Name: Analyses des infections des cellules épithéliales avec Shigella (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: Découvrez les tests d'infection pour étudier l'adhérence, l'invasion et la réplication intracellulaire de Shigella dans des lignées épithéliales in vitro. Ces méthodes aident à développer des thérapeutiques efficaces contre les infections à Shigella.

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Le soutien aux auteurs comprend le département de pédiatrie du Massachusetts General Hospital, la subvention 2022A009041 du Comité exécutif sur le financement provisoire du soutien à la recherche, la subvention R21AI146405 de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses et la subvention de l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales Centre de recherche sur la nutrition et l’obésité à Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Protocoles d’analyse de l’infection à Shigella dans les cellules épithéliales du côlon

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Ce protocole décrit un ensemble de trois tests standardisés pour étudier l’adhérence, l’invasion et la réplication intracellulaire de Shigella des cellules épithéliales intestinales. Bien que ces méthodes ne soient que des versions modifiées des tests classiques de gentamicine utilisés pour étudier l’invasion et la réplication intracellulaire de divers agents pathogènes bactériens dans les cellules hôtes 49,50,51, des considérations particulières doivent être appliquées lors de l’étude de Shigella.
Les Shigella sont des anaérobies facultatifs, qui se développent de manière optimale à 37 °C dans un milieu riche avec une aérationde 43. Lors de la réalisation de ces tests pour interroger les effets de différents signaux environnementaux ou métabolites sur les infections à Shigella, il est recommandé de cultiver Shigella dans un milieu riche pendant la nuit, puis de sous-cultiver dans un milieu défini ou complété jusqu’à la phase mi-log avant l’infection. L’expression maximale des gènes de virulence se produit pendant la phase logarithmique de croissance52,53. Ainsi, la sous-culture de cultures de Shigella pendant la nuit et la croissance bactérienne en phase exponentielle (OD600 ~ 0,7) sont des étapes nécessaires pour évaluer correctement la virulence de Shigella. De plus, l’expression des gènes de virulence dépend de la température. Pour garantir la spécificité de l’expression uniquement lors de l’infection de l’hôte, les gènes de virulence sont induits à des températures physiologiques de l’hôte (37 °C) et strictement réprimés à des températures plus basses (par exemple, 30 °C)54. Pour assurer l’expression des gènes de virulence, la sous-culture bactérienne et les infections doivent être effectuées à 37 °C, avec les précautions appropriées pour s’assurer que la température ne descend pas en dessous de 37 °C. Un grand plasmide de virulence de 220 kilobases, qui code pour la machinerie moléculaire nécessaire à l’invasion et à l’infection des cellules épithéliales, est un déterminant essentiel de la virulence pour tous les Shigella spp5. Le passage répété et la croissance prolongée à 37 °C favorisent l’instabilité plasmidique de virulence, entraînant une perte de plasmide et rendant les cellules de Shigella avirulentes55. Pour assurer le maintien du plasmide de virulence et l’expression des gènes de virulence cruciaux, il est recommandé de réintroduire les bactéries directement des stocks de congélation toutes les deux semaines sur des plaques indicatrices TSB + Congo rouges fraîches. La gélose rouge du Congo peut être utilisée pour différencier les colonies virulentes de type sauvage (rouge, CR+) et les colonies avirulentes (blanches, CR-) qui ont perdu le plasmide de virulence45. Si une instabilité plasmidique de virulence est observée à plusieurs reprises, des cultures de nuit de Shigella peuvent être incubées à 30 °C pour éviter la perte de plasmide de virulence, suivies d’une sous-culture à 37 °C pour favoriser l’expression du gène de virulence43. Enfin, si des analyses avec des mutants et/ou des souches complémentaires sont effectuées, dans lesquelles des marqueurs antibiotiques sont présents dans ces souches bactériennes, il est recommandé d’utiliser la sélection d’antibiotiques appropriée pendant les étapes de nuit bactérienne et de sous-culture.
