme cérébral Convient pour intravitale deux microscopie biphotonique

Les cellules de gliome GL261 fournissent un modèle animal immunocompétent utile du glioblastome. Les objectifs de ce protocole sont de démontrer des techniques appropriées pour surveiller la croissance tumorale intracrânienne à l’aide de l’imagerie de bioluminescence in vivo, et de vérifier l’utilité des cellules GL261 modifiées par la luciférase pour l’étude de l’immunologie tumorale et des approches immunothérapeutiques pour le traitement du glioblastome.

Bioluminescence imagerie d&#39;un modèle animal pour immunocompétentes glioblastome

Orthotopique injection intracrânienne des cellules tumorales a été utilisée dans la recherche sur le cancer pour étudier la biologie de tumeur de cerveau, progression, évolution et réponse thérapeutique. Nous présentons ici la tomographie moléculaire de xénogreffes tumorales, à fluorescence qui fournit une imagerie intravitale en temps réel et la quantification d’une tumeur de masse dans des modèles précliniques de glioblastome.

Fluorescence moléculaire tomographie pour l’imagerie In Vivo des xénogreffes de glioblastome

Pour comprendre le comportement malin du cancer, il faut créer des modèles précis de la façon dont les cellules tumorales interagissent avec les composants du microenvironnement tumoral, tels que les macrophages. Ici, nous décrivons deux méthodes pour étudier l’interaction des cellules de glioblastome avec les macrophages associés aux tumeurs et la microglie où l’effet sur l’invasion du glioblastome est évalué.

Coculture Assays pour étudier macrophage et microglie Stimulation de glioblastome Invasion

Ce protocole décrit l’utilisation de la microscopie multiphotonique pour effectuer une imagerie à long terme, à haute résolution, sur cellule unique, du poumon intact en temps réel à l’aide d’une fenêtre d’imagerie stabilisée sous vide.

À long terme à haute résolution Microscopie intravitale dans le poumon avec un vide Stabilisé Imaging Window

Découvrez la microscopie intravitale à deux photons pour visualiser la distribution de nanoparticules fluorescentes dans un modèle murin de glioblastome. Cette technique permet d'étudier le passage de la barrière hémato-encéphalique et d'optimiser les stratégies de livraison thérapeutique.

Microscopie intravitale à deux photons du glioblastome dans un modèle murin

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