Name: Extraction d’ADN et comparaison entre des échantillons de mouches nécrophiles anciennes et fraîches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Découvrez une méthode d'extraction d'ADN à partir de mouches nécrophiles fraîches et anciennes utilisant un kit de test sanguin standard. Cette approche économique facilite l'analyse moléculaire en biologie forensique.

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Ce travail est soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82060341,81560304) et par le projet de recherche scientifique de la plate-forme d’innovation académique de la province de Hainan (YSPTZX202134).

REMARQUE : Au total, cinq échantillons de C. megacephala ont été utilisés dans le cadre de ce protocole : trois échantillons frais (frais 1, frais 2 et frais 3), un échantillon conservé dans de l’alcool pendant 2 ans (ancien 1) et un échantillon stocké dans un endroit sec scellé pendant 2 ans, à l’abri de la lumière seulement (ancien 2). Les échantillons doivent être étiquetés conformément aux exigences expérimentales.
1. Stockage et préparations généraux des échantillons
<ol><li>Sélection et préparation des échantillons REMARQUE : Assurez-vous de travailler dans la hotte lorsque vous appliquez de l’acétate d’éthyle pour exécuter les mouches nécrophages. Retirez le liquide de la surface de la mouche avant de la peser.<ol><li>Échantillons frais : Placez trois échantillons de mouches collectés dans des flacons de gaz après les avoir tués avec de l’acétate d’éthyle. Pesez et nommez les échantillons comme Fresh 1, Fresh 2 et Fresh 3 et utilisez-les immédiatement dans les expériences. REMARQUE : Les échantillons de mouches fraîches de ce protocole présentaient des masses de 56,8 mg, 49,3 mg et 52,1 mg.</li>
		<li>Ancien échantillon 1 : Retirer les échantillons de mouches tués par l’acétate d’éthyle et stockés dans des tubes à centrifuger remplis d’alcool pendant 2 ans dans un confinement hermétique, à l’abri de la lumière à température ambiante. Peser l’échantillon après avoir adsorbé le liquide de surface avec du papier filtre ; appelez-le Vieux 1. REMARQUE : La masse de Old 1 était de 42,3 mg dans ce protocole.</li>
		<li>Ancien échantillon 2 : Retirer l’échantillon de mouches tué par l’acétate d’éthyle et stocké dans un tube à centrifuger pendant 2 ans dans un confinement hermétique, à l’abri de la lumière à température ambiante. Pesez et appelez-le Old 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation avant l’extraction<ol><li>Ajouter une petite quantité d’azote liquide pour refroidir un récipient en acier inoxydable ; Attendez que tout l’azote liquide se soit évaporé.</li>
		<li>Mettez un échantillon de mouches dans le récipient ; Versez lentement l’azote liquide pour éviter que l’azote liquide n’éclabousse et n’impacte l’échantillon d’insecte.</li>
		<li>Congelez les échantillons dans de l’azote liquide. Prélever les échantillons après l’évaporation de l’azote liquide.</li>
		<li>Séparez le thorax individuellement, placez-le dans un tube à centrifuger de 2 ml et coupez-le en tranches les plus petites possibles. REMARQUE : Coupez l’échantillon en petits morceaux afin qu’il puisse être entièrement clivé et que l’ADN puisse être libéré en grande quantité.</li>
		<li>Répétez les étapes ci-dessus pour chaque mouche, congelez-la individuellement, puis retirez-la dans un nouveau tube à centrifuger pour éviter la contamination croisée de l’ADN.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Extraction de l’ADN
REMARQUE : Toutes les étapes de centrifugation doivent être effectuées à température ambiante (15-25 °C) dans une microcentrifugeuse. Toutes les étapes doivent être effectuées dans le strict respect des principes de l’asepsie et pour éviter la contamination croisée.
