Différenciation et caractérisation des ostéoclastes à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines

Les ostéoclastes sont un type de cellule multinucléée couramment utilisé par les chercheurs dans des domaines tels que la recherche sur les maladies osseuses, la recherche sur le cancer, l’ingénierie tissulaire et la recherche sur les endoprothèses. Néanmoins, la différenciation des ostéoclastes peut être difficile, car la fusion des précurseurs est nécessaire. De plus, la différenciation des ostéoclastes humains des IPSC nécessite l’utilisation d’une variété de facteurs biologiques au bon moment.

Lorsqu’il s’agit de cellules primaires humaines. Les cellules mononucléées du sang périphérique CD34+ sont actuellement le type de cellule le plus largement utilisé pour la différenciation en ostéoclastes. Cependant, cette approche est limitée par l’hétérogénéité au sein de la population CD34+ et leur capacité d’extensibilité limitée.

Les cellules IPSC humaines représentent une source alternative d’ostéoclastes. Comme ils peuvent être propagés indéfiniment, ils permettent l’extensibilité et la mise à l’échelle de la production d’ostéoclastes. Cela permet de différencier un grand nombre d’ostéoclastes, ce qui facilite la recherche sur les ostéoclastes.

Ici, notre post-doctorant Alexander Blumke et notre doctorante Jessica Simon, démontrent la différenciation des ostéoclastes des IPSC humains qui passent des IPSC. Commencer à faire passer les CSIP en enlevant les régions différenciées ou les régions avec de nombreux agrégats d’IPSC morts sous le stéréomicroscope à l’aide d’une pointe de pipette P-10 ou P-20 ou d’un racleur de cellules. Les régions différenciées apparaîtront plus denses et de couleur plus blanche.

Lavez les cellules détachées avec un vieux milieu, puis lavez deux fois les cellules détachées restantes avec du PBS. Ensuite, ajoutez un millilitre de cinq unités par millilitre de dispase par puits au puits. Les bords des colonies qui se décollent de la boîte peuvent être observés au stéréomicroscope après trois à cinq minutes.

Retirez délicatement la dispase et ajoutez un millilitre de DMEM/F-12 avec 15 millimolaires HEPES. Utilisez un outil de passage de cellules souches ou un élévateur de cellules jetable pour couper les agrégats en petites tailles. Transvaser le milieu avec les agrégats dans un tube conique de 15 millilitres à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres ou d’un P-1000 avec pointe à large alésage.

Rincez le puits avec du DMEM/F-12 et transférez le média dans le tube de 15 millilitres. Centrifuger les agrégats IPSC tranchés à 200 G pendant trois minutes. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette en verre Pasteur et ajouter deux millilitres de milieu humain sans sérum IPSC pour déloger et remettre en suspension les IPSC à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres ou de P-1000 avec des pointes à large alésage.

Aspirez l’extrait de membrane basale restante des plaques de puits pré-enrobées et ajoutez un millilitre de milieu humain sans sérum IPSC dans chaque puits de la plaque à six puits. Transférer les cellules IPSC dans de nouveaux puits d’une plaque à six puits de manière à ce que le volume final soit de deux millilitres de milieu humain sans sérum IPSC par puits à l’aide d’un P-1000 avec des pointes à large alésage. En fonction de la ligne IPSC, les rapports de fractionnement doivent être optimisés.

Ici, un rapport de division de 1 :6 a été utilisé. Faites tourner la plaque de puits pour répartir uniformément les cellules sur la plaque après le transfert des agrégats. Induction du corps embryoïde.

Aspirer l’ancien milieu des cultures IPSC et rincer les puits avec du DPBS. Ajoutez un demi-millilitre de préchauffé à température ambiante dans chaque puits d’une plaque à six puits et faites tourbillonner le récipient de culture pour recouvrir toute la surface du puits. Incuber le récipient de culture à 37 degrés C pendant cinq à huit minutes.

Retirez le récipient de l’incubateur, aspirez la solution et ajoutez le milieu de première étape dans des puits composé de 50 nanogrammes par millilitre de protéine morphogénique osseuse humaine 4, de 50 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire humain 165, de 20 nanogrammes par millilitre de facteur de cellules souches humaines et de 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK Y-27632. Détachez doucement les cellules en rinçant le puits avec un médium de première étape. Tirez les cellules dans un tube conique.

Ajoutez le nouveau milieu de première étape dans les puits et détachez les cellules restantes à l’aide d’un grattoir à cellules. Après avoir transféré toutes les cellules dans le tube, centrifugez à 200 g pendant cinq minutes à température ambiante pour granuler les cellules. Aspirer et remettre en suspension les cellules dans un milieu de première étape pré-équilibré d’un total de deux millilitres.

Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un dispositif automatisé de comptage cellulaire Semez 12 500 cellules par puits dans une plaque à fond rond à très faible fixation de 96 puits dans 100 microlitres de milieu de première étape. Au microscope, les cellules apparaîtront de manière diffuse dans toute la solution. Centrifuger les plaques à 96 puits pendant trois minutes à 100 G Après centrifugation, les cellules devraient commencer à ressembler à des sphéroïdes lorsqu’elles sont observées au microscope.

Placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés C. Changez la moitié du support le premier jour et le deuxième jour avec le support de la première étape. Utilisez une pipette multicanaux pour disposer l’ancien milieu dans une boîte de Pétri.

Après avoir éliminé le support de la plaque à 96 puits, vérifiez qu’il n’y a pas d’EB qui aurait pu être retiré accidentellement. Transférez les EB accidentellement retirés dans la boîte de Pétri à l’aide d’une pipette P-1000 Différenciation hématopoïétique. Pré-remplir les puits d’une plaque à six puits avec trois millilitres de milieu de stade deux, auquel on ajoute de l’ultraglutamine de deux millimolaires, du bêta-mercaptoéthanol de 55 micromolaires, 25 nanogrammes par millilitre, de l’interleukine-3 humaine et un facteur de stimulation des colonies de macrophages humains de 100 nanogrammes par millilitre.

À l’aide d’un P-1000 et d’une pointe à large alésage, transférez huit EB dans chaque puits de la plaque à six puits. Après le transfert, vérifier à l’œil nu sous le microscope stéréoscopique que huit EB se trouvent dans chaque puits. Après cinq à sept jours, une population de cellules flottantes composée de cellules hématopoïétiques devrait devenir visible.

La période de différenciation hématopoïétique peut être variée, à partir de sept jours. La différenciation sur 10 jours a montré une population hématopoïétique composée de grandes sous-populations CD45+CD14+et CD11b+. Après cinq jours de traitement avec un milieu de deuxième étape, effectuez un changement de milieu en retirant soigneusement l’ancien milieu et en le distribuant dans un tube conique de 50 millilitres.

Ajoutez immédiatement un millilitre de nouveau milieu de deuxième étape dans les puits. Afin d’économiser les cellules hématopoïétiques flottantes qui pourraient déjà être présentes, faites tourner le tube avec l’ancien milieu à 300 G pendant cinq minutes. Ajouter un nouveau milieu de deuxième étape dans le tube et le remettre en suspension afin de détacher les cellules qui auraient pu être transférées avec l’ancien milieu.

Ajouter deux millilitres de nouveau milieu de deuxième étape avec des cellules sauvegardées dans chaque puits, qui était auparavant rempli d’un millilitre de milieu de deuxième étape. Au jour 10 de la différenciation hématopoïétique, les cellules hématopoïétiques flottantes sont récoltées en les recueillant dans un tube conique de 50 millilitres et peuvent être soit congelées à l’aide de 10 % de DMSO, 50 % de FBS et 40 % de milieu, soit immédiatement utilisées pour différencier davantage les cellules en ostéoclastes. Maturation du M-CSF et différenciation des ostéoclastes.

Semez des cellules à 200 000 cellules par centimètre carré et traitez-les pendant trois jours avec de l’alpha MEM supplémenté en 10 % de FBS et 50 nanogrammes par millilitre de M-CSF. Afin d’effectuer des tests fonctionnels ou de l’imagerie, détacher les cellules matures par MCSF en les lavant avec un P-1000 à pointe à large alésage. Transférez les cellules détachées avec l’ancien milieu dans un tube et faites tourner vers le bas à 300 G pendant cinq minutes.

Remettre en suspension et dissoudre la pastille cellulaire avec de l’alpha MEM frais complété par 10 % de FBS, 50 nanogrammes par millilitre de M-CSF et 80 nanogrammes par millilitre de ligand RANK. Réensemencez les cellules à 200 000 cellules par centimètre carré et différenciez-les pendant sept à neuf jours. Les ostéoclastes multinucléés apparaissent généralement entre le cinquième et le septième jour.

Des résultats représentatifs. La composition de la population de cellules hématopoïétiques générées peut être analysée à l’aide de la cytométrie en flux. Ici, les cellules hématopoïétiques présentent une grande population de cellules précurseurs CD45+.

Les populations cellulaires exprimant les marqueurs monocytaires CD14 et CD11b représentent généralement un tiers de la population totale par rapport aux isotypes témoins. Les ostéoclastes dérivés de l’IPSC différenciés en phase terminale peuvent être observés au microscope sous forme de cellules multinucléées TRAP-positives. La microscopie confocale montre la coloration des cellules pour la cathepsine K.Les tests fonctionnels tels que les tests d’absorption osseuse ou minérale permettent de quantifier davantage l’activité des ostéoclastes.

Ici, les piqûres de résorption sont visibles après l’ablation des ostéoclastes matures avec de l’eau de Javel à 10 % avant l’imagerie, tandis que les précurseurs d’ostéoclastes matures par M-CSF traités sans ajout de ligand RANK ne présentent pas de fosses de résorption. Conclusion. Ce protocole permet la différenciation robuste et fiable des ostéoclastes humains et pourrait fournir une solution prête à l’emploi pour les maladies osseuses ou les maladies impliquant une calcification excessive. Nous utilisons des ostéoclastes pour les intégrer dans nos cellules RANK qui utilisent un domaine de signalisation intracellulaire qui peut être activé en conjonction avec un inducteur chimique de dimérisation pour une activation contrôlée et indépendante de l’ostéoprotégérine.