L’utilisation de monocouches épithéliales HT-29 présente de nombreux avantages pour étudier les mécanismes moléculaires de la pathogenèse de Shigella in vitro. Shigella étant un agent pathogène adapté à l’homme, les modèles de petits animaux ne reflètent pas avec précision la pathogenèse caractéristique de la shigellose observée chez l’homme36. Ainsi, l’utilisation de protocoles standardisés pour l’infection de lignées cellulaires d’origine humaine permet l’interrogation quantitative des étapes individuelles de la pathogenèse bactérienne afin de caractériser l’interaction moléculaire entre cet agent pathogène et son hôte natif. Historiquement, les cellules HeLa étaient principalement utilisées pour étudier les interactions hôte-pathogène in vitro 25,56,57. Cependant, les cellules HeLa sont une lignée cellulaire immortalisée du cancer du col de l’utérus, qui sont des cellules hôtes non natives pour les agents pathogènes bactériens entériques. Ainsi, les études in vitro de la pathogenèse entérique se sont déplacées vers l’utilisation de lignées cellulaires d’adénocarcinome colique (par exemple, HT-29, Caco-2 et T84), qui récapitulent plus fidèlement la morphologie épithéliale intestinale, et peuvent être cultivées sur des transwells en tant que monocouches épithéliales avec des surfaces apicales et basolatérales différenciées 58,59,60. Bien que chaque lignée cellulaire ait ses forces et ses faiblesses individuelles, les cellules HT-29 sont utilisées dans les tests décrits ici en raison des similitudes phénotypiques avec les entérocytes intestinaux et de l’expression robuste des récepteurs de surface cellulaire et des cytokines pro-inflammatoires 58,59,61. Cependant, chacun de ces modèles discutés sont des lignées cellulaires dérivées du cancer avec des phénotypes métaboliques et de croissance aberrants qui ne représentent pas avec précision l’état physiologique naturel de l’épithélium colique in vivo58. Les progrès récents des techniques de culture de tissus humains ont permis de cultiver des cellules souches intestinales humaines, obtenues à partir de biopsies tissulaires, en organoïdes ou en monocouches cellulaires bidimensionnelles uniques qui récapitulent les différents types de cellules présentes dans le tractus gastro-intestinal (GI) humain 62,63,64. Les organoïdes intestinaux peuvent être différenciés pour inclure les entérocytes, les cellules caliciformes productrices de mucus, les cellules M et d’autres types de cellules spécifiques aux tissus. Des études récentes ont validé l’utilisation de ces modèles organoïdes pour étudier les agents pathogènes entériques, y compris divers pathovars de Shigella spp., Salmonella enterica et Escherichia coli 62,63,64. Bien que les organoïdes soient des modèles plus précis de l’épithélium gastro-intestinal humain et puissent même être cultivés dans des conditions nutritionnelles variées pour représenter la population mondiale65, leur complexité relative nécessite une formation et une expertise technique importantes, ce qui entraîne des coûts plus élevés et des temps de culture plus longs par rapport aux lignées cellulaires cancéreuses traditionnelles58.
Ce protocole décrit les méthodes à débit moyen, dans lesquelles deux plaques à 6 puits sont utilisées pour un total de 12 monocouches disponibles pour les tests. Cependant, les expériences peuvent facilement être mises à l’échelle pour augmenter le nombre de monocouches ensemencées afin d’accueillir des répétitions techniques supplémentaires, ou de tester des mutants Shigella et des signaux environnementaux supplémentaires. Les plaques de culture tissulaire avec plus de puits (par exemple, des plaques de 12 ou 24 puits) peuvent également être utilisées avec les ajustements appropriés pour tenir compte des puits de plus petit diamètre. Dans les conditions de croissance du HT-29 décrites à l’étape 3.2, les titres de HT-29 sont suffisants pour ensemencer environ six plaques de 6 puits après la culture à partir d’un flacon T75, avec suffisamment de cellules restantes pour maintenir la culture cellulaire du HT-29. De plus, les étapes d’ensemencement des monocouches HT-29 et de préparation des bactéries inoculées sont identiques entre les tests d’adhérence bactérienne, d’invasion et de réplication intracellulaire. Ainsi, des tests testant les mêmes souches de Shigella ou les mêmes conditions de sous-culture peuvent facilement être effectués en parallèle pour examiner simultanément le rôle de chaque condition expérimentale dans les différentes étapes de l’infection à Shigella .
