Coloration rouge Picrosirius pour l’évaluation histopathologique semi-quantitative du dépôt de collagène dans des modèles murins de rejet chronique d’allogreffe pulmonaire
21 mars 2025
La coloration Picrosirius Red est une méthode semi-quantitative permettant d’évaluer objectivement le dépôt de collagène dans le remodelage fibrotique pulmonaire murin de manière spatialement résolue. Outre l’évaluation du dépôt total de collagène, la coloration rouge Picrosirius permet de différencier les fibres de collagène de différentes épaisseurs.
Notre recherche porte sur l’analyse du développement de la fibrose dans le rejet chronique d’une allogreffe pulmonaire. Nous nous intéressons donc aux méthodes qui caractérisent le compartiment du tissu fibreux. Pour reproduire les maladies liées à la transplantation, nous utilisons le modèle murin de transplantation d’un seul poumon que nous avons introduit il y a plusieurs années.
Dans ce modèle, il a été démontré que la transplantation d’un poumon entre des souches de souris allogéniques entraîne différents niveaux de fibrose du greffon. Les données histologiques sur le remodelage du tissu fibreux sont souvent présentées de manière qualitative. Notre méthode utilisant la coloration rouge Picrosirius offre l’avantage d’une évaluation semi-quantitative et différencie les fibres de collagène épaisses et fines.
Pour commencer, hydratez les échantillons de poumons de souris inclus dans de la paraffine en diminuant les concentrations d’éthanol pendant deux minutes chacun. Teintez la lame pendant huit minutes dans une solution d’hémalum de Meyer. Lavez la lame pendant 10 minutes sous l’eau courante du robinet, puis incubez la lame pendant une heure dans la solution Picrosirius Red.
Trempez la lame cinq à 10 fois dans une solution d’acide acétique à 0,5 %. Secouez doucement la lame pour retirer la solution. Maintenant, déshydratez la lame en augmentant les concentrations d’éthanol et de xylol à 100 % pendant cinq minutes chacune.
Ajoutez une goutte de milieu de montage sur l’échantillon pour l’enrobage et recouvrez d’une lamelle. Laissez les lames sécher sous une hotte. Au microscope optique, utilisez un logiciel d’imagerie approprié pour focaliser l’échantillon jusqu’à ce qu’une image claire et nette soit obtenue.
Ajustez le degré de polarisation du filtre jusqu’à ce que l’arrière-plan soit complètement sombre ou noir. Numérisez l’échantillon sous un grossissement de 20x et exportez les images au format TIFF. Transférez les images vers le logiciel Fidji.
Cliquez sur Modifier et sélectionnez Effacer l’extérieur. Cliquez ensuite sur Analyser puis sur Mesurer pour mesurer la surface totale. Pour mesurer la teneur totale en collagène par échantillon, cliquez sur Image, puis sur Ajuster et Seuil de couleur.
Réglez la teinte entre 2 et 130 et la luminosité entre 35 et 255. Cliquez ensuite sur Analyser et, dans la fenêtre Analyser les particules, définissez la taille sur 1 moins l’infini et cochez les cases Effacer et Résumer. Ajustez la teinte au rouge pour l’analyse des fibres de collagène épaisses et au jaune-vert pour les fibres de collagène minces, et mesurez le nombre total de collagène.
Enfin, cliquez sur Plugins, Macros et Enregistrer pour configurer la macro pour le traitement automatisé. Les colorations trichromes de Masson, d’Herovici et de Picrosirius Red ont illustré un dépôt important de collagène parabronchique et paravasculaire dans le modèle de désappariement du complexe majeur d’histocompatibilité. Le modèle mineur non apparié a principalement montré des infiltrats lymphocytaires denses avec un dépôt de collagène moins intense.
La coloration rouge Picrosirius avec un filtre polarisant a révélé un aspect vert des fibres déposées sur les deux modèles. Les contrôles d’isogreffe ont montré que le collagène était limité aux frontières parabronchiques et paravasculaires, comme les poumons murins naïfs. L’analyse d’images numériques a révélé une augmentation du collagène total dans les greffes pulmonaires non appariées du complexe majeur d’histocompatibilité par rapport aux greffons mineurs non appariés, au tissu pulmonaire naïf du côté droit ou aux poumons gauches BALB/c naïfs.
Aucune différence dans les fibres de collagène épaisses n’a été démontrée. L’analyse des fibres minces de collagène a montré une présence accrue dans le modèle majeur non apparié par rapport au modèle mineur non apparié, au tissu pulmonaire droit naïf ou aux poumons gauches BALB/c naïfs.
