Name: Évaluation de la rupture de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle murin de lésion cérébrale traumatique légère (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T13:05:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: Découvrez l'évaluation de la rupture de la barrière hémato-encéphalique chez la souris après exposition aux ondes de choc. Cette méthode utilise deux colorants fluorescents pour visualiser la dynamique temporelle de l'intégrité de la BBB et évaluer les interventions thérapeutiques.

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<meta charset="utf8"></head><body>Visualisation à l’aide d’un colorant fluorescent de la rupture de la barrière hémato-encéphalique chez la souris

<ol><li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%3A+From+physiology+to+disease+and+back%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier: From physiology to disease and back.</a> Physiol Rev. 99 (1), 21-78 (2019).</li>
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<li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+sensitive+antigen+retrieval+method+for+free-floating+and+slide-mounted+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections.</a> J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).</li>
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<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+blood-brain-barrier+leakage+using+a+combination+of+Evans+blue+and+high+molecular+weight+fitc-dextran%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying blood-brain-barrier leakage using a combination of Evans blue and high molecular weight fitc-dextran.</a> J Neurosci Methods. 325, 108349(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Solution tampon neutre à 10 % de formol</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals</td><td>062-01661</td><td></td></tr><tr><td>Anti GFAP, Lapin</td><td>DAKO-Agilent</td><td>IR524</td><td></td></tr><tr><td>Anti Iba1, Lapin</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Poulet anti-souris IgG (H+L) Anticorps secondaire adsorbé croisé, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Mount</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>33351</td><td>Fluide de congélation des tissus</td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Orion Corporation</td><td></td><td>médétomidine</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire à adsorsion croisée élevée, Alexa Fluor 546 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A10040</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Plaque de culture cellulaire en polystyrène transparent à fond plat non traité, avec couvercle, emballée individuellement, stérile, 50/caisse</td><td>CORNING</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Isothiocyanate de fluorescéine&ndash ; dextran mol moyen poids 40 000</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>FD40S</td><td>FITC-dextran</td></tr><tr><td>Base en verre Plat 27mm (Verre n°1)</td><td>AGC TECHNO GLASS</td><td>3910-035</td><td>Plat à fond en verre 35 mm</td></tr><tr><td>IX83 Microscope inversé</td><td>OLYMPUS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAS Lames de microscope à adhérence hydrophile</td><td>Matsunami Verre</td><td>Matsunami MAS-04</td><td></td></tr><tr><td>Matsunami&nbsp ; Verre de couverture (n°1)&nbsp ; 18 x 18mm</td><td>Matsunami Glass</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam Injection 10mg [SANDOZ]</td><td>Sandoz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde EMPROVE ESSENTIAL DAC</td><td>Merck Millipore</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>ATTO</td><td>SJ-1211 II-H</td><td></td></tr><tr><td>RONGEUR BRAIN MATRIX Souris adulte, 30 g, Coronal</td><td>ASI INSTRUMENTS</td><td>RBM-2000C</td><td>Trancheuse cérébrale</td></tr><tr><td>Vetorphale</td><td>Meiji Santé Animale</td><td>VETLI5</td><td>butorphanol</td></tr></tbody></table>

Évaluation de la rupture de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle murin de lésion cérébrale traumatique légère