<ol><li>Lyse tissulaire<ol><li>Ajouter 180 μL de tampon de lyse tissulaire dans un tube à centrifuger de 2 mL contenant un échantillon coupé.</li>
		<li>Ajouter 20 μL de protéinase K. Bien mélanger par vortex à 3 000 tr/min pendant 10 s et incuber à 56 °C jusqu’à ce que les tissus de l’insecte soient complètement lysés. REMARQUE : Ajouter plus de protéinase K devrait être si le tissu n’est pas complètement digéré. La lyse est généralement terminée en 1 à 3 heures, ce qui peut également prolonger le temps de lyse pendant la nuit.</li>
	</ol></li>
	<li>Précipitation de l’ADN<ol><li>Vortex à 3 000 tr/min pendant 15 s. Ajoutez un tampon de lyse de 200 μL à l’échantillon et mélangez soigneusement par vortex à 3 000 tr/min pendant 15 s.</li>
		<li>Ajouter 200 μL d’éthanol (96-100 %) et bien mélanger à nouveau par vortex à 3 000 tr/min pendant 15 s. REMARQUE : Le tampon de lyse et l’éthanol peuvent être préajoutés ensemble en une seule étape pour gagner du temps. Un précipité blanc peut se former lors de l’ajout d’un tampon de lyse et d’éthanol.</li>
	</ol></li>
	<li>Pipeter le mélange dans la colonne d’adsorption d’ADN placée dans un tube de prélèvement de 2 ml. Centrifugeuse à 6 000 × g pendant 1 min. Jeter le tube d’écoulement et le tube de collecte.</li>
	<li>Placez la colonne d’adsorption d’ADN de l’étape précédente dans un nouveau tube de collecte de 2 ml, ajoutez 500 μL de tampon d’élimination des protéines et centrifugez à 6 000 × g pendant 1 min. Jeter le tube d’écoulement et le tube de collecte.</li>
	<li>Transférez la colonne d’adsorption de l’ADN dans un nouveau tube de collecte de 2 ml, ajoutez 500 μL de tampon de dessalement et centrifugez à 20 000 × g pendant 3 minutes pour sécher la membrane de la colonne d’adsorption de l’ADN. Jeter le tube d’écoulement et le tube de collecte. REMARQUE : Cette étape de centrifugation assure l’élimination de tout résidu d’éthanol avant l’élution suivante. S’il y a un transfert d’éthanol, centrifuger à nouveau à 20 000 × g pendant 1 min.</li>
	<li>Placez la colonne d’adsorption d’ADN dans un tube de microcentrifugation propre de 2 ml, pipetez directement 100 μL de tampon d’élution d’ADN sur la membrane de la colonne, incubez à température ambiante pendant 1 min, puis centrifugez à 6 000 × g pendant 1 min pour éluer. REMARQUE : L’élution avec 100 μL (au lieu de 200 μL) augmente la concentration finale d’ADN dans l’éluat, mais diminue également le rendement global en ADN. Pour maximiser le rendement en ADN, répétez l’élution une fois comme décrit à l’étape 2.8.</li>
	<li>Conservez les échantillons d’ADN à 4 °C (jusqu’à 1 semaine) ou à -80 °C pour un stockage à long terme.</li>
</ol>3. Détection de la concentration d’ADN
<ol><li>Déterminer les valeurs de OD 260 et OD 280 pour comparer la pureté de l’ADN et la concentration en acides nucléiques par lecteur de microplaques. Répétez l’opération trois fois sur chaque échantillon.</li>
	<li>Déterminez la concentration de l’ADN extrait à l’aide d’un fluoromètre à l’aide de son kit compagnon, avec trois répétitions pour chaque échantillon.<ol><li>Prenez 190 μL de solution de travail dans deux tubes à centrifuger de 0,5 mL, prenez 10 μL chacun de l’Étalon #1 et de l’Étalon #2, ajoutez-les aux solutions de travail et conservez-les à l’abri de la lumière pendant au moins 15 min. REMARQUE : L’étalon #1 et l’étalon #2 sont étalonnés avec précision pour une certaine concentration d’ADN. Les solutions standard doivent être configurées avec précision pour assurer la formation d’une courbe standard précise. L’étalon #1 est un échantillon d’ADN double brin (ADNdb) de 0,2 ng/μL ; la norme #2 est de 2 000 ng/μL. La solution de travail est un colorant qui se lie spécifiquement à l’ADNdb.</li>
		<li>Prélever 2 μL d’ADN d’essai et les mélanger avec 198 μL de solution de travail dans un tube à centrifuger de 0,5 mL, et les tenir à l’abri de la lumière pendant au moins 15 min. REMARQUE : Si la concentration d’ADN est faible, ajouter 5 μL d’ADN d’essai avec 195 μL de solution de travail.</li>
		<li>Après 15 min, allumez l’instrument et sélectionnez Mesure de la concentration d’ADNdb | Longue portée. Tout d’abord, testez la norme #1, puis la norme #2 pour obtenir la courbe standard. REMARQUE : La solution standard doit être utilisée le jour même de sa configuration ; Le laisser trop longtemps entraînera une erreur importante dans la courbe standard.</li>
		<li>Placez les échantillons à tester dans les puits de dosage un par un, ajustez le volume de dopage d’ADN à 2 μL, répétez la mesure trois fois, prenez la valeur moyenne et enregistrez.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Détection PCR et électrophorétique
REMARQUE : La séquence du gène CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> mitochondrial d’une longueur de 278 pb a été prélevée pour l’amplification par PCR avec l’amorce directe C1-J-2495 : CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG, et l’amorce inverse C1-N-2800 : CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC8, puis l’électrophorèse sur gel d’agarose à 2 % a été effectuée pour vérifier l’effet d’amplification et la longueur des produits d’amplification a été vérifiée.
