Name: Perfusion chirurgicale et isolement du pancréas porcin pour l’isolement des îlots (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Découvrez une méthode de perfusion chirurgicale pour isoler le pancréas porcin et obtenir des îlots pancréatiques de haute pureté. Cette technique optimise le rendement pour la recherche en xénotransplantation.

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<meta charset="utf8"></head><body>Purification d’îlots porcins par perfusion chirurgicale du pancréas de porc

<ol><li>Gillespie, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+pathogenesis+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22CMAJ%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: pathogenesis and prevention.</a> CMAJ. 175 (2), 165-170 (2006).</li>
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<li>vander Windt, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+islet+damage+after+direct+exposure+of+pig+islets+to+blood%3A+has+humoral+immunity+been+underestimated%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Early islet damage after direct exposure of pig islets to blood: has humoral immunity been underestimated.</a> Cell Transplant. 21 (8), 1791-1802 (2012).</li>
<li>Wright, M. J., Cavanagh, T. J., Fetterhoff, T. J., Wile, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+blood+content+on+porcine+pancreatic+dissociation+and+islet+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Effect of blood content on porcine pancreatic dissociation and islet yield.</a> Transplant Proc. 26 (6), 3442(1994).</li>
<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+porcine+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult porcine islets of Langerhans.</a> Cell Transplant. 9 (3), 297-305 (2000).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 M NaOH, 100 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS, 500 mL (15 à 30 &deg ; C)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>1x D-PBS, 500 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS, 1 L</td><td>Thermo Fisher</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Tubes coniques</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430236-6EA</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B [50 mg]</td><td>Millipore Sigma</td><td>PHR1662</td><td></td></tr><tr><td>Antiseptique Povidone Iode 10 %</td><td>Millipore Sigma</td><td>25655-41-8</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Gradient Former</td><td>BioRad</td><td>395</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Thermo Fisher</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>COBE Cell Processor</td><td>Ebay</td><td>317690&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir du circuit de digestion, bouteille Gibco, 1 L</td><td>Thermo Fisher</td><td>10341001</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Thermo Fisher</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>Dithizone</td><td>Thermo Fisher</td><td>60-10-6</td><td></td></tr><tr><td>Gradient Former Kit de Raccordement</td><td>BioRad</td><td>1652008</td><td></td></tr><tr><td>Héparine [1000 U/mL]</td><td>Produits médicaux d’urgence</td><td>0409-2720-01</td><td></td></tr><tr><td>Tampon HEPES (1 m), 100 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique humaine 25 %, 100 mL</td><td>Celprogen</td><td>HSA2001-25-1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Covetrus</td><td>Article# :11695067772</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Patterson</td><td>Article# :07-894-8462</td><td></td></tr><tr><td>Liberase (100 mg)</td><td>Millipore Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de viabilité/cytotoxicité</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Lympholyte 1.1 Média 500 mL</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL5020</td><td></td></tr><tr><td>Tube Masterflex LS 16</td><td>Masterfle</td><td>96419-16</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Masterflex</td><td>Masterflex 07522-30</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep (2 mg/mL)</td><td>Celprogen</td><td>PS-30-002</td><td></td></tr><tr><td>Pulmozyme (1 mg/mL, 2,5 mL/flacon)</td>Milieu de récupération <td>8931278</td><td></td> <td>Dornase Alfa</td></tr><tr><td>, PIM(R)</td><td>Prodo Laboratories, Inc.</td>Milieu de culture standard <td>PIM-R001GMP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Millipore Sigma</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>, PIM(S)</td><td>Prodo Laboratories, Inc.</td><td>PIM-S001GMP</td><td></td></tr><tr><td>Tzed&trade ; (tilétamine et zolazépam) Injection C</td><td>Patterson</td><td>Article # :07-894-6240</td><td></td></tr><tr><td>Université du Wisconsin (UW) Solution, 3 L</td><td>Global Transplant Solutions</td><td>1000-0046-06</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td>Sigma Alderich</td><td>CLS6783-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Patterson</td><td>Article # :07-891-6165</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusion chirurgicale et isolement du pancréas porcin pour l’isolement des îlots