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

La figure 1A montre l’évolution temporelle de l’injection du colorant par rapport au début de l’injection de colorant, avec un pic de surpression de 25 kPa. Dans le protocole « Post », la solution bleue d’Evans a été administrée par voie intravasculaire 2 h avant la perfusion FITC-dextran, qui a été réalisée 6 h, 1 jour, 3 jours et 7 jours après l’exposition à l’BSW. Dans le protocole « Pré », la solution bleue d’Evans a été injectée immédiatement avant l’exposition à l’ASB. Dans le protocole « Post », la concentration d’Evans blue devrait atteindre son maximum environ 2 heures avant la fixation de la perfusion, tandis que dans le protocole « Pré », elle devrait atteindre son maximum au moment de l’exposition à la BSW (figure 1B). La concentration de FITC-dextran dans les vaisseaux sanguins du cerveau a été maintenue constante pendant 2 minutes pendant la perfusion.
L’étiquetage bleu d’Evans a montré que la dégradation de la BHE commençait dans les 6 heures et se poursuivait jusqu’à 7 jours après l’exposition à la BSW (figure 2A). Notamment, la dégradation de la BHE ne s’est pas produite immédiatement après l’exposition à l’BSW, car il n’y a pas eu d’extravasation du colorant bleu d’Evans à 3 h dans le protocole « pré » (figure 2B). Étonnamment, l’étiquetage à long terme avec le bleu d’Evans a indiqué son caractère cumulatif dans le protocole « Pré » (Figure 2B)7.
L’utilisation de deux colorants distincts, chacun introduit à des intervalles de 2 h ou plus, a permis d’examiner les changements temporels de l’intégrité de la BHE en comparant leur distribution. La figure 3 montre des images de fluorescence des coupes qui ont montré une différence significative dans la distribution du bleu d’Evans et du FITC-dextran.
De nombreux points chauds de fluorescence de différentes tailles ont été observés. Bien que certains points chauds soient suffisamment brillants pour se classer parmi les 0,1 % de pixels les plus élevés, beaucoup n’étaient que légèrement plus brillants que les tissus environnants. L’écart entre les colorants suggère que des changements se sont produits au cours de cet intervalle. Les points chauds ne présentant que la fluorescence du bleu d’Evans indiquaient une dégradation continue de la BHE au moment de l’injection de bleu d’Evans, qui a ensuite été réparée par l’injection de FITC-dextran. En revanche, les points chauds ne montrant que la fluorescence FITC-dextran suggèrent qu’une perturbation de la BHE s’est produite entre les deux injections de colorant. Enfin, les points chauds présentant une fluorescence des deux colorants indiquaient une dégradation continue de la BHE pendant toute la période d’injection.
La figure 4A présente le nombre de points chauds positifs pour Evans bleu (y compris les points chauds Evans bleu uniquement et Evans bleu/FITC-dextran doublement positif), FITC-dextran (y compris les points chauds FITC-dextran uniquement et Evans bleu/FITC-dextran doublement positifs), ou les deux colorants (uniquement les points chauds Evans bleu/FITC-dextran doublement positifs). Dans le protocole 'Pre' à 3 h, de nombreux points chauds de FITC-dextran uniquement ont été observés. À 6 h et 1 jour dans le protocole 'Post', les points chauds Evans bleu uniquement et FITC-dextran uniquement ont été détectés. Cependant, à 3 jours et 7 jours dans le protocole « Post », les points chauds étaient principalement positifs pour les deux colorants. Ces résultats suggèrent que la dégradation de la BHE s’est produite au bout de 3 heures, qu’elle a été remodelée d’un jour et qu’elle a persisté jusqu’à 7 jours après l’exposition à l’ASB (figure 4B). Il est important de noter que l’étendue de la dégradation de la BHE a eu tendance à diminuer de 7 jours, comme mentionné précédemment.
Suite à la réalisation des expériences d’extravasation du colorant, une coloration immunohistochimique des tranches a été effectuée7. Les images immunohistochimiques ont été comparées de manière cohérente à celles des extravasations de colorants, confirmant que l’effet de transfert des substances fluorescentes était pratiquement négligeable7. Comme le montre la figure 5, des amas d’astrocytes réactifs étaient étroitement associés aux sites de dégradation de la BHE. D’autres observations ont révélé que des microglies activées et amiboïdes étaient présentes aux côtés d’astrocytes réactifs 3 jours après l’exposition à l’ASB.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig01.jpg"> 
Figure 1 : Plan d’expérience. (A) Déroulement de l’expérience. La solution de bleu d’Evans a été injectée par voie intraveineuse après l’exposition à l’ASB (protocole « Post ») ou immédiatement avant (protocole « avant »), tandis que le FITC-dextran a été perfusé par voie transcardiale pendant 2 minutes avant la fixation. (B) Concentrations attendues de bleu d’Evans et de FITC-dextran dans les vaisseaux sanguins dans les protocoles « Post » et « Pré », respectivement. BSW, ondes de choc induites par l’explosion ; FITC, isothiocyanate de fluorescéine. Cette figure est adaptée de Nishii et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig02.jpg"> 
