Culture en suspension, production et purification de virus adéno-associés par centrifugation par gradient de densité d’iodixanol pour des applications in vivo
9 février 2024
Le virus adéno-associé est produit en culture cellulaire en suspension et purifié par centrifugation à double gradient de densité d’iodixanol. Des étapes sont incluses pour augmenter le rendement total du virus, réduire le risque de précipitation du virus et concentrer davantage le produit viral final. Les titres finaux attendus atteignent 10à 12 particules virales/mL et conviennent à une utilisation préclinique in vivo .
Nous utilisons une approche d’évolution dirigée pour identifier les capits viraux adéno-associés avec un tropisme plus élevé pour les types de cellules humaines cibles. Grâce à cette recherche, nous visons à produire des vecteurs viraux adéno-associés recombinants avec une meilleure transduction des cellules cibles et une pertinence clinique dans le domaine de la thérapie génique. Notre groupe a récemment déciblé plusieurs sérotypes AAV du foie en incorporant des résidus de capside originaux d’un sérotype AAV qui possède naturellement un tropisme hépatique réduit.
Si elle est étendue avec succès à d’autres sérotypes, cela fournit les bases pour réduire la dose clinique nécessaire de RAAV par injection périphérique et réduire les résultats indésirables pour les patients. La méthode de purification IODIXanol, bien qu’elle soit rentable, est difficile à mettre à l’échelle. De plus, dans les applications en aval, l’approche d’évolution dirigée est réalisée avec des modèles animaux ou in vitro.
Ainsi, la capside isolée par évolution dirigée peut ne pas transduire les cibles in vivo chez l’homme dans la même mesure que dans les modèles précliniques. Ce protocole est abordable et accessible aux petits laboratoires. De plus, cette méthode produit un virus adéno-associé recombinant de haute pureté qui peut être utilisé pour des applications précliniques in vivo en aval.
Aperçu
Cette étude porte sur l'évolution dirigée des capsides du virus adéno-associé (AAV) afin d'améliorer leur tropisme pour des types cellulaires humains spécifiques. La recherche vise à développer des vecteurs AAV recombinants capables d'améliorer la transduction des cellules cibles, ce qui est crucial pour les applications de thérapie génique.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Thérapie génique
- Virus adéno-associés
- Développement de vecteurs viraux
Contexte
- Les virus adéno-associés sont utilisés en thérapie génique en raison de leur innocuité et de leur efficacité.
- L'amélioration du tropisme peut conduire à de meilleurs résultats thérapeutiques.
- Les méthodes actuelles de production et de purification des VAA peuvent être difficiles à mettre à l'échelle.
- L'évolution dirigée offre une stratégie pour améliorer les propriétés des vecteurs viraux.
Objectif de l'étude
- Identifier des capsides d'AAV présentant une tropisme accru pour les cellules humaines.
- Réduire le tropisme hépatique de certains sérotypes d'AAV.
- Réduire potentiellement la dose clinique nécessaire pour une thérapie génique efficace.
Méthodes utilisées
- Approche par évolution dirigée pour la modification de la capside.
- Utilisation de modèles animaux et de systèmes in vitro pour les tests.
- Centrifugation en gradient de densité d'iodixanol pour la purification du virus.
- Évaluation du rendement des particules virales et de l'efficacité de transduction.
Résultats principaux
- Identification de capsides présentant une tropisme amélioré pour les cellules cibles.
- Réussite du détargage des sérotypes d'AAV à l'égard du foie.
- Démonstration de capacités de transduction améliorées dans des modèles précliniques.
- Mise en place d'une méthode de purification échelonnée, bien que difficile.
Conclusions
- L'évolution dirigée peut améliorer efficacement les propriétés de la capside AAV.
- Une tropisme hépatique réduit pourrait conduire à des applications de thérapie génique plus sûres.
- Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour étendre ces résultats à d'autres sérotypes.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La production en culture en suspension et la purification par gradient de densité d'iodixanol de rAAV permettent d'obtenir un vecteur hautement pur destiné aux études précliniques in vivo, soutenant ainsi le développement de thérapies géniques. Ce protocole indépendant du sérotype facilite la génération de divers capsides AAV, y compris ceux conçus pour une tropisme modifié, et fournit une base reproductible pour le développement translationnel de vecteurs. L'accessibilité de la méthode et la reproductibilité du rendement sont essentielles pour l'optimisation précoce des vecteurs et le tri des portefeuilles.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet la production de variants de rAAV pour l'analyse fonctionnelle de l'efficacité de délivrance génique dans des types cellulaires cibles.
- Facilite la détection des risques mécanistiques en fournissant des vecteurs pour des études de transduction spécifiques aux voies et aux tissus.
- Permet la conception rapide et la validation de capsides modifiées présentant une tropisme altéré.
Développement de criblage et de tests
- Permet d'obtenir des rAAV de haute pureté et concentrés, adaptés à des tests de criblage quantitatifs in vitro et in vivo.
- Standardise l'apport vectoriel pour un développement reproductible des tests et des comparaisons entre études.
- Permet une montée en échelle pour le criblage de multiples variants d'encapsidation ou de constructions de transgènes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Fournit des vecteurs pour des études précliniques sur des modèles animaux afin d'évaluer le ciblage tissulaire et les effets hors cible.
- Facilite l'alignement des biomarqueurs translationnels en permettant la validation in vivo des performances du vecteur.
- Réduit le risque de contamination par des protéines interférentes dans les études ultérieures d'efficacité et de sécurité.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole fait le lien entre la découverte précoce et la validation préclinique en fournissant des rAAV de haute qualité destinés à des études mécanistiques ainsi qu'à des recherches translationnelles. Il constitue une compétence fondamentale pour l'ingénierie des vecteurs, le criblage et les protocoles de preuve de concept in vivo.
- Biologie de la découverte : Fournit des vecteurs pour des tests fondés sur des hypothèses concernant les modifications de la capside et le ciblage tissulaire.
- Écrantage : Fournit des rAAV standardisés et à titre élevé pour le développement d'essais robustes et des analyses comparatives.
- Analytique : Permet la mesure quantitative du rendement et de la pureté des particules virales afin d'optimiser les procédés.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité allant de l'écrantage in vitro à la validation in vivo dans des modèles animaux.
- Réutilisation en milieu professionnel : Propose un protocole largement applicable et indépendant du sérotypes pour divers programmes de thérapie génique.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive dans la performance du vecteur et la validation de la cible.
- Valeur opérationnelle : Permet une production reproductible, évolutible et rentable de rAAV pour les équipes de recherche et développement.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées d'aller/arrêt pour les candidats vecteurs et réduit les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation des capsides ingénierisées et des constructions de transgènes ajustée au risque.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules en suspension, en transfection et en techniques d'ultracentrifugation.
- Exige un accès à des ultracentrifugeuses, des pompes péristaltiques et des outils analytiques pour l'évaluation du titre et de la pureté.
- La standardisation entre les équipes est essentielle pour la reproductibilité et la comparabilité entre études.
- L'adaptation à une production à grande échelle est limitée par la possibilité de mise à l'échelle de la centrifugation sur gradient d'iodixanol.
- Le protocole est optimisé pour la production de vecteurs à usage de recherche plutôt que pour la fabrication de qualité clinique.