Les titres de récupération pour les bactéries adhérentes (étape 4), envahies (étape 5) et intracellulaires (étape 6) sont déterminés par des dilutions en série de cellules HT-29 infectées après la lyse, ce qui permet une évaluation quantitative de l’efficacité de chaque stade de l’infection à Shigella. Les étapes de centrifugation dans les tests d’invasion et de réplication intracellulaire, basées sur les tests classiques 49,50,51, favorisent le contact bactérien avec les cellules hôtes pour une invasion immédiate et augmentent les taux d’invasion. Ainsi, la centrifugation « saute » l’étape d’adhérence, qui s’est avérée plus tard être un aspect important de l’infection à Shigella 17,18,19,66. Il est essentiel de noter que l’étape de centrifugation ne peut pas être réalisée avec des cellules épithéliales polarisées ensemencées sur des puits transversaux. Pour le test d’observance, cependant, l’adhérence n’est pas forcée par centrifugation, et aucune gentamicine n’est ajoutée aux cellules HT-29 infectées avant la lyse, permettant ainsi le dénombrement des cellules bactériennes adhérentes. Le volume du milieu de culture tissulaire est réduit à 1 mL (contre 2 mL pour les tests d’invasion et de réplication intracellulaire) pour permettre un contact plus efficace des bactéries avec les cellules HT-29. De plus, selon le taux d’adhérence, une certaine invasion et réplication intracellulaire peut se produire pendant les 3 heures d’incubation, mais la quantité est généralement négligeable (par exemple, seulement 0,05 % de la population bactérienne récupérée après la lyse de la cellule hôte). Néanmoins, pour tenir compte correctement des bactéries adhérentes par rapport aux bactéries intracellulaires pendant l’incubation de 3 heures, il est recommandé d’effectuer des essais parallèles, où, en plus du protocole indiqué, une deuxième plaque est incubée avec 50 μg/mL de gentamicine dans 2 mL de DMEM par puits pendant 45 min au total (15 min d’incubation, lavage, DMEM frais + gentamycine pendant 30 min) pour lyser complètement les bactéries extracellulaires. Après la lyse des cellules HT-29 comme indiqué dans le protocole, les bactéries intracellulaires peuvent être énumérées comme indiqué ci-dessus et représenteront le nombre de bactéries qui ont envahi. Cette valeur peut ensuite être soustraite des bactéries dénombrées de la plaque sans traitement à la gentamicine pour déterminer correctement les bactéries adhérentes et envahies. Des analyses parallèles peuvent également être effectuées pour mieux comprendre la réplication intracellulaire de Shigella à l’intérieur des cellules HT-29 après l’invasion, par exemple en utilisant plusieurs points temporels pour effectuer des courbes de croissance intracellulaires. Enfin, en plus de dénombrer les bactéries intracellulaires après une incubation de gentamicine de 18 heures, les surnageants de culture peuvent être collectés et analysés pour la sécrétion de cytokines des cellules HT-29 infectées. Par exemple, l’IL-8 est une chimiokine sécrétée par les cellules épithéliales qui fonctionne en grande partie pour recruter des PMN sur le site de l’infection. La quantité d’IL-8 sécrétée dans les milieux de culture des cellules HT-29 infectées peut être analysée à l’aide d’un test ELISAIL-8 67.
Les sels biliaires se sont avérés être un signal de virulence important pour Shigella pendant le transit dans le système gastro-intestinal humain et peuvent être utilisés pour compléter les milieux de croissance bactérienne dans ces protocoles afin de reproduire les conditions gastro-intestinales typiques. Naturellement, les sels biliaires sont introduits dans le duodénum ou la partie supérieure de l’intestin grêle pour faciliter la digestion ; et dans l’iléon terminal ou l’extrémité de l’intestin grêle, 95 % des sels biliaires sont éliminés et recyclés dans la circulation pour un dépôt final dans la vésicule biliaire68. Les sels biliaires ont généralement une concentration comprise entre 0,2 % et 2,0 % (p/v) dans l’intestin grêle et sont naturellement bactéricides. Cependant, Shigella, comme la plupart des bactéries entériques, résiste aux sels biliaires et utilise les signaux pour augmenter l’infection47. Plusieurs études ont documenté comment l’exposition aux sels biliaires, parfois en conjonction avec d’autres signaux intestinaux grêles comme le glucose, affecte la survie de Shigella et la régulation de la virulence avant l’infection. Il a été démontré que Shigella résiste aux sels biliaires, modifie l’expression des gènes et forme et disperse un biofilm dans des conditions qui reproduisent le transit intestinal grêle 17,69. Les études ont démontré que ces changements entraînent un phénotype hypervirulent, dans lequel l’adhérence et l’invasion sont induites lors d’une infection colique ultérieure par Shigella 17,18,19,48,66. Ainsi, les conditions décrites ci-dessus documentent comment sous-cultiver Shigella dans des sels biliaires pour imiter le transit intestinal grêle avant d’effectuer les tests d’adhérence, d’invasion ou de réplication intracellulaire. La formulation TSB spécifiée contient du glucose ajouté par rapport au bouillon Luria typique (LB)17. Ainsi, si LB est utilisé, il est important de compléter également le milieu avec du glucose (0,5 % à 2,0 % [p/v]) pour tenir compte de manière appropriée des signaux de glucose dans l’intestin grêle17. De plus, comme mentionné ci-dessus, toutes les sous-cultures de Shigella sont lavées pour éliminer les sels biliaires et imiter la transition vers le côlon pour les analyses d’infection.
