Name: Coloration rouge Picrosirius pour l’évaluation histopathologique semi-quantitative du dépôt de collagène dans des modèles murins de rejet chronique d’allogreffe pulmonaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T12:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 42 s
Description: Découvrez la coloration rouge Picrosirius pour évaluer semi-quantitativement le dépôt de collagène dans des modèles murins de rejet chronique d'allogreffe pulmonaire. Cette méthode différencie les fibres épaisses et fines pour caractériser la fibrose.

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Tous les protocoles sur les animaux sont conformes aux principes éthiques des 3R pour une recherche animale sans cruauté et ont été approuvés par le comité d’éthique vétérinaire local (Veterinäramt Kanton Zürich, Suisse, numéro d’étude 45/2014). De même, les lecteurs doivent obtenir l’autorisation des institutions compétentes avant d’effectuer toute procédure sur des animaux de laboratoire.
1. Acquisition d’échantillons
<ol>
	<li>Mener des expériences sur des animaux en fonction des besoins individuels et des approbations éthiques respectives. Un seul microchirurgien effectue toutes les interventions chirurgicales sans temps d’ischémie prolongé supplémentaire. REMARQUE : Pour une reproduction de nos résultats représentatifs, procurez-vous des souris adultes mâles C57BL/6J, C57BL/10J et BALB/c de 27 à 30 g provenant des Laboratoires Charles River. Pour les isogreffes, utilisez des animaux C57BL/6J comme donneurs et receveurs. Dans le modèle légèrement incompatible, transplantez des poumons de donneurs C57BL/10J à des receveurs C57BL/6J. Dans le modèle principal non apparié, transplanter des poumons de donneur BALB/c à des receveurs C57BL/6J et injecter postopératoirement de la cyclosporine (10 mg/kg/jour) et de la méthylprednisolone (1,6 mg/kg/jour) par voie sous-cutanée tous les jours5. Utilisez une solution saline pour la perfusion et récupérez les poumons après 8 semaines (56 jours).</li>
	<li>Pour l’euthanasie, intubez l’animal avec un cathéter de 20G et aérez-le avec de l’O2 complété par 2 à 3 % d’isoflurane. Confirmer une profondeur suffisante de l’anesthésie par l’absence de réponse à un pincement de la patte.</li>
	<li>Effectuez une laparosténotomie médiane en incisant la paroi abdominale avec des ciseaux chirurgicaux et en coupant la longueur du sternum pour exposer le cœur. Identifiez la veine cave inférieure et l’appendice auriculaire gauche par leur emplacement anatomique.</li>
	<li>En succession rapide, coupez la veine cave inférieure et l’appendice auriculaire gauche avec des ciseaux chirurgicaux et perfuser l’animal avec 3 à 5 ml de NaCl à 0,9 % à travers la racine de l’artère pulmonaire avec une seringue pour éliminer tout le sang de la circulation pulmonaire. REMARQUE : L’euthanasie doit être pratiquée conformément à l’approbation éthique respective. D’autres méthodes peuvent également être appliquées. Il est recommandé d’éliminer complètement le sang de la circulation pulmonaire, ce qui peut également être effectué par perfusion après un arrêt circulatoire.</li>
	<li>Retirez les poumons perfusés à l’aide de ciseaux.</li>
	<li>Pour la conservation, incubez les échantillons dans du formol à 4 %. Injectez la solution de formol directement dans les bronches et le système vasculaire pulmonaire. Immergez les échantillons dans du formol et laissez-les incuber pendant au moins 6 h. REMARQUE : Pour le gonflage du poumon avec du formol, une procédure standardisée doit être appliquée pour obtenir des résultats comparables. Des exemples de protocoles pour de telles procédures sont publiés ailleurs10,11.</li>
	<li>Taillez l’orgue selon les besoins expérimentaux. Coupez transversalement les poumons en deux pour capturer toutes les parties de l’arbre bronchique en une section.</li>
	<li>Transférez les échantillons vers un processeur automatique de tissus pour la déshydratation dans la séquence alcoolique, en les éclaircissant dans un enrobage de xylol et de paraffine comme suit : 70 % d’éthanol, 70 % d’éthanol, 80 % d’éthanol, 96 % d’éthanol, 100 % d’éthanol (1 h chacun), 100 % d’éthanol, 100 % d’éthanol, de xylol (2 h chacun), de xylol (1 h) et de paraffine 3 fois pendant 2 h.</li>
	<li>Faites fondre la paraffine et incorporez des échantillons dans le bon sens dans des cassettes d’enrobage de polyoxyméthylène. Prenez soin d’encastrer les échantillons avec la surface coupée vers le bas. À l’aide d’un microtome rotatif, coupez des sections de 5 μm consécutives. Laissez sécher les lames pendant 24 h à 37 °C avant de poursuivre le traitement.</li>
</ol>
2. Déparaffinisation et hydratation des lames de paraffine
<ol>
	<li>Retirez la paraffine en incubant les échantillons 2x dans du xylol à 100 % pendant 5 min chacun. ATTENTION : Le xylol est inflammable et dangereux pour la santé. Utiliser uniquement sous la hotte.</li>
