Analyse de l’efficacité de l’assemblage d’extrémités non homologues et de la recombinaison homologue dans les cellules HEK-293T à l’aide de systèmes rapporteurs basés sur la GFP

Les cassures double brin de l’ADN représentent les lésions d’ADN les plus dangereuses. En réponse, les cellules utilisent deux mécanismes principaux pour la réparation des cassures double brin de l’ADN, NHEJ et HR. Il est essentiel de quantifier l’efficacité de la NHEJ et des RH séparément pour explorer les mécanismes et les facteurs pertinents qui leur sont associés. Le test NHEJ et le test HR sont des méthodes établies utilisées pour mesurer l’efficacité du NHEJ et de la HR. Ces méthodes reposent sur des plasmides méticuleusement conçus qui contiennent un gène de protéine fluorescente verte perturbé avec des sites de reconnaissance pour l’endonucléase I-SceI pour l’induction des DSB.

Le test NHEJ et le test HR peuvent être effectués en utilisant une approche chromosomiquement intégrée ou extrachromosomique. L’approche chromosomiquement intégrée permet d’analyser la réparation des DSB au sein d’un conflit chromosomique. Cependant, l’approche chromosomiquement intégrée nécessite une cellule prolongée et ne convient pas aux études comparatives impliquant plusieurs lignées cellulaires.

Dans ce protocole, nous décrivons les tests extrachromosomiques NHEJ et HR impliquant la transfection transitoire des plasmides GFP et I-SceI perturbés dans les cellules HEK-293T et l’analyse ultérieure par cytométrie en flux. Ces tests de rapporteur non intégrés ont été utilisés pour évaluer l’efficacité du NHEJ et l’efficacité des RH par plusieurs laboratoires, dont le nôtre. Contrairement à l’approche chromosomiquement intégrée, cette approche extrachromosomique permet une analyse rapide de l’efficacité de la NHEJ ou de la HR grâce à l’utilisation de lignées cellulaires établies et stables.