Traditionnellement, et comme le soulignent les résultats ci-dessus (Figure 1 et Figure 2), les tests d’infection sont utiles pour déterminer le rôle d’un gène particulier dans l’infection à Shigella . Le phénotype des différents mutants, cependant, peut ne pas être vraiment apprécié sans une supplémentation appropriée du milieu de culture bactérienne. Comme l’ont démontré des recherches antérieures, les sels biliaires modifient considérablement l’expression des gènes de S. flexneri , y compris les gènes du métabolisme central, les facteurs de transcription, les transporteurs de sucre, la résistance aux médicaments et les gènes de virulence codés sur le chromosome ou le plasmide de virulence17. Ces gènes donnent un aperçu de la façon dont Shigella utilise les sels biliaires comme signal pour modifier l’expression des gènes et se préparer à une éventuelle infection du côlon, et des analyses mutationnelles ultérieures doivent donc être effectuées dans le milieu de croissance bactérienne supplémenté approprié avant d’examiner les effets sur la virulence dans les tests d’adhérence, d’invasion et de réplication intracellulaire. Comme on le voit ci-dessus dans les figures 1 et 2, la mutation ΔVF n’a pas affecté l’observance mais a affecté l’invasion et la réplication intracellulaire. Étant donné que la mutation a amélioré l’invasion et la réplication intracellulaire, des expériences sont actuellement en cours pour déterminer comment le produit génique régule l’infection. Les analyses mutantes servent d’exemple de la façon dont de nouvelles connaissances sur la pathogenèse de Shigella peuvent être étudiées, en particulier dans des conditions qui reproduisent mieux le tractus gastro-intestinal humain. Des analyses de complémentation appropriées sont recommandées pour valider les phénotypes des différents mutants.
Ensemble, ces procédures décrivent des expériences quantitatives qui fourniront des informations importantes sur les mécanismes moléculaires de l’adhérence, de l’invasion et de la réplication de Shigella à l’intérieur des cellules épithéliales du côlon HT-29 en imitant au mieux l’environnement naturel du tractus gastro-intestinal humain pendant l’infection. Des études futures peuvent développer les mutants et les conditions expérimentales pour mieux comprendre comment Shigella se prépare et infecte efficacement les hôtes humains. Malgré des décennies de recherche, il reste encore beaucoup à découvrir sur l’infection à Shigella.

Les maladies diarrhéiques causées par des bactéries pathogènes entériques constituent un fardeau important pour la santé mondiale. En 2016, les maladies diarrhéiques étaient responsables de 1,3 million de décès dans le monde et étaient la quatrième cause de décès chez les enfants de moins de cinq ans 1,2. Shigella, un pathogène bactérien entérique à Gram négatif, est l’agent causal de la shigellose, une cause majeure de décès diarrhéiques dans le monde3. La shigellose provoque une morbidité et une mortalité importantes chaque année chez les enfants des pays à revenu faible et intermédiaire 4,5, tandis que les infections dans les pays à revenu élevé sont liées aux épidémies d’origine alimentaire et hydrique dans les garderies 6,7,8,9. L’inefficacité de la mise au pointde vaccins 10 et l’augmentation des taux de résistance aux antimicrobiens (RAM)11,12 ont compliqué la gestion des épidémies de Shigella à grande échelle. Des données récentes des Centers for Disease Control and Prevention montrent que près de 46 % des infections à Shigella aux États-Unis présentaient une résistance aux médicaments en 202013,14, tandis que l’Organisation mondiale de la santé a déclaré Shigella comme un agent pathogène prioritaire contre la résistance aux antimicrobiens pour lequel de nouvelles thérapies sont nécessaires de toute urgence15.