	<li>Hydratez les échantillons dans 100 % d’éthanol, 100 % d’éthanol, 95 % d’éthanol, 70 % d’éthanol et 50 % d’éthanol pendant 2 minutes chacun. Ensuite, laver pendant 2 min dans de l’eau distillée.</li>
</ol>
3. Coloration au rouge Picrosirius
<ol>
	<li>Tache en lames pendant 8 min dans la solution d’hémalum de Meyer. Lavez les lames pendant 10 minutes sous l’eau courante du robinet.</li>
	<li>Incuber les lames pendant 1 h dans la solution Picrosirius Red. Pour une solution de Picrosirius Red, utilisez soit une solution de coloration prémélangée, soit utilisez 0,1 % de Direct Red 80 ou de Sirius Red F 3B (CI 35780) dilué dans de l’acide picrique saturé. ATTENTION : L’acide picrique est inflammable et hautement explosif et doit être traité avec soin. REMARQUE : Il existe de nombreux fournisseurs différents pour les kits de coloration Picrosirius Red disponibles, comme indiqué dans le tableau des matériaux. Soyez conscient des différences de prix et de méthodes de coloration, et respectez toujours les instructions des fournisseurs. Il est recommandé de n’utiliser que des kits de coloration avec l’indice de couleur spécifique pour Sirius Red F 3B (CI 35780).</li>
	<li>Trempez les lames 5x-10x dans une solution d’acide acétique (0,5 %). Secouez doucement les lames pour retirer physiquement la solution.</li>
	<li>Déshydratez les lames dans 95 % d’éthanol, 100 % d’éthanol, 100 % d’éthanol, 100 % de xylol et 100 % de xylol pendant 5 minutes chacune.</li>
	<li>Intégrez en ajoutant une goutte de support de montage sur chaque échantillon et recouvrez d’une lamelle. Laissez sécher les lames sous une hotte.</li>
</ol>
4. Numérisation et traitement de l’image
<ol>
	<li>Focalisez les échantillons au microscope optique avec un logiciel d’imagerie approprié jusqu’à ce que l’image devienne claire et nette. Ajoutez un filtre polarisant et ajustez le degré de polarisation jusqu’à ce que l’arrière-plan soit complètement sombre ou noir. Lorsque l’arrière-plan est aussi sombre que possible, la polarisation correcte est obtenue. REMARQUE : Il est également possible de visualiser la coloration Picrosirius Red avec une lumière transmise conventionnelle et sans filtre polarisant. À cette fin, il est recommandé d’utiliser Sirius Red avec Fast Green, car il s’est avéré plus sensible que Sirius Red seul 12,13. Cependant, la microscopie polarisante est nécessaire pour distinguer les fibres de collagène épaisses et fines.</li>
	<li>Numérisez tous les échantillons complètement sous un grossissement de 20x et exportez-les comme .tiff. Transfert vers le logiciel Fidji14. Assurez-vous de bien nettoyer les lames à l’avance et d’utiliser des paramètres normalisés concernant le temps d’exposition et l’intensité de la source lumineuse.</li>
	<li>Entourez l’échantillon manuellement et découpez-le dans le logiciel à l’aide de Modifier &gt; Effacer l’extérieur. Mesurez la surface totale en cliquant sur Analyser &gt; Mesurer. REMARQUE : La sélection du compartiment à mesurer est une étape critique dans la création de résultats fiables et comparables. En numérisant et en sélectionnant l’ensemble de l’échantillon, une bonne section transversale est affichée et les tissus hétérogènes sont considérés comme un tout. Cependant, il est également possible de se limiter à des zones spécifiques des échantillons, telles que la plèvre ou les bronches individuelles. Gardez à l’esprit de toujours sélectionner les compartiments à comparer de manière standardisée. Si les échantillons présentent une grande variabilité de la ventilation, il est conseillé d’exclure la zone de l’espace aérien du compartiment analysé15.</li>
	<li>Mesurez la teneur totale en collagène par échantillon à l’aide du seuil de couleur en cliquant sur Image &gt; Ajuster &gt; seuil de couleur et ajustez les paramètres en cliquant sur Analyser &gt; Analyser les particules. Définir la taille = 1 - Infini, Effacer, Résumer. Luminosité = 35 - 255. Teinte = 2 - 130 REMARQUE : Un réglage raisonnable des seuils de couleur est essentiel pour obtenir des résultats fiables.</li>
	<li>Répétez l’opération pour les fibres de collagène épaisses et fines en ajustant la teinte comme les fibres de collagène épaisses rouges <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66395/66395eq01.jpg" style="margin: auto;"> (teinte 2-30) et les fibres de collagène minces jaune-vert <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66395/66395eq01.jpg" style="margin: auto;"> (teinte 31-130). Le résultat sera la zone des pixels tachés.</li>
	<li>Configurez la macro pour le traitement automatisé en cliquant sur Plug-ins &gt; Macros &gt; Enregistrer et répéter l’opération avec tous les échantillons.</li>
	<li>Pour obtenir des valeurs finales normalisées en fonction de la surface de la section efficace, divisez la surface des pixels colorés pour tous les paramètres par la surface totale mesurée aux étapes 4.3 et 4.5 pour chaque échantillon, respectivement.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Évaluation du collagène dans la fibrose pulmonaire murine à l’aide de la coloration rouge Picrosirius