Surgical Perfusion and Isolation of the Porcine Pancreas for Islet Isolation

La configuration opératoire et la laparotomie médiane sont illustrées à la figure 1. L’incision de la laparotomie doit être incurvée pour éviter l’ouverture urogénitale (Figure 1B). Lors de la mise en place de l’enrouleur, fixez le poteau de l’enrouleur Omni ou Bookwalter dans le coin inférieur gauche de la table. La rétraction idéale comprend deux lames d’écarteur pour la paroi abdominale droite, deux pour la paroi abdominale gauche et 1-2 pour le côlon droit et l’intestin grêle, enveloppées dans une serviette stérile (Figure 1C). Des lames de paroi de corps, de splanchnic ou d’écarteur malléable peuvent être utilisées, selon la disponibilité d’un assistant et les préférences de l’opérateur. Si un écarteur Omni ou Bookwalter n’est pas disponible, 1 à 2 écarteurs Balfour auto-retentissants peuvent être utilisés pour rétracter la paroi abdominale de chaque côté. Un assistant peut ensuite appliquer une rétraction sur le côlon droit et l’intestin grêle enveloppés dans une serviette stérile.
La dissection rétropéritonéale réalisée sur la figure 2 peut être réalisée avec un mélange de dissection émoussée et nette. Bien qu’il soit important d’obtenir un contrôle circonférentiel de la VCI infrarénale et de l’aorte, il n’est pas nécessaire de poursuivre cette dissection jusqu’à la bifurcation. La partie intrathoracique de la procédure est la plus difficile sur le plan technique (figure 3), car une lésion de la VCI intrathoracique ou rétrohépatique peut provoquer des saignements importants et obscurcir le champ opératoire. Lorsque vous identifiez l’aorte thoracique descendante, séparez brusquement l’aorte de l’œsophage à l’aide de votre pouce et de votre index. Pour éviter l’avulsion de petites artères intercostales et les saignements ultérieurs, le contrôle circonférentiel n’est pas essentiel tant que l’aorte thoracique descendante est accessible avec un espace clairement défini pour accueillir une pince aortique.
La canulation de l’aorte infrarénale est réalisée à l’aide de la technique de Seldinger (Figure 4). Cela peut se faire avec l’aorte infrarénale clampée proximale et distale (Figure 4A), ou directement sans clampage. Veillez à ne pas insérer l’aiguille à travers la paroi arrière de l’aorte. Une gaine plus grande peut également être utilisée si l’aorte est de taille suffisante. Il est important de purger l’air de la tubulure d’extension IV et de connecter la tubulure IV de la solution UW à la gaine 10Fr de manière stérile. Assurez-vous que le canal IV est ouvert, bien que l’écoulement ne s’amorce pas tant que l’aorte n’est pas serrée (figure 4B). Lors de la réalisation de la veinotomie dans la VCI infrarénale, il est important que le chirurgien principal saisisse solidement la VC à l’aide d’une pince DeBakey, afin de ne pas perdre le site de la veinotomie et de faire couler un grand volume sanguin dans le champ opératoire. Une veinotomie loin du pancréas, avec la mise en place rapide de l’aspiration en flaque, maintient un champ opératoire sans effusion de sang avec des plans de tissu clairs pour la pancréatectomie (Figure 4C). Le drainage initial sera du sang veineux foncé, mais celui-ci s’éclaircira à mesure que le porc sera exsangulé et que la solution UW sera perfusée à travers les viscères. Assurez-vous d’utiliser une grande cartouche d’aspiration pour cette partie de la procédure.
Les viscères, et en particulier le pancréas, deviendront de plus en plus pâles au fur et à mesure que la solution UW sera perfusée (Figure 5A). Le canal pancréatique peut être identifié en suivant le trajet du lobe duodénal dans le duodénum. Le conduit doit être divisé entre deux attaches en soie pour éviter la contamination par le contenu entérique (figure 5B). Alors que le parenchyme pancréatique doit apparaître pâle et sans sang, le tissu conjonctif restant entourant le pancréas doit être nettoyé avant l’isolement des îlots (Figure 5C).