Les infections à Shigella se transmettent facilement par voie fécale-orale lors de l’ingestion d’aliments ou d’eau contaminés, ou par contact humain direct. Shigella a évolué pour devenir un agent pathogène efficace et adapté à l’homme, avec une dose infectieuse de 10 à 100 bactéries suffisante pour provoquer une maladie16. Pendant le transit de l’intestin grêle, Shigella est exposée à des signaux environnementaux, tels qu’une température élevée et la bile17. La détection de ces signaux induit des changements transcriptionnels pour exprimer des facteurs de virulence qui améliorent la capacité de la bactérie à infecter le côlon humain 17,18,19. Shigella n’envahit pas l’épithélium colique à partir de la surface apicale, mais transite plutôt à travers la couche épithéliale après absorption dans des cellules microfold (cellules M) spécialisées présentant des antigènes dans l’épithélium associé au follicule 20,21,22. Après la transcytose, les cellules de Shigella sont phagocytées par les macrophages résidents. Shigella s’échappe rapidement du phagosome et déclenche la mort des cellules macrophages, entraînant la libération de cytokines pro-inflammatoires 5,23,24. Shigella envahit ensuite les cellules épithéliales du côlon par le côté basolatéral, lyse la vacuole macropinocytaire et établit une niche réplicative dans le cytoplasme 5,25. Les cytokines pro-inflammatoires, en particulier l’interleukine-8 (IL-8), recrutent des leucocytes polynucléaires neutrophiles (PMN) sur le site de l’infection, ce qui affaiblit les jonctions épithéliales serrées et permet l’infiltration bactérienne de la muqueuse épithéliale pour exacerber l’infection basolatérale5. Les NMP détruisent la muqueuse épithéliale infectée pour contenir l’infection, ce qui entraîne les symptômes caractéristiques de la dysenterie bacillaire (sanglante)5. Bien que les mécanismes d’invasion et de réplication intracellulaire aient été caractérisés de manière approfondie, de nouvelles recherches démontrent de nouveaux concepts importants dans l’infection à Shigella, notamment la régulation de la virulence pendant le transit gastro-intestinal (GI)17, l’observance19, l’amélioration de l’accès basolatéral grâce à la perméabilité de la barrière26 et le portage asymptomatique chez les enfants malnutris27.
La capacité de Shigella spp. à provoquer des maladies diarrhéiques est limitée aux humains et aux primates non humains (PNH)28. Des modèles d’infection intestinale à Shigella ont été développés pour le poisson-zèbre29, les souris30, les cochons d’Inde31, les lapins 21,32,33 et les porcs 34,35. Cependant, aucun de ces systèmes modèles ne peut reproduire avec précision les caractéristiques de la maladie observées lors de l’infection humaine36. Bien que des modèles de shigellose aient été établis pour étudier la pathogenèse de Shigella, ces systèmes modèles sont coûteux à mettre en œuvre et nécessitent des doses infectieuses artificiellement élevées, jusqu’à neuf ordres de grandeur supérieures à la dose infectieuse des humains 37,38,39,40,41,42. Ainsi, l’adaptation remarquable de Shigella à l’infection d’hôtes humains nécessite l’utilisation de cultures cellulaires d’origine humaine pour recréer des modèles physiologiquement pertinents pour une interrogation précise de la pathogenèse de Shigella.
Ici, des procédures détaillées sont décrites pour mesurer les taux d’adhérence, d’invasion et de réplication de Shigella dans les cellules épithéliales du côlon HT-29. Grâce à ces protocoles standardisés, les mécanismes moléculaires par lesquels les gènes de virulence bactérienne et les signaux environnementaux ont un impact sur chaque étape de l’infection à Shigella peuvent être interrogés pour mieux comprendre la relation dynamique hôte-pathogène.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mu ; m Filtre PES</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SCGP00525</td><td>Filtre stérile en polyéthersulfone pour la stérilisation jusqu’à 50 mL de milieux</td></tr><tr><td>Tubes de culture de 14 mL</td><td>Corning</td><td>352059</td><td>17 mm x 100 mm Tubes à essai en polypropylène de 17 mm x 100 mm avec capuchon</td></tr><tr><td>Tubes coniques de 50 mL de</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>de 50 mL Tubes à centrifuger à fond conique en polypropylène transparent avec bouchon étanche</td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire à 6 puits</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>Les plaques sont traitées pour une fixation cellulaire optimale</td></tr><tr><td>Sels biliaires</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8756</td><td>Rapport 1:1 entre le cholate et le désoxycholate</td></tr><tr><td>Colorant rouge du Congo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6277</td><td>Un colorant diazo anionique à base de benzidine, pureté >85 %</td></tr><tr><td>Lame de chambre de comptage cellulaire Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>À utiliser avec le compteur cellulaire automatisé Countess</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418 A,</td><td>un réactif organique hautement polaire</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>Le DMEM est complété par du glucose élevé, du pyruvate de sodium, du GlutaMAX et du</td></tr><tr><td>sérum bovin fœtal rouge phénolique (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>Gentamicine stérile inactivée par la chaleur</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3632</td><td>La concentration du stock est de 50 mg/mL</td></tr><tr><td>Lignée