<ol><li>Mettre en place 20 μL du système d’amplification PCR en ajoutant 10 μL de mélange 2x Taq, 1 μL de chaque amorce, 5 μL de ddH2O et 3 μL d’ADN matrice ; Bien mélanger pendant 10 s dans une centrifugeuse.</li>
	<li>Utilisez les paramètres de cycle PCR suivants : prédénaturation 95 °C pendant 10 min ; dénaturation 95 °C pendant 30 s, recuit 48 °C pendant 30 s, extension 72 °C pendant 45 s pour un total de 40 cycles ; et extension finale à 72 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Soumettre les produits après PCR à une électrophorèse sur gel d’agarose à 2 %, et après électrophorèse, les placer sur un système d’imagerie sur gel pour l’analyse photo.</li>
</ol>

Évaluation de la pureté et de la concentration de l’ADN dans des échantillons de mouches nécrophiles fraîches et anciennes

<ol><li>Amendt, J., Richards, C. S., Campobasso, C. P., Zehner, R., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forensic+entomology%3A+applications+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Med+Pathol%22%5BJournal%5D)">Forensic entomology: applications and limitations.</a> Forensic Sci Med Pathol. 7 (4), 379-392 (2011).</li>
<li>Wydra, J., Matuszewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+optimal+post-eclosion+interval+while+estimating+the+post-mortem+interval+based+on+an+empty+puparium%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Med+Pathol%22%5BJournal%5D)">The optimal post-eclosion interval while estimating the post-mortem interval based on an empty puparium.</a> Forensic Sci Med Pathol. 17 (2), 192-198 (2021).</li>
<li>Mazzanti, M., Alessandrini, F., Tagliabracci, A., Wells, J. D., Campobasso, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+degradation+and+genetic+analysis+of+empty+puparia%3A+genetic+identification+limits+in+forensic+entomology%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">DNA degradation and genetic analysis of empty puparia: genetic identification limits in forensic entomology.</a> Forensic Sci Int. 195 (1-3), 99-102 (2010).</li>
<li>Odeniran, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((molecular+identification+and+distribution+of+Trypanosome-transmitting+Dipterans+from+cattle+settlements+in+Southwest+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Parasitol%22%5BJournal%5D)">molecular identification and distribution of Trypanosome-transmitting Dipterans from cattle settlements in Southwest Nigeria.</a> Acta Parasitol. 66 (1), 116-128 (2021).</li>
<li>Wells, J. D., Stevens, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+DNA-based+methods+in+forensic+entomology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Application of DNA-based methods in forensic entomology.</a> Annu Rev Entomol. 53, 103-120 (2008).</li>
<li>Kotrba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+in+forensic+entomology-establishing+a+DNA+reference+library+of+potentially+forensic+relevant+arthropod+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding in forensic entomology-establishing a DNA reference library of potentially forensic relevant arthropod species.</a> J Forensic Sci. 64 (2), 593-601 (2019).</li>
<li>Weedon, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+SNP+chips+to+detect+rare+pathogenic+variants%3A+Retrospective%2C+population+based+diagnostic+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Use of SNP chips to detect rare pathogenic variants: Retrospective, population based diagnostic evaluation.</a> BMJ. 372, 214(2021).</li>
<li>Cai, J. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+availability+of+mitochondrial+DNA+cytochrome+oxidasegene+for+the+distinction+of+forensically+important+flies+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Entomologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">The availability of mitochondrial DNA cytochrome oxidasegene for the distinction of forensically important flies in China.</a> Acta Entomologica Sinica. 48 (3), 380-385 (2005).</li>
<li>Khayrova, A., Lopatin, S., Varlamov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+chitin%2C+chitosan+and+their+melanin+complexes+from+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Obtaining chitin, chitosan and their melanin complexes from insects.</a> Int J Biol Macromol. 167, 1319-1328 (2021).</li>
<li>Guo, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+DNA+extracting+methods+from+different+parts+of+common+necrophagous+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Henan+Univ+Sci+Tech+%28Med+Sci%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of three DNA extracting methods from different parts of common necrophagous flies.</a> J Henan Univ Sci Tech (Med Sci). 36 (02), 130-133 (2018).</li>
<li>Du, H., Xie, H., Ma, M., Igarashi, Y., Luo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+methods+obtain+high-quality+DNA+and+RNA+from+anaerobic+activated+sludge+at+a+wide+range+of+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Modified methods obtain high-quality DNA and RNA from anaerobic activated sludge at a wide range of temperatures.</a> J Microbiol Methods. 199, 106532(2022).</li>
