Évaluation de la rupture de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle murin de lésion cérébrale traumatique légère

Nous cherchons à comprendre les mécanismes complexes sous-jacents aux lésions cérébrales traumatiques légères causées par l’exposition à des ondes de choc induites par une explosion. Nous étudions également des méthodes pour soulager ces symptômes. Il s’agit d’une description complète de la phase initiale de la rupture de la barrière hémato-encéphalique due à des ondes de choc induites par une explosion de faible intensité.

Plus précisément, la dégradation commence brusquement environ trois heures après l’exposition, et les lésions touchées subissent un remodelage pendant environ un jour après le début. Cette méthode nous permet d’examiner plus en détail la répartition de la BHE, fournissant une mesure supplémentaire pour évaluer l’efficacité des différents traitements qui peuvent être utilisés en cas d’explosion. Pour commencer, préparez un tube de choc pour exposer l’animal aux ondes de choc induites par l’explosion.

Positionnez la souris anesthésiée à cinq centimètres de l’extrémité de sortie du tube de choc, en vous assurant que l’axe de son corps est parallèle à l’axe du tube, mais non aligné avec celui-ci. Ensuite, délivrez une seule onde de choc avec une surpression maximale de 25 kilopascals à la tête de l’animal. Pour l’injection d’Evans blue, préparez une solution saline d’Evans Blue à 4 % en poids par volume.

Vortex la solution et conservez-la dans l’obscurité jusqu’à utilisation. Injectez la solution Evans blue dans la veine de la queue à une dose de 2,5 microlitres par gramme. Après avoir perfusé la souris anesthésiée avec le colorant FITC-dextran et le paraformaldéhyde, utilisez des ciseaux chirurgicaux et une pince à épiler pour retirer soigneusement le cerveau.

Postfixez le cerveau pendant la nuit dans le même fixateur à quatre degrés Celsius. Le lendemain, remplacez le fixateur par du PBS. Pour commencer, obtenez le cerveau fixe d’une souris traitée par ondes de choc explosives injectée avec des colorants bleu Evans et FITC-dextran.

Préparez une plaque de 24 puits avec 500 microlitres de glycérol à 20 % dans un tampon phosphate ajusté à pH 7,4 dans chaque puits. À l’aide d’un trancheur à cerveau, coupez le cerveau en 12 tranches d’un millimètre d’épaisseur chacune. Transférez chaque tranche dans le puits correspondant de la plaque à 24 puits et conservez la plaque à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures.

Remplacez ensuite la solution par un tampon de phosphate de glycérol à 50 % et conservez-la à nouveau à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures. Enfin, remplacez la solution par du glycérol à 100 %. Pour une observation microscopique immédiate, laissez reposer les tranches pendant au moins deux heures à température ambiante.

Ajoutez 500 microlitres de glycérol au fond d’un plat à fond de verre de 35 millimètres. Transférez la tranche de cerveau dans la solution de glycérol et couvrez la surface avec un verre de protection. Retirez l’excès de glycérol du bord du verre de protection.

Mesurez l’intensité de fluorescence de la tranche à l’aide d’un microscope à fluorescence. Après la mesure microscopique, remettez la tranche dans le puits de la plaque. Ajoutez 500 microlitres de tampon phosphate dans chaque puits et stockez la plaque de 24 puits à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Remplacez la solution par un tampon de phosphate de glycérol à 30 % et incubez la plaque à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures avant d’effectuer une immunohistochimie. L’étiquetage bleu d’Evans a démontré que la rupture de la barrière hémato-encéphalique ou de la BHE commençait dans les six heures suivant l’exposition à l’onde de choc et durait jusqu’à sept jours. Les points chauds de fluorescence variaient en taille et en intensité, les points chauds d’Evans uniquement en bleu indiquant la dégradation de la BHE pendant l’injection de bleu d’Evans et la réparation après l’injection de FITC-dextran. Des amas d’astrocytes réactifs étaient étroitement associés à des sites de dégradation de la BHE confirmés par immunohistochimie.

Des microglies activées et des microglies amiboïdes ont été observées aux côtés d’astrocytes réactifs trois jours après l’exposition à l’onde de choc de l’explosion.