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Aperçu
Cette étude examine le développement de la fibrose dans le rejet chronique de greffe pulmonaire en utilisant un modèle de transplantation murine. La méthodologie principale repose sur la coloration au rouge de Picrosirius afin d'obtenir une évaluation semi-quantitative du dépôt de collagène, permettant ainsi de distinguer les fibres de collagène épaisses des fibres fines.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Rejet chronique de greffe pulmonaire
- Caractérisation du tissu fibrotique
- Modèles murins de transplantation
Contexte
- L’évaluation qualitative du remodelage fibrotique est courante, mais cette étude propose une approche plus quantifiable.
- Différents degrés de fibrose du greffon sont observés entre les souches de souris allogéniques.
- L’analyse histologique est essentielle pour comprendre la viabilité du greffon et la réponse tissulaire.
Méthodes utilisées
- Coloration au rouge picrosirius pour l'évaluation du collagène
- Modèle murin de transplantation pulmonaire
- Analyse numérique d'images à l'aide d'un logiciel spécialisé
Résultats principaux
- Augmentation du collagène total dans les greffes incompatibles au niveau du complexe majeur d'histocompatibilité par rapport aux greffes avec incompatibilité mineure.
- Les fibres de collagène fines étaient plus fréquentes dans les modèles avec incompatibilité majeure par rapport aux témoins.
- Aucune différence significative n'a été observée concernant les fibres de collagène épaisses entre les différentes conditions.
Conclusions
- Cette étude démontre l'efficacité de la coloration au rouge picrosirius pour évaluer les modifications fibrotiques dans les greffes pulmonaires.
- Les résultats sont pertinents pour comprendre le rejet de greffe et la fibrose en biologie des transplantations.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
L'évaluation quantitative de la fibrose constitue un défi majeur dans les modèles précliniques de rejet chronique de greffe pulmonaire, ayant un impact direct sur la fiabilité prédictive de la recherche translationnelle. La coloration au rouge picrosirius permet une évaluation semi-quantitative du dépôt de collagène, contribuant à l'analyse mécanistique et à la validation de cibles thérapeutiques dans les modèles de maladies fibrotiques. Cette approche améliore la prise de décision stratégique en fournissant des données reproductibles et spatialement résolues sur le remodelage tissulaire.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'analyse des voies fibrotiques et la quantification du remodelage du collagène dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Facilite la détection biologique des risques en distinguant les fibres de collagène épaisses des fibres fines dans les tissus d'allogreffe.
- Renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles pour les stratégies anti-fibrosantes.
Développement de tests et criblage
- Prépare des critères d'évaluation histopathologiques validés pour le criblage de composés en aval dans des modèles murins.
- Standardise la mesure semi-quantitative du collagène afin d'assurer la reproductibilité entre les études.
- Permet des flux de travail d'analyse d'images numériques évolutifs pour des résultats d'essais quantitatifs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne la quantification préclinique de la fibrose avec le développement de biomarqueurs translationnels dans la recherche sur la transplantation pulmonaire.
- Assure une continuité entre les études mécanistiques à stade de découverte et la validation préclinique d'interventions anti-fibrosantes.
- Permet des décisions d'orientation pondérées par le risque en quantifiant la gravité du remodelage tissulaire.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'intègre à la continuité découverte-préclinique en permettant une quantification robuste de la fibrose dans les modèles de greffes pulmonaires allogéniques murines.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses sur le remodelage fibrotique et l'implication des voies dans le rejet chronique.
- Criblage : Fournit des mesures quantitatives reproductibles du collagène pour le développement d'essais et l'évaluation de composés.
- Analytique : Fournit des résultats d'analyse d'images numériques permettant la comparaison statistique de groupes expérimentaux.
- Recherche translationnelle : Relie les critères de fibrose précliniques à des stratégies potentielles de biomarqueurs cliniques.
- Réutilisation en entreprise : Met en place un flux de travail standardisé et réutilisable pour l'évaluation de la fibrose dans plusieurs modèles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la recherche sur la fibrose.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité de l'analyse histopathologique.
- Valeur stratégique : Permet de mieux prendre des décisions d'orientation (go/no-go) et d'optimiser l'efficacité du capital en fournissant des critères d'évaluation quantitatifs solides.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats et modèles anti-fibrosants.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en histopathologie et en analyse d'images numériques.
- Requiert un accès à un microscope, à des filtres de polarisation et à un logiciel de traitement d'images (par exemple, Fiji).
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de coloration et d'analyse.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les types de tissus ou les modèles animaux.
- Les limites potentielles incluent la variabilité de l'intensité de la coloration et du seuil d'image.