<li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J Vis Exp. (48), e2699(2011).</li>
<li>Masago, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+fluorimetry+%28Qubit%29+and+spectrophotometry+%28NanoDrop%29+in+the+quantification+of+DNA+and+RNA+extracted+from+frozen+and+FFPE+tissues+from+lung+cancer+patients%3A+A+real-world+use+of+genomic+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina+%28Kaunas%29%22%5BJournal%5D)">Comparison between fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of DNA and RNA extracted from frozen and FFPE tissues from lung cancer patients: A real-world use of genomic tests.</a> Medicina (Kaunas). 57 (12), 1375(2021).</li>
<li>Ponti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+fluorimetry+%28Qubit%29+and+spectrophotometry+%28NanoDrop%29+in+the+quantification+of+cell-free+DNA+%28cfDNA%29+in+malignant+melanoma+and+prostate+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients.</a> Clin Chim Acta. 479, 14-19 (2018).</li>
<li>Adams, Z. J., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+used+for+the+killing+and+preservation+of+blowfly+larvae%2C+and+their+effect+on+post-mortem+larval+length%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">Methods used for the killing and preservation of blowfly larvae, and their effect on post-mortem larval length.</a> Forensic Sci Int. 138 (1-3), 50-61 (2003).</li>
<li>Fliegerova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+DNA+extraction+and+sample+preservation+method+on+rumen+bacterial+population%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Effect of DNA extraction and sample preservation method on rumen bacterial population.</a> Anaerobe. 29, 80-84 (2014).</li>
<li>Rodrigues, B. L., Galati, E. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+taxonomy+of+phlebotomine+sand+flies+%28Diptera%2C+Psychodidae%29+with+emphasis+on+DNA+barcoding%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Trop%22%5BJournal%5D)">Molecular taxonomy of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae) with emphasis on DNA barcoding: A review.</a> Acta Trop. 238, 106778(2023).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

L’extraction de l’ADN est le maillon le plus critique dans l’identification moléculaire des mouches nécrophiles, et sa méthode d’extraction et la qualité de l’ADN extrait affectent directement la détection ultérieure. Dans cette expérience, nous avons réussi à extraire de l’ADN de mouches nécrophiles en utilisant un kit de sang commun, sans avoir besoin d’acheter un kit spécial d’extraction d’ADN d’insecte, ce qui rend l’extraction de l’ADN d’insecte plus facile à réaliser.
La surface des mouches est riche en chitine, en particulier aux stades larvaire et nymphal où la chitine épidermique peut atteindre 60-70%, ce qui rend difficile l’extraction de l’ADN des mouches nécrophiles9. Nous avons constaté au cours du processus d’extraction que si l’échantillon était humide, bien que nous l’ayons cisaillé de manière adéquate, l’échantillon restait gélatineux lorsque la protéinase K était appliquée pour la digestion. Cela empêchait le liquide ajouté de repasser à travers la colonne d’adsorption. Pour résoudre ce problème, nous avons d’abord appliqué de l’azote liquide pour congeler rapidement les échantillons afin de rendre les mouches cassantes et faciles à broyer, ainsi que faciles à digérer. Si l’azote liquide n’est pas disponible pour le broyage et que l’efficacité de l’extraction de l’ADN doit encore être améliorée, les échantillons de mouches peuvent être placés dans un endroit ventilé pendant environ 48 h. Les échantillons peuvent être laissés sécher avant d’être correctement cisaillés et ensuite extraits d’ADN.
Étant donné que la dégradation de l’ADN des anciens échantillons était plus préoccupante, des échantillons de thorax de mouches ont été sélectionnés pour l’extraction de l’ADN dans cette expérience en raison de la teneur élevée en ADN du thorax. Cependant, l’utilisation du thorax perturbe trop l’intégrité morphologique de la mouche pour la préservation complète des preuves ultérieures et la nécessité d’une identification morphologique. Les échantillons sont difficiles à extraire lorsque le thorax était en train de pourrir. Si les échantillons sont frais, l’extraction de l’ADN du pied et de l’aile peut être préférable. Le pied et l’aile sont répartis symétriquement et bilatéralement, et des caractéristiques morphologiques plus complètes peuvent être conservées après l’extraction de tissu d’un côté. Cependant, la concentration d’ADN extrait de l’aile et du pied est relativement faible, ce qui est risqué pour les études ultérieures. De plus, les échantillons étaient petits et se perdaient facilement10.
