Isolement nucléaire à partir de cellules sanguines dérivées in vitro cryoconservées
15 mars 2024
Nous décrivons un protocole d’extraction de noyaux de haute qualité à partir de cellules souches pluripotentes induites cryopréservées, de types de cellules stromales/endothéliales et de cellules sanguines dérivées de cellules souches pluripotentes induites afin de soutenir les analyses de séquençage de nouvelle génération à noyau unique. La production de noyaux intacts de haute qualité est impérative pour les expériences multiomiques, mais peut constituer une barrière à l’entrée sur le terrain pour certains laboratoires.
Mon laboratoire étudie les gènes et les mécanismes qui affectent la formation des cellules sanguines. Nous produisons des cellules sanguines à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme, et nous voulons le faire plus efficacement pour soutenir la production à l’échelle clinique de thérapies cellulaires adaptées à des patients spécifiques. Nous utilisons des modalités de génomique unicellulaire pour identifier des modèles d’expression génique et d’autres facteurs qui peuvent aider à soutenir la formation des cellules sanguines.
L’un des principaux défis de la production de cellules sanguines in vitro est qu’elle est coûteuse et inefficace. Nous utilisons des approches génétiques pour résoudre ce problème. Nous voulons utiliser des indices de la génétique humaine et de l’hématopoïèse in vivo pour guider les améliorations que nous apportons au système in vitro.
Nous essayons d’utiliser la génomique fonctionnelle et l’analyse de noyaux uniques pour faire progresser le domaine en termes d’identification des gènes et des réseaux de signalisation qui entraînent la formation des bons types de cellules sanguines in vitro. La création d’un ensemble de données multi-omiques de haute qualité nous a permis de découvrir les facteurs de transcription, l’énergie et la machinerie régulière qui pilotent la différenciation in vitro des cellules sanguines. Nous utilisons ces données pour comprendre les données génétiques humaines telles que les loci et les facteurs incertains qui sont à l’origine de la différenciation que nous n’avons pas été en mesure de voir auparavant.
Nous sommes très enthousiastes à l’idée de tirer parti des informations de ces ensembles de données multimodales que nous avons pu générer sur la base de l’isolement de noyaux de haute qualité. Nous avons l’intention de concentrer nos études futures sur les gènes et les mécanismes de développement qui peuvent produire des types de cellules sanguines, à l’échelle clinique in vitro.
Aperçu
Cet article présente un protocole d'extraction de noyaux de haute qualité à partir de cellules souches pluripotentes induites cryopréservées, dérivées de types cellulaires stromaux/endothéliaux et sanguins. Ce processus est essentiel pour faciliter les analyses de séquençage nucléaire de nouvelle génération, cruciales pour les expériences multiomiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie des cellules souches
- Génomique
- Thérapie cellulaire
Contexte
- Les cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) peuvent se différencier en divers types cellulaires.
- Des noyaux de haute qualité sont nécessaires pour des analyses multiomiques efficaces.
- Des défis existent dans la production de noyaux intacts pour le séquençage.
- L'amélioration de la production de cellules sanguines in vitro est essentielle pour les applications cliniques.
Objectif de l'étude
- Améliorer l'efficacité de la production de cellules sanguines à partir de cellules souches induites pluripotentes (iPSC).
- Contribuer au développement de thérapies cellulaires personnalisées.
- Surmonter les obstacles liés à l'extraction des noyaux dans les expériences de multiomique.
Méthodes utilisées
- Extraction de noyaux de types cellulaires cryopréservés.
- Analyses de séquençage à haut débit à partir de noyaux uniques.
- Approches génétiques pour améliorer la formation des cellules sanguines.
- Utilisation des données de génétique humaine pour orienter les améliorations expérimentales.
Résultats principaux
- Extraction réussie de noyaux de haute qualité à partir de divers types cellulaires.
- Identification de profils d'expression génique facilitant la formation des cellules sanguines.
- Démonstration d'une efficacité améliorée dans les méthodes de production cellulaire.