Le pancréas prélevé peut ensuite subir un processus d’isolement et de purification des îlots pancréatiques en plusieurs étapes (figure 6). La figure 7A montre la distribution représentative de la taille des îlots après le processus d’isolement et de purification des îlots. La figure 7B montre des îlots purifiés à l’aide de la microscopie à fond clair, et après coloration vivante/morte, les couleurs vertes et rouges représentant respectivement les cellules d’îlots viables et non viables. Le rendement et la pureté des îlots peuvent être évalués à l’aide d’un compteur de cellules d’îlots. Des rendements représentatifs sont fournis à partir de trois isolements pancréatiques porcins indépendants qui sont résumés à la figure 7C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig01.jpg"> Figure 1 : Configuration opératoire. (A) Porc positionné en position couchée avec l’abdomen préparé de manière stérile ; (B) Laparotomie médiane pratiquée de la xiphoïde au pubis ; (C) Rétropéritoine exposé avec l’écarteur Omni en place. Barres d’échelle = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig02.jpg"> Figure 2 : Dissection rétropéritonéale. (A) Dissection rétropéritonéale complète avec contrôle circonférentiel de la VCI infrarénale et des veines rénales. Le rectangle jaune est agrandi sur la figure 2B ; (B) Image agrandie de la VCI infrarénale et des veines rénales ; (C) Veines rénales attachées. Barres d’échelle = 2 cm. Abréviation : IVC = veine cave inférieure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig03.jpg"> Figure 3 : Obtention d’un contrôle supracœliaque. (A) Hémidiaphragme droit incisé. Le carré jaune est agrandi sur la figure 3B ; (B) Extension de l’incision de l’hémidiaphragme droit pour exposer la VCI intrathoracique et l’aorte thoracique descendante ; (C) Contrôle circonférentiel de la VCI intrathoracique obtenu. Barres d’échelle = 2 cm. Abréviation : IVC = veine cave inférieure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig04.jpg"> Figure 4 : Canulation de l’aorte infrarénale, isolement viscéral et perfusion. (A) Contrôle proximal et distal de l’aorte infrarénale obtenu ; (B) gaine 10Fr placée dans l’aorte infrarénale par la technique Seldinger ; (C) Perfusion viscérale via la gaine aortique infrarénale et drainage par veinotomie et ventouse de piscine dans la VCI infrarénale. Barres d’échelle = 2 cm. Abréviation : IVC = veine cave inférieure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig05.jpg"> Figure 5 : Pancréatectomie totale. (A) Viscères devenant plus pâles pendant la perfusion ; (B) canal pancréatique isolé ; (C) Pancréas porcin explanté. Barres d’échelle = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig06.jpg"> Figure 6 : Isolement et purification des îlots. Représentation schématique de l’infusion d’une solution enzymatique, de la digestion du pancréas porcin, de la collecte de tissus, du lavage cellulaire avec Cell Processor, ainsi que de la culture et de l’analyse cellulaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig07.jpg"> Figure 7 : Viabilité et rendement représentatifs des îlots après purification. (A) Îlots porcins après imagerie en fond clair agrandie et coloration des îlots vivants/morts. Le vert montre les cellules vivantes ; Le rouge montre les cellules mortes. Barres d’échelle = 100μm (B) Distribution de l’histogramme de la taille des îlots de Langerhans porcins après purification. (C) Tableau indiquant la pureté et le rendement de trois isolements d’îlots pancréatiques porcins. Abréviation : IEQ = équivalent des îlots, l’unité standard pour la quantification des îlots. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Perfusion chirurgicale et isolement du pancréas porcin pour l’isolement des îlots