cellulaire HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>Lignée cellulaire d’adénocarcinome ; colorectal en origine</td></tr><tr><td>Film de paraffine</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td>Film d’étanchéité de laboratoire</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>100 mm x 15 mm Boîtes de Pétri pour milieux solides</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>1x concentration ; pH 7,4</td></tr><tr><td>Sélectionner gélose</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td>Un mélange de polysaccharides extraits des parois cellulaires d’algues rouges pour fabriquer des milieux de placage bactérien</td></tr><tr><td>Fioles T75</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td>Fioles de culture tissulaire</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Un tensioactif et émulsifiant non ionique commun.</td></tr><tr><td>Coloration au bleu de trypan</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Un colorant pour détecter les cellules mortes de culture de tissus ; seules les cellules vivantes peuvent exclure le colorant</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Réactif pour la dissociation cellulaire pour l’entretien et le passage des lignées cellulaires</td></tr><tr><td>Bouillon de soja tryptique (TSB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8907</td><td>Milieu de croissance bactérienne</td></tr></tbody></table>

analyses des infections des cellules épithéliales avec shigella

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

L’agent pathogène bactérien entérique adapté à l’homme, Shigella , provoque des millions d’infections chaque année, crée des effets de croissance à long terme chez les patients pédiatriques et est l’une des principales causes de décès dus à la diarrhée dans le monde. L’infection induit une diarrhée aqueuse ou sanglante en raison du passage de l’agent pathogène dans le tractus gastro-intestinal et de l’infection des cellules épithéliales tapissant le côlon. Avec l’augmentation stupéfiante de la résistance aux antibiotiques et le manque actuel de vaccins approuvés, des protocoles de recherche standardisés sont essentiels pour étudier ce formidable agent pathogène. Ici, des méthodologies sont présentées pour examiner la pathogenèse moléculaire de Shigella à l’aide d’analyses in vitro de l’adhérence, de l’invasion et de la réplication intracellulaire bactériennes dans les cellules épithéliales du côlon. Avant les analyses d’infection, le phénotype de virulence des colonies de Shigella a été vérifié par l’absorption du colorant rouge du Congo sur des plaques de gélose. Des milieux de laboratoire supplémentés peuvent également être envisagés pendant la culture bactérienne pour imiter les conditions in vivo . Les cellules bactériennes sont ensuite utilisées dans un protocole standardisé pour infecter les cellules épithéliales du côlon dans des plaques de culture tissulaire à une multiplicité d’infection établie avec des adaptations pour analyser chaque stade de l’infection. Pour les tests d’observance, les cellules de Shigella sont incubées avec des niveaux de milieu réduits pour favoriser le contact bactérien avec les cellules épithéliales. Pour les essais d’invasion et de réplication intracellulaire, la gentamicine est appliquée à différents intervalles de temps pour éliminer les bactéries extracellulaires et permettre l’évaluation de l’invasion et/ou la quantification des taux de réplication intracellulaire. Tous les protocoles d’infection dénombrent les bactéries adhérentes, envahies et/ou intracellulaires en diluant en série les lysats de cellules épithéliales infectées et en plaquant les unités formant des colonies bactériennes par rapport aux titres infectieux sur des plaques de gélose rouge du Congo. Ensemble, ces protocoles permettent une caractérisation et des comparaisons indépendantes pour chaque stade de l’infection à Shigella des cellules épithéliales afin d’étudier avec succès cet agent pathogène.

Des tests d’adhérence, d’invasion et de réplication intracellulaire ont été effectués en comparant S. flexneri 2457T de type sauvage (WT) à S. flexneri ΔVF (ΔVF), un mutant supposé réguler négativement la virulence de Shigella. Étant donné que Shigella utilise les sels biliaires comme signal pour réguler la virulence 17,18,47, des expériences ont été réalisées après une sous-culture bactérienne dans un milieu TSB ainsi qu’une supplémentation en sels biliaires à 0,4 % (p/v) 18. L’exposition aux sels biliaires pendant l’étape de sous-culture agit comme un prétraitement pour reproduire le transit de l’intestin grêle avant l’infection colique 17,18,47. La figure 1 analyse l’effet de la mutation ΔVF sur la capacité de S. flexneri à adhérer aux cellules épithéliales du côlon HT-29. Le pourcentage d’adhérence est tracé sur l’axe des y et représente le rapport des bactéries récupérées après la lyse HT-29 normalisé par rapport au nombre de bactéries d’entrée. Comme prévu, les souches de S. flexneri WT et ΔVF ont présenté une augmentation significative de l’observance lorsqu’elles étaient sous-cultivées avec supplémentation en sels biliaires par rapport à TSB sans supplémentation en sels biliaires18. Cependant, il n’y avait pas de différence dans l’adhérence aux cellules HT-29 entre les souches mutantes WT et ΔVF dans chaque condition de sous-culture. Ces données indiquent que la mutation ΔVF n’a aucun effet sur la capacité de S. flexneri à adhérer aux cellules épithéliales HT-29 avec ou sans prétraitement aux sels biliaires.