- Apercus obtenus à partir de l'hématopoïèse in vivo appliqués à des systèmes in vitro.
Conclusions
- Le protocole améliore la faisabilité des analyses multiomiques dans la recherche sur les cellules souches.
- Des méthodes améliorées peuvent conduire à de meilleures applications cliniques des thérapies cellulaires.
- Des recherches continues sont nécessaires pour affiner la production de cellules sanguines in vitro.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'isolement de noyaux de haute qualité à partir de cellules sanguines dérivées de CIPi congelées est essentiel pour permettre des analyses multiomiques robustes au niveau du noyau unique, influant directement sur la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans le domaine de la découverte hématopoïétique. Cette capacité renforce la confiance prédictive dans l'interrogation des gènes et des voies biologiques, facilitant l'avancement ajusté au risque des candidats aux thérapies cellulaires. Une extraction fiable de noyaux à partir de divers types cellulaires assure la continuité translationnelle et l'extensibilité du portefeuille pour les thérapeutiques sanguines de nouvelle génération.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'interrogation de la génomique fonctionnelle des voies de différenciation hématopoïétique.
- Facilite l'identification des facteurs transcriptionnels et régulateurs impliqués dans la formation des cellules sanguines.
- Permet une réduction mécanistique des risques en clarifiant les relations gène-fonction in vitro.
- Améliore la fiabilité prédictive pour le développement de cibles candidates dans les filières de thérapie cellulaire.
Développement de criblages et de tests
- Fournit des préparations de noyaux validées pour des essais de séquençage unicellulaire reproductibles.
- Standardise la qualité des échantillons en entrée pour des protocoles multiomiques couvrant différents types cellulaires.
- Permet une évaluation quantitative de l'expression génique et de l'accessibilité de la chromatine.
- Facilite le criblage à grande échelle de perturbations génétiques et pharmacologiques dans des modèles de cellules sanguines.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats in vitro avec les données génétiques humaines pour la priorisation de cibles pertinentes pour la maladie.
- Assure la continuité entre la génomique de découverte et la validation préclinique de candidats à la thérapie cellulaire.
- Réduit le risque de translation en permettant un profilage moléculaire de haute fidélité des populations cellulaires thérapeutiques.
- Facilite la découverte de biomarqueurs pour le suivi de la différenciation et de la puissance dans les produits cellulaires.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole d'isolement nucléaire s'intègre à l'interface entre la phase initiale de découverte et la recherche préclinique, permettant une transition fluide entre la génomique orientée par des hypothèses et la validation translationnelle dans des systèmes de cellules sanguines dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC).
- Biologie de la découverte : Soutient la validation d'hypothèses et l'élucidation de voies biologiques grâce à des données multiomiques de haute qualité.
- Criblage : Fournit des entrées reproductibles de noyaux pour des tests unicellulaires à grande échelle.
- Analytique : Offre des mesures quantitatives permettant de comparer l'expression génique et les états de la chromatine dans différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les découvertes mécanistiques in vitro et l'évaluation de candidats précliniques.
- Réutilisation en entreprise : Adaptable à divers types cellulaires cryopréservés, répondant aux besoins variés d'un portefeuille de recherche et développement.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Standardise l'isolement des noyaux pour des protocoles multiomiques reproductibles et évolutifs.
- Valeur stratégique : Permet des décisions éclairées de poursuite ou d'abandon et un développement capital-efficient des programmes de thérapie cellulaire.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque et l'intégration des données entre programmes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules souches et en techniques d'isolement de noyaux.
- Exige un accès aux plateformes de séquençage unicellulaire au niveau du noyau et d'analyse multiomique.
- Implique une standardisation interéquipes des procédures de manipulation des échantillons et d'évaluation de la qualité.
- Peut être adapté à divers types de cellules sanguines primaires et dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC), moyennant une optimisation du protocole.
- Les limitations potentielles incluent les besoins spécifiques à chaque type cellulaire en matière de lyse et la variabilité induite par la cryoconservation.