Lors de l’utilisation du kit d’extraction d’ADN pour l’extraction de l’ADN, les valeurs OD260/OD280 mesurées par le lecteur de microplaques étaient supérieures à 2, sauf pour l’échantillon ancien 2. Tout d’abord, il peut être déterminé que la protéine a été éliminée plus complètement, mais il peut y avoir une contamination par l’ARN, des cassures double brin de l’ADN dues à une centrifugation répétée ou une dégradation de l’ADN dans les anciens échantillons11. Deuxièmement, cela peut également indiquer que l’alcool prolonge la conservation de l’ARN.
La concentration d’ADN est calculée à partir de la valeur OD260 du lecteur de microplaques, tandis que le fluorimètre Qubit est utilisé pour établir d’abord une courbe standard, puis mesurer la valeur d’absorbance pour calculer la concentration d’ADN. Les deux méthodes peuvent réaliser la mesure de la concentration d’ADN trace, mais chacune a ses avantages et ses inconvénients : Le lecteur de microplaques applique OD260 pour calculer la concentration d’ADN, mais sa méthode de calcul est aussi une estimation. Si l’échantillon est mélangé avec un grand nombre de nucléotides ou de protéines et d’autres substances capables d’absorber la lumière ultraviolette, l’erreur photométrique sera plus importante, nous devons donc essayer de les éliminer au préalable.
Les lecteurs de microplaques et les spectrophotomètres UV utilisent l’absorbance UV pour la détection, qui ne peut pas faire la distinction entre l’ADN, l’ARN, les acides nucléiques dégradés, les nucléotides libres et d’autres impuretés, et l’absorbance est également fortement affectée par la contamination d’autres substances, ce qui rend ses lectures relativement peu fiables. Lors de l’enrichissement des échantillons, qui sont généralement mesurés en gouttes, les échantillons sont enrichis directement sans dilution ni traitement, ce qui permet de mesurer simultanément plusieurs échantillons et de calculer directement la pureté de l’ADN à partir de mesures OD260/OD280. Le fluorimètre Qubit, quant à lui, est conçu pour mesurer uniquement la concentration d’ADN double brin en appliquant deux solutions étalons de concentration connue pour établir une courbe standard et en appliquant les caractéristiques des colorants fluorescents qui se lient spécifiquement à l’ADN double brin. Cependant, chaque échantillon doit être prétraité individuellement, puis mesuré individuellement, ce qui est fastidieux pour les applications d’échantillons par lots, et la pureté de l’ADN extrait ne peut pas être mesurée. Dans l’application spécifique des deux peuvent être sélectionnés en fonction de leurs propres besoins pour les tests de qualité de l’ADN 12,13,14.
La concentration d’ADN des échantillons frais était supérieure à celle des anciens échantillons placés dans de l’alcool et supérieure à celle des anciens échantillons non traités, que la concentration d’ADN ait été mesurée par un lecteur de microplaques ou un fluorimètre Qubit. Pour un stockage à long terme, les échantillons peuvent être immergés dans de l’alcool pour empêcher la croissance des bactéries et des champignons15,16.
Les différentes méthodes de mesure ont eu moins d’impact sur les mesures d’ADN d’anciens échantillons sans aucun traitement, probablement parce que les anciens échantillons étaient plus dégradés, en particulier les protéines et l’ARN peuvent tous être dégradés plus rapidement que l’ADN. En revanche, les échantillons frais contenaient plus de protéines et d’ARN et, par conséquent, avaient un impact plus important sur les résultats. Si seules les concentrations d’ADN double brin sont comparées, nous devrions utiliser les résultats du fluorimètre Qubit, et les résultats de nos expériences ont également créé un gradient de concentration d’ADN significatif dans les anciens et les nouveaux échantillons.
Le contenu en ADN des échantillons frais et anciens après l’extraction de l’ADN peut être utilisé pour l’analyse ultérieure de la biologie moléculaire. Comme dans cette expérience, les amorces sélectionnées pour le gène CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> mitochondrial n’étaient que de 278 pb, et toutes ont pu être amplifiées avec succès par l’ADN. Le gène CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> mitochondrial est, à son tour, un locus reconnu chez les mouches pour son potentiel de codage à barres de l’ADN, permettant ainsi l’identification d’espèces de mouches nécrophiles par analyse de séquençage ultérieure17. La biologie moléculaire d’échantillons conservés plus longtemps peut être réalisée avec succès en sélectionnant des amorces pour d’autres séquences d’ADN plus courtes. Il est à noter que les bandes électrophorétiques des anciens échantillons avaient deux bandes avec des positions différentes et des séquences plus courtes, probablement en raison de l’amplification non spécifique des amorces causée par la dégradation de l’ADN couplée à la faible température de recuit.