Dans la figure 2, l’effet de la mutation ΔVF sur la capacité de S. flexneri à envahir (Figure 2A) et à se répliquer (Figure 2B) à l’intérieur des cellules épithéliales du côlon HT-29 avec ou sans prétraitement aux sels biliaires a été analysé. Le pourcentage de récupération est tracé sur l’axe des y et représente le rapport de cellules bactériennes récupérées après la lyse cellulaire HT-29 normalisé par rapport au nombre de bactéries d’entrée. Dans la figure 2A, on s’attendait à une augmentation significative de la capacité de WT S. flexneri 2457T à envahir les cellules HT-29 après une pré-exposition aux sels biliaires48, tandis que le mutant S. flexneri ΔVF présentait une augmentation plus faible de l’invasion après une préexposition aux sels biliaires par rapport à la souche WT. Le mutant ΔVF avait des taux d’invasion accrus de cellules HT-29 par rapport à la sous-culture WT dans TSB, mais avait des taux d’invasion similaires à ceux de WT lorsqu’il était sous-cultivé dans TSB supplémenté en sels biliaires (Figure 2A). Ces résultats suggèrent que la mutation ΔVF améliore la capacité de S. flexneri à envahir les cellules HT-29, ce qui diminue l’effet des sels biliaires avant l’exposition, même si la capacité d’invasion du mutant ΔVF a encore augmenté après la sous-culture de sels biliaires.
Dans l’ensemble, 10 fois plus de bactéries ont été récupérées après une nuit d’incubation (figure 2B) par rapport à une incubation de 90 minutes (figure 2A), ce qui démontre les différences dans la surveillance de la croissance intracellulaire par rapport à l’invasion, respectivement. Lorsque les cellules HT-29 infectées ont été incubées pendant 18 heures pour permettre la réplication intracellulaire de la bactérie (figure 2B), l’impact du prétraitement des sels biliaires a diminué pour les souches WT et ΔVF . Cependant, l’effet réduit du prétraitement des sels biliaires pendant la réplication intracellulaire était plus spectaculaire pour le mutant ΔVF . Étant donné que l’augmentation de la réplication intracellulaire des deux souches lors de la pré-exposition aux sels biliaires était plus faible que l’augmentation des taux d’invasion dans les mêmes conditions, nous émettons l’hypothèse que les sels biliaires ont un impact plus important sur les premières étapes de la pathogenèse de S. flexneri . Le mutant ΔVF a montré une augmentation du pourcentage de récupération de la réplication nocturne à l’intérieur des cellules HT-29 par rapport à WT (Figure 2B) après les deux conditions de sous-culture. Cependant, les pourcentages de récupération du mutant ΔVF étaient similaires indépendamment des sels biliaires avant l’exposition. Ces tendances des données suggèrent que le mutant ΔVF se réplique plus efficacement à l’intérieur des cellules HT-29 que dans les WT, et que la pré-exposition aux sels biliaires n’a pas d’impact sur la capacité du mutant ΔVF à se répliquer intracellulairement, comme observé pour WT (figure 2B). Étant donné que la différence entre les souches mutantes et WT dans les conditions de pré-exposition aux sels biliaires n’a pas été observée lors de l’essai d’invasion de 90 minutes, nous émettons l’hypothèse que le produit codé par le gène VF supprimé peut également réguler la réplication de S. flexneri à l’intérieur des cellules HT-29. Combinées, les deux analyses démontrent que le mutant ΔVF est plus virulent que WT, ce qui suggère que le produit du gène VF est un régulateur négatif de la virulence de S. flexneri .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig01.jpg"> Figure 1 : L’adhérence pré-exposition aux sels biliaires induite par S. flexneri aux cellules HT-29. Les cellules mutantes S. flexneri 2457T WT et ΔVF ont été sous-cultivées dans des milieux TSB ou TSB complétés par 0,4 % (p/v) de sels biliaires (TSB+BS). Les bactéries ont ensuite été appliquées sur des cellules HT-29 à une multiplicité d’infection (MOI) de 100 et incubées pendant 3 heures pour examiner l’observance. Après l’incubation, les cellules HT-29 infectées ont été lavées et lysées, et des dilutions en série des bactéries récupérées ont été mises en plaques pour dénombrer les unités formant colonies par mL (UFC/mL). Le nombre de bactéries adhérentes est tracé