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<li>vander Ploeg, E. A., Melgert, B. N., Burgess, J. K., Gan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+biomarkers+of+fibrosis+in+chronic+lung+allograft+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Rev+%28Orlando%29%22%5BJournal%5D)">The potential of biomarkers of fibrosis in chronic lung allograft dysfunction.</a> Transplant Rev (Orlando). 35 (3), 100626(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Acide acétique</td><td>Honeywell, Charlotte, États-Unis</td><td>33209</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer</td><td>Zeiss, Oberkochen, Allemagne</td><td>4633000956 (numéro de série)</td><td></td></tr><tr><td>Lamelle 1.5</td><td>Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>KCY5.1</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde 37 %</td><td>Fisher Scientific, Leicestershire, Royaume-Uni</td><td>F/1501/PB15</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hémalum de Meyer</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>109249</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red Solution</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, Allemagne</td><td>13422</td><td>alternatives pouvant être utilisées : ab150681, abcam, Cambridge, Royaume-Uni ; SRS250 ScyTek Laboratories, Logan City US</td></tr><tr><td>Filtre polarisant</td><td>Zeiss, Oberkochen, Allemagne</td><td>000000-1121-813</td><td></td></tr><tr><td>Microtome rotatif, HistoCore AUTOCUT</td><td>Leica, Wetzlar, Allemagne</td><td>149AUTO00C1, 14051956472</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Histokitt support de montage</td><td>Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Plast Paraffin</td><td>Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>6642.5</td><td></td></tr><tr><td>Cassettes d’enrobage Rotilabo, POM</td><td>Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>K113.1</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscope à adhérence</td><td>epredia de lames, Portsmouth, Royaume-Uni</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Processor&nbsp ;</td><td>Leica, Wetzlar, Allemagne</td><td>TP 1020</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji software version 2.14.0/1.54f</td> Open <td>Source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Software ZEN 3.4.91</td><td>Zeiss, Oberkochen, Allemagne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

coloration rouge picrosirius pour l’évaluation histopathologique semi-quantitative du dépôt de collagène dans des modèles murins de rejet chronique d’allogreffe pulmonaire

Picrosirius Red Staining for Semiquantitative Histopathologic Evaluation of Collagen Deposition in Murine Models of Chronic Lung Allograft Rejection

Le protocole décrit ci-dessus permet une évaluation semi-quantitative objective du dépôt de collagène dans le tissu pulmonaire murin. Le remodelage fibrotique est la marque physiopathologique du rejet chronique après une transplantation pulmonaire. Par conséquent, la coloration Picrosirius Red a été appliquée dans des modèles de rejet d’allogreffe pulmonaire chronique à l’aide d’une transplantation pulmonaire orthotopique murine gauche. La transplantation pulmonaire majeure non compatible avec le CMH d’un donneur BALB/c ...

Coloration rouge Picrosirius pour l’évaluation histopathologique semi-quantitative du dépôt de collagène dans des modèles murins de rejet chronique d’allogreffe pulmonaire

Fibrosis is the pathophysiologic hallmark of chronic rejection after lung transplantation and the foremost hurdle to long-term recipient survival. Several ...