Cependant, dans cette expérience, moins d’échantillons ont été conservés pendant une longue période pour satisfaire le besoin d’expériences répétitives, alors que les résultats ne nécessitaient que des échantillons représentatifs. Par conséquent, nous n’avons pas effectué de test de répétabilité, qui peut être exploratoire pour la préservation d’échantillons anciens et nouveaux, mais n’affecte pas la réussite de l’extraction d’échantillons de mouches nécrophiles.
En résumé, l’utilisation d’un kit d’extraction d’ADN sanguin peut également aider à l’extraction de l’ADN de mouche nécrophile. Les échantillons anciens et nouveaux peuvent être extraits avec succès, et tout l’ADN extrait peut être utilisé pour une analyse ultérieure. L’alcool est également favorable à la conservation à long terme des échantillons d’ADN de mouches.

<a href="https://app.jove.com/t/6604">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/66737">10.3791/66737</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/66737">DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples</a>. The Authors section was updated.

Erratum: DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples

L’inférence de l’heure du décès a toujours été l’une des questions clés et difficiles à résoudre dans la pratique judiciaire. Dans la pratique de la science médico-légale, pour une affaire criminelle, la détermination de l’intervalle post-mortem joue un rôle crucial dans la déduction de l’heure du crime, l’enfermement du suspect et la réduction de la portée de l’enquête. Les méthodes traditionnelles d’inférence de l’heure du décès sont basées principalement sur des phénomènes d’autopsie précoces, qui ne peuvent généralement être utilisés que pour déduire l’heure du décès dans les 24 heures. Cependant, la longue durée de la mort ne peut pas être déterminée par des phénomènes post-mortem. Il est maintenant généralement reconnu dans la communauté des sciences judiciaires que l’entomologie médico-légale a le potentiel d’être une méthode efficace pour déduire une durée de décès plus longue.
Les insectes nécrophages doivent leur nom à leurs larves qui se nourrissent de cadavres. Parmi elles, chaque fois qu’un cadavre est présent, les mouches nécrophiles adultes seront les premières à atteindre le cadavre et à pondre leurs œufs ou larves. Les larves se nourrissent de tissus cadavres et deviennent des nymphes, qui deviennent des adultes. Les mouches nécrophiles jouent un rôle énorme dans la pratique de la science médico-légale en raison de leur cycle de vie régulier et de leur distribution géographique, par exemple, en déduisant l’heure du décès et en déterminant le lieu du décès 1,2. Cependant, l’obstacle à l’utilisation de mouches nécrophiles dans la pratique médico-légale est l’identification des espèces. Les méthodes morphologiques sont toujours utilisées comme méthode faisant autorité pour l’identification des espèces de mouches nécrophiles. Cependant, l’identification morphologique des espèces nécessite un haut degré d’intégrité des insectes. Si les mouches étaient à des stades de développement différents, ou en raison de changements morphologiques causés par des choix environnementaux, tout cela rend l’examen morphologique plus difficile. En particulier, la morphologie des pupes et des coquilles de nymphes, que l’on trouve le plus souvent sur les lieux du crime, est à peine reconnaissable. Ceci, associé à la rareté des experts en morphologie, rend extrêmement difficile l’identification morphologique des espèces. Par conséquent, l’application de méthodes de biologie moléculaire pour l’identification des espèces de mouches a émergé, ce qui réduit la difficulté de l’identification morphologique et est indépendant des stadesde développement 3, 4, 5, 6, 7.
La première étape de l’identification des espèces de mouches nécrophiles basée sur des méthodes de biologie moléculaire est l’extraction efficace de l’ADN, tandis que des kits spécialisés pour l’extraction de l’ADN des insectes ne sont pas couramment disponibles actuellement. Et la façon d’utiliser les kits de sang courants pour l’extraction de l’ADN des mouches nécrophiles devient plus pertinente sur le plan médico-légal. Les mouches nécrophiles trouvées sur les scènes de crime sont souvent mutilées ou ont subi une décomposition et une dégradation de l’ADN. Les échantillons de mouches ne sont pas immédiatement disponibles pour l’extraction de l’ADN après l’acquisition ou, si possible, des échantillons complets doivent être conservés en raison des exigences de préservation des preuves. Sur la base des exigences ci-dessus, dans cette étude, nous avons appliqué le kit d’ADN sanguin basé sur la digestion à la protéinase K, et sélectionné trois échantillons frais de Chrysomya megacephala (Diptères, Lépidoptères) (Figure 1), un échantillon ancien de C. megacephala placé dans de l’alcool pendant deux ans, et un échantillon de C. megacephala placé dans un stockage à l’abri de la lumière pendant deux ans, pesé chacun des cinq échantillons, choisi le tissu du thorax d’insecte pour l’extraction de l’ADN. En comparant la qualité et la pureté de l’ADN extrait de l’ancien et du nouvel échantillon, l’amplification par PCR et l’électrophorèse de l’ADN extrait ont été réalisées avec des amorces spécifiques à la mouche nécrophile situées dans la séquence du gène CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> mitochondrial.