par rapport aux titres de bactéries d’entrée pour établir le pourcentage d’adhérence. Les données sont représentatives d’une répétition biologique avec trois répétitions techniques (points individuels). Les barres d’erreur indiquent l’erreur type de la moyenne (SEM). La signification statistique a été déterminée par un test t de Student (*p &lt; 0,05 ; ***p &lt; 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig02.jpg"> Figure 2 : Les sels biliaires avant l’exposition ont augmenté l’invasion de WT S. flexneri et la réplication intracellulaire. Les cellules mutantes S. flexneri 2457T WT et ΔVF ont été sous-cultivées dans des milieux TSB ou TSB supplémentés en sels biliaires (TSB+BS). Les bactéries ont ensuite été appliquées sur des cellules HT-29 à un moment d’inertie de 100, centrifugées sur les cellules et incubées à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 45 min. Les cellules ont été lavées avec du PBS et les bactéries extracellulaires ont été lysées par l’ajout de gentamicine au DMEM pour récupérer exclusivement les bactéries intracellulaires. Après 90 minutes (A, invasion bactérienne) ou 18 h (B, réplication intracellulaire) d’incubation, les cellules HT-29 infectées ont été lavées et lysées, et des dilutions en série des bactéries récupérées ont été mises en plaques pour dénombrer les unités formant colonies par mL (UFC/mL). Le nombre de bactéries intracellulaires est tracé par rapport aux titres bactériens d’entrée pour établir le pourcentage de récupération. Les données sont représentatives d’une répétition biologique, chacune avec trois répétitions techniques (points individuels). La signification statistique a été déterminée par un test t de Student (*p &lt; 0,05). Veuillez noter les différences dans les échelles de l’axe des y entre les panneaux (A) et (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Le présent protocole décrit des tests d’infection pour interroger l’adhérence, l’invasion et la réplication intracellulaire de Shigella à l’aide de lignées cellulaires épithéliales in vitro .

Analyses des infections des cellules épithéliales avec Shigella

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

Shigella est un agent pathogène mondial important qui provoque des taux d’infection dévastateurs chaque année. Shigella infecte le tractus gastro-intestinal pour provoquer la diarrhée ou la dysenterie. Notre recherche vise à améliorer notre compréhension de l’infection afin d’aider à développer des traitements plus efficaces comme des vaccins et d’autres produits antimicrobiens.Tout d’abord, les modèles animaux et les techniques émergentes de culture tissulaire nous permettent de mieux comprendre la physiologie de l’infection à Shigella et de reproduire fidèlement la complexité du tractus gastro-intestinal humain. Deuxièmement, la caractérisation des isolats cliniques de Shigella a permis de saisir la diversité de ce genre, d’identifier des gènes de virulence importants et d’améliorer notre compréhension de l’infection. Nous avons utilisé des signaux gastro-intestinaux comme les sels biliaires et le glucose pour comprendre comment Shigella survit au transit dans l’intestin grêle et régule l’expression des gènes de virulence pour l’infection dans le gros intestin.Nous avons démontré comment Shigella résiste aux sels biliaires et avons montré que Shigella produit des protéines d’adhérence pour aider à initier le contact avec les cellules épithéliales pour déclencher l’infection. Ces protocoles sont conçus pour examiner les aspects clés de l’infection épithéliale comme l’adhérence, l’invasion et la survie intracellulaire de Shigella. Nous réalisons ces protocoles en utilisant une lignée cellulaire épithéliale standard, mais nous avons également adapté les méthodes pour les modèles gastro-intestinaux humains sophistiqués qui sont maintenant disponibles.Ces protocoles prennent en compte chaque phase de l’infection indépendamment, ce qui est essentiel pour comprendre les étapes clés de l’infection à Shigella. Ils soulignent également que des analyses combinées peuvent faciliter une meilleure compréhension de l’infection à Shigella à un niveau holistique.

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