Figure 2 : Comparaison de l’intensité de la fluorescence dans des tranches de cerveau. L’intensité de fluorescence des 0,1 % des pixels les plus brillants du cerveau a été évaluée sur les 12 coupes et comparée entre les conditions « Post » (A) et « Pre » (B). La variabilité et l’importance des différences sont indiquées. xxx désigne p &lt; 0,001 ; xxxx désigne p &lt; 0,0001 (valeurs p du test F). *p &lt; 0,05 ; p &lt; 0,0001 (analyse de la variance avec le test post hoc des comparaisons multiples de Dunnett). Cette figure est adaptée de Nishii et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig03.jpg"> 
Figure 3 : Dégradation de la BHE observée à divers points temporels à l’aide d’un double marquage au bleu d’Evans et au FITC-dextran. Les images Evans bleu (magenta), FITC-dextran (vert) et fusionnées sont affichées. Les protocoles d’injection de colorant sont présentés sur le côté gauche. Certains points chauds ont montré une fluorescence prédominante du bleu d’Evans (flèche) ou du FITC-dextran (pointes de flèches). Les astérisques indiquent le plexus choroïde et les vaisseaux associés. BHE, barrière hémato-encéphalique ; FITC, isothiocyanate de fluorescéine ; CVO, organes circumventriculaires du troisième ventricule. Barre d’échelle : 1 mm. Cette figure est adaptée de Nishii et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig04.jpg"> 
Figure 4 : Quantification des points chauds de fluorescence. (A) Nombre de points chauds positifs pour le bleu Evans (magenta), le FITC-dextran (vert) et les deux colorants (gris). Elles ont été recueillies à partir des images obtenues à 3 h dans le protocole 'Pre' ainsi qu’à partir des images obtenues à 6 h, 1 jour, 3 jours et 7 jours dans le protocole 'Post'. De 3 h à 1 jour, une partie significative des points chauds de fluorescence a montré une discordance entre les colorants, alors que, de 3 jours à 7 jours, une telle discordance a été à peine observée. (B) Schéma résumant l’évolution temporelle de la panne de la BBB. L’axe vertical représente conceptuellement l’intensité des fuites de colorant dues à la dégradation de la BHE. Le motif en zigzag de 3 h à 1 jour indique que l’emplacement et l’intensité des fuites de colorant sont instables pendant cette période. FITC, isothiocyanate de fluorescéine ; BHE, barrière hémato-encéphalique ; BSW, ondes de choc induites par les explosions. Cette figure est adaptée de Nishii et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig05.jpg"> 
Figure 5 : Expression de GFAP et d’Iba1 en tant que marqueurs pour les astrocytes et la microglie, respectivement. Chaque colonne de la figure contient des images de fluorescence de l’extravasation du colorant avec du bleu d’Evans ou du FITC-dextran, ainsi que des images immunohistochimiques GFAP ou Iba1. La barre de couleur indique les intensités de fluorescence normalisées du bleu d’Evans et du FITC-dextran en utilisant celles de GRN. Les protocoles d’injection de colorant sont présentés sur le côté gauche. La tranche de 1 jour dans le protocole 'Pre' montre la fluorescence du bleu d’Evans et du FITC-dextran, tandis que la tranche de 3 jours dans le protocole 'Pre' ne montre que la fluorescence du bleu d’Evans (flèches). Les régions indiquées par les flèches dans les images d’extravasation de colorant s’alignent sur les images immunohistochimiques. Les pointes de flèches indiquent des amas d’astrocytes réactifs. L’anticorps polyclonal GFAP a marqué les astrocytes dans et autour de la substance blanche ainsi que dans le tissu nerveux adjacent à la pie-mère. En conséquence, les astrocytes à l’intérieur et à proximité du dcw sont étiquetés sur cette figure. Les images agrandies correspondant au cadre ou à la flèche dans la colonne Iba1 sont représentées dans les encarts. Barres d’échelle : 1 mm et 200 μm pour l’extravasation du colorant et les images immunohistochimiques, respectivement. GFAP, protéine acide fibrillaire gliale ; Iba1, molécule adaptatrice ionisée de liaison au calcium 1 ; FITC, isothiocyanate de fluorescéine ; BSW, ondes de choc induites par l’explosion ; DCW, substance blanche cérébrale profonde. Cette figure est adaptée de Nishii et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is ...

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Modèle murin modifié de lésion cérébrale traumatique légère répétitive incorporant une fenêtre de crâne amincie et une percussion fluide

Les modèles simplifiés de traumatismes crâniens (TCC) ont facilité le développement d’approches thérapeutiques. Ce protocole décrit la création d’un cortex de souris à l’aide d’aiguilles, permettant l’analyse de l’hémorragie et de l’inflammation. Le modèle de souris TBI à l’arme blanche offre l’avantage d’être réalisé sans nécessiter d’équipement spécialisé.

Modèle murin de blessure à l’arme blanche pour l’étude de l’hémorragie et de l’inflammation dans les lésions cérébrales traumatiques

Découvrez l'évaluation de la rupture de la barrière hémato-encéphalique chez la souris après exposition aux ondes de choc. Cette méthode utilise deux colorants fluorescents pour visualiser la dynamique temporelle de l'intégrité de la BBB et évaluer les interventions thérapeutiques.

Évaluation de la rupture de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle murin de lésion cérébrale traumatique légère

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