Pancreatic islet transplantation is an emerging treatment for type I diabetes; however, it is limited by donor matching and availability. Porcine islet ...

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Atteindre de haute qualité et la quantité appropriée d'îlots humains est l'une des conditions préalables importantes pour la transplantation d'îlots de succès. Dans cette vidéo, nous décrire étape par étape les procédures pour l'isolement des îlots pancréatiques humains (partie I: la digestion et la collecte des tissus pancréatiques) en utilisant une méthode modifiée automatisés.

Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie I: La digestion et la perception des tissus pancréatiques

L'alimentation de type 2 diabétiques îlots pour la recherche est insuffisant. Ici, nous partageons notre protocole pour isoler les îlots de patients subissant une pancréatectomie partielle. Cette approche représente un lieu unique pour obtenir des îlots de diabétiques de type 2 et cliniquement correspondance des sujets non diabétiques, en nombre suffisant pour les études fondamentales et cliniques.

L&#39;isolement des îlots humains à partir des patients partiellement pancréatectomisés

Les îlots pancréatiques, également appelés îlots de Langerhans, sont un amas de cellules endocrines qui produisent des hormones pour la régulation du glucose et d’autres fonctions biologiques importantes. Ce protocole explique une méthode pour isoler les îlots pancréatiques en perfusant d’abord la collagénase via l’ampoule de Vater pour digérer le tissu pancréatique exocrine et une centrifugation simplifiée par gradient de densité pour purifier les îlots des souris.

Isolement des îlots pancréatiques par perfusion de collagénase : une méthode enzymatique pour isoler les cellules des îlots pancréatiques

Nous décrivons ici un protocole pour isoler les îlots intacts de souris néonatales. Pancreata ont été partiellement digéré avec de la collagénase, suivi d'un lavage et cueillette à la main. 20 - 80 amas d'îlots peuvent être obtenus par le pancréas de souris nouveau-nés, qui sont appropriés pour de nombreuses études d'îlots.

Isolation efficace des îlots fonctionnels de néonatales Pancréas souris

Ce protocole d'isolement d'îlots a décrit une nouvelle voie d'injection de collagène pour digérer le tissu d'exocrine et une procédure simplifiée de gradient pour purifier les îlots des souris. Il s'agit de la digestion enzymatique, de la séparation/purification des gradients et de la cueillette manuelle des islets. L'isolement réussi peut donner 250-350 îlots de haute qualité et entièrement fonctionnels par souris.

Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

Génie tissulaire du pancréas entier est un défi en raison de ses fonctions exocrines et endocrines. Nous montrons une méthode pour la dissection d’un pancréas de porc intact et le processus de DÉCELLULARISATION réussie par perfusion de détergents Triton X-100, désoxycholate de sodium et désoxyribonucléase.

Isolement et DÉCELLULARISATION d’un pancréas entier porcin

L’article vidéo résume la technique de pancréatectomie et d’allotransplantation du pancréas dans un modèle de survie porcine de 3 jours avec une description étape par étape de la méthode et l’accent mis sur les trucs et astuces chirurgicaux pour faire face à l’anatomie viscérale porcine précaire et délicate.

Trucs et astuces chirurgicaux pour effectuer une transplantation du pancréas porcin

Ici, nous fournissons des détails sur la réalisation de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS) par perfusion à travers le système vasculaire de souris avec un pancréas intact comme technique supplémentaire pour évaluer la fonction pancréatique endocrine avec réduction des facteurs de confusion possibles.

Sécrétion d’insuline stimulée par le glucose par perfusion à travers le système vasculaire de souris avec un pancréas intact

Cette étude a développé une méthode simplifiée pour extraire efficacement les îlots primaires fonctionnels et les cellules acinaires du pancréas de la souris, offrant un outil précieux pour étudier la communication intercellulaire dans la pathogenèse du diabète induit par la pancréatite aiguë.

Une méthode simple et rapide pour l’isolement simultané des îlots primaires et des cellules acinares pancréatiques primaires à partir de souris

Ce protocole décrit une méthode standardisée pour la prélèvement chirurgical, la digestion enzymatique et la purification par gradient de densité des îlots pancréatiques de rat Lewis, permettant des préparations à haut rendement et à haute pureté pour une utilisation directe dans des études de transplantation ou in vitro .

Isolement et purification des îlots pancréatiques à partir de rats de Lewis grâce à la digestion enzymatique et à la séparation par gradient de densité

Découvrez une méthode de perfusion chirurgicale pour isoler le pancréas porcin et obtenir des îlots pancréatiques de haute pureté. Cette technique optimise le rendement pour la recherche en xénotransplantation.

Perfusion chirurgicale et isolement du pancréas porcin pour l’isolement des îlots

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