<table><tbody><tr><td>Tampon AE</td><td>Qiagen</td><td>Tampon d’élution d’ADN 172026832</td><td></td></tr><tr><td>Tampon AL</td><td>Qiagen Tampon</td><td>172028374</td><td>de lyse</td></tr><tr><td>Tampon ATL Tampon de</td><td>lyse tissulaire</td><td>Qiagen</td><td>172028162</td></tr><tr><td>Tampon AW1</td><td>Tampon d’élimination des protéines</td><td>172028760</td><td>Qiagen</td></tr><tr><td>Tampon AW2</td> Tampon de <td>dessalement</td> <td>57203108</td><td>Qiagen</td></tr><tr><td>C1-J-2495</td><td>Taihe Biotechnology</td><td>TW21109216</td><td>amorce de préambule</td></tr><tr><td>C1-N-2800</td><td>Taihe Biotechnology</td><td>TW21109217</td><td>amorce inverse</td></tr><tr><td>D2000 Échelle d’ADN</td><td>Real-Times(Beijing) Biotechnologie</td><td>RTM415</td><td>Mesurer la position des bandes électrophorétiques</td></tr><tr><td>DNeasy Mini colonne de spin</td><td>Qiagen</td><td>166050343</td><td>Colonne d’adsorption d’ADN Incubateur</td></tr> à <tr><td>bain sec</td><td>Miulab</td><td>DKT200-2D</td><td>utilisé pour le chauffage</td></tr><tr><td>MIX-30S Mini Mixer</td><td>Miulab</td><td>MUC881206</td><td>action oscillatoire</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Qiagen</td><td>172026218</td><td>Inactivation des nucléases intracellulaires et autres protéines</td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit 3.0 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>2321611188</td><td></td></tr><tr><td>Speed Micro-centrifugeuse</td><td>Scilogex</td><td>9013001121</td><td>centrifugeuse</td></tr><tr><td>Standard#1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2342797</td><td></td></tr><tr><td>Standard#2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2342797</td><td></td></tr><tr><td>Tanon 3500R Gel Imager</td><td>Tanon</td><td>16T5553R-455</td><td>gel imaging</td></tr><tr><td>Taq Mix Pro</td><td>Monad</td><td>00007808-140534</td><td>Mélange PCR</td></tr><tr><td>Taq Mix Pro</td><td>Monad</td><td>00007808-140534</td><td>Mélange</td></tr> <tr><td>PCRThermocycleur</td><td>Zhuhai Hema</td><td>VRB020A</td><td>solution de travail PCR ordinaire</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2342797</td><td></td></tr></tbody></table>

extraction d’adn et comparaison entre des échantillons de mouches nécrophiles anciennes et fraîches

DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples

Au total, cinq échantillons d’échantillons de Chrysomya megacephala - trois échantillons frais, un échantillon stocké dans de l’alcool pendant 2 ans et un échantillon stocké dans un stockage scellé à sec pendant 2 ans à l’abri de la lumière seulement - ont été sélectionnés pour déterminer si un kit d’extraction d’ADN sanguin pouvait extraire de l’ADN de mouches nécrophiles et pour déterminer si l’alcool pouvait prolonger la conservation de l’ADN des mouches nécrophiles. Tout d’abord, le kit d’extraction d’ADN sanguin a été utilisé pour extraire l’ADN des tissus de leur thorax. Ensuite, la pureté et la concentration de l’ADN ont été examinées à l’aide d’un lecteur de microplaques et d’un fluorimètre. Enfin, l’amplification par PCR et l’électrophorèse de l’ADN extrait ont été réalisées avec des amorces spécifiques à la mouche nécrophile situées dans la séquence du gène mitochondrial CO I. Les résultats ont montré que la pureté de l’ADN de tous les échantillons était supérieure à 2,0. On a observé que la concentration d’ADN était de l’ordre suivant : des échantillons frais > des échantillons anciens conservés dans de l’alcool > des échantillons anciens non traités. Tous les échantillons présentaient des bandes électrophorétiques spécifiques après amplification par PCR. En conclusion, un kit d’extraction d’ADN sanguin peut être utilisé pour extraire avec succès l’ADN des mouches nécrophiles, et la concentration d’ADN des échantillons de mouches fraîches est supérieure à celle des anciens échantillons de mouches. Les mouches peuvent être stockées dans l’alcool pendant une longue période.