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Cette vidéo décrit la coloration rouge picrosirius des tissus fibrotiques pour détecter un dépôt excessif de collagène dans les coupes de tissu fibreux. La technique de coloration permet d’évaluer l’expression du collagène dans les maladies du tissu conjonctif.

Coloration polarisée rouge Picrosirius : une technique pour détecter la fibrose dans les coupes de tissu cardiaque à l’aide de la microscopie à fond clair

Ici, nous présentons un protocole pour étudier l’immunologie du rejet. Le modèle chirurgical présenté fait état d’une durée opératoire courte et d’une technique concise. Selon la combinaison de souche donneur-receveur, le rein transplanté peut développer un rejet cellulaire aigu ou des lésions chroniques de l’allogreffe, définies par une fibrose interstitielle et une atrophie tubulaire.

Souris Transplantation rénale: Les modèles de rejet des allogreffes

Streptococcus pneumoniae forme des lésions microscopiques discrètes non purulentes dans le cœur. Le protocole pour un modèle murin de formation de microlésions cardiaques est décrit. Des instructions sont fournies sur la visualisation des microlésions à l’aide de la microscopie, la discrimination entre les microlésions précoces et tardives et les méthodes de détection du remodelage cardiaque dans le cœur des animaux convalescents.

Visualisation des<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Dans les microlésions cardiaques et le remodelage cardiaque ultérieur

Le but de cette étude était de développer un modèle murin de la cicatrisation des brûlures. Une brûlure thermique a été induite sur la peau dorsale des souris à l’aide d’un modèle de laiton préchauffé. Le tissu brûlé a été débrided et recouvert d’une greffe de peau récoltée à partir de la queue d’une souris de donneur génétiquement similaire.

Un modèle murine d’une blessure de brûlure reconstruite avec une greffe de peau allogénique

Ce protocole décrit une méthode permettant d’établir un modèle murin de silicose par exposition répétée à des suspensions de silice par écoulement nasal. Ce modèle peut imiter de manière efficace, pratique et flexible le processus pathologique de la silicose humaine avec une répétabilité et une économie élevées.

Un modèle murin de silicose établi par inhalation répétée de poussière de silice cristalline

Nous avons établi un modèle murin de fibrose hépatique chronique, qui fournit un modèle animal approprié pour l’étude mécaniste de la fibrose hépatique induite par le virus de l’atrésie biliaire (AB) et une plate-forme pour les futurs traitements de l’AB.

Un modèle murin de fibrose hépatique chronique pour l’étude de l’atrésie biliaire

Ici, nous présentons un protocole d’imagerie intravitale du poumon gauche de souris transplantée à l’aide de la microscopie à deux photons. Il s’agit d’un outil précieux pour étudier la dynamique cellulaire et les interactions en temps réel après une transplantation pulmonaire murine.

Microscopie intravitale à deux photons du poumon de souris transplanté

Modèle murin de maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) avec dysfonctionnement métabolique, modifications de l’expression génique hépatique et altérations histopathologiques hépatiques ressemblant à la MASLD humaine, y compris une fibrose qui progresse vers le stade 3 de fibrose avancée. Ce modèle peut être utilisé dans les études de physiopathologie du MASLD et dans les études précliniques de nouvelles thérapies.

Modèle murin de maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique avec fibrose

Ce protocole décrit une méthode pour induire une fibrose pulmonaire chez la souris par l’administration oropharyngée répétée de bléomycine, produisant des caractéristiques pathologiques ressemblant étroitement à celles de la fibrose pulmonaire idiopathique.

Modèle murin raffiné de fibrose pulmonaire idiopathique

Avant de tenter la chirurgie, un nouveau chirurgien doit avoir une formation de base en techniques chirurgicales et des concepts. Cet article présente les considérations chirurgicales de base avec un accent sur les rongeurs.

Principes de la chirurgie des rongeurs pour le nouveau chirurgien

Découvrez la coloration rouge Picrosirius pour évaluer semi-quantitativement le dépôt de collagène dans des modèles murins de rejet chronique d'allogreffe pulmonaire. Cette méthode différencie les fibres épaisses et fines pour caractériser la fibrose.

Coloration rouge Picrosirius pour l’évaluation histopathologique semi-quantitative du dépôt de collagène dans des modèles murins de rejet chronique d’allogreffe pulmonaire (Vidéo) | JoVE Journal

Coloration rouge Picrosirius pour l’évaluation histopathologique semi-quantitative du dépôt de collagène dans des modèles murins de rejet chronique d’allogreffe pulmonaire

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