Nous avons utilisé un lecteur de microplaques pour mesurer les valeurs de OD260 et OD280 de la solution d’ADN extraite, puis nous avons obtenu les valeurs OD260/OD280 pour évaluer la pureté de l’ADN. La DO 260/OD280 de tous les échantillons frais et de l’ancien échantillon 1 était supérieure à 2. Les OD260/OD280 de l’ancien échantillon 2 avaient une valeur maximale de 2,187 bien que la moyenne soit de 1,753, et ses trois mesures ont beaucoup fluctué en raison des petites valeurs (≤0,01) de ses OD280 et OD280 (tableau 1). Sur la base de la valeur de OD260 obtenue, nous avons estimé la concentration d’ADN. La concentration d’ADN des trois était de l’ordre suivant : des échantillons frais &gt; l’ancien échantillon 1 &gt; l’ancien échantillon 2, mesurés à l’aide du lecteur de microplaques, mais la différence entre les échantillons frais et les anciens échantillons était faible, seulement ~10-20 ng/μL (Tableau 1), tandis que la concentration d’ADN des trois échantillons frais mesurée par le fluorimètre Qubit était supérieure à celle mesurée par le lecteur de microplaques de 125-130 ng/μL, avec une différence de 15 ng/μL dans l’ancien échantillon 1 et de seulement 1,3 ng/μL dans l’ancien échantillon 2. La concentration d’ADN des échantillons frais &gt; ancien échantillon 1 &gt; ancien échantillon 2 (tableau 2).
L’ADN extrait par la méthode d’extraction actuellement utilisée contient tous les composants d’ADN provenant de différentes sources dans l’échantillon. Cela signifie que la solution d’ADN n’était pas seulement une solution d’ADN génomique de mouche. Les amorces permettant d’amplifier spécifiquement les fragments du gène CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> mitochondrial de la mouche ont été sélectionnées en consultant la littérature et vérifiées par NCBI-Blast Primer. Les résultats ont montré que l’amorce avant C1-J-2495 et l’amorce inverse C1-N-2800 du gène CO mitochondrial <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> étaient des amorces spécifiques aux mouches avec un polymorphisme de séquence et couvraient de nombreuses espèces de mouches. Les résultats de l’amplification n’ont pas montré de gènes humains. Il s’agissait d’une paire de biomarqueurs d’ADN fiables pour l’identification des mouches nécrophiles et ont été sélectionnés pour la vérification des résultats de cette expérience.
Tous les différents échantillons ont montré des bandes électrophorétiques évidentes avec des longueurs allant de 250 à 400 pb. Les bandes étaient plus brillantes dans les échantillons frais que dans les anciens échantillons, et les anciens échantillons placés dans de l’alcool (Figure 2, Old1) étaient plus brillants que les anciens échantillons non traités (Figure 2, Old2), mais les anciens échantillons avaient également deux bandes dans des positions différentes. La commande à blanc n’avait pas de bandes (figure 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66737/66737fig01.jpg"> Figure 1 : Images de Chrysomya megacephala sous différents angles. (A) Mâle ; (B) femelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66737/66737fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66737/66737fig02.jpg"> Figure 2 : Électrophérogramme des produits d’amplification PCR. Les trois premières bandes à partir de la gauche sont des produits d’amplification PCR de l’ADN provenant d’échantillons de mouches fraîches. La quatrième bande électrophorétique est le produit PCR de l’ADN de l’ancien échantillon de mouche conservé dans de l’alcool. La cinquième bande est le produit PCR de l’ADN de l’ancien échantillon de mouche sans aucune conservation spéciale. La sixième bande est une commande à vide ; il est propre, ce qui prouve qu’aucune contamination ne s’est produite lors de l’amplification par PCR. À l’extrême droite se trouve l’échelle de l’ADN, où nous avons étiqueté les positions de l’ADN avec des longueurs de 250 pb et 400 pb. Les bandes électrophorétiques de tous les échantillons des produits PCR étaient légèrement supérieures à 250 pb et inférieures à 400 pb. Cette position correspond à la longueur du gène cible de 278 pb. Il est plus évident à l’œil nu que les bandes d’ADN représentant des échantillons frais sont plus brillantes que celles des échantillons anciens. Les anciens échantillons comprennent d’autres bandes d’ADN qui y sont présentes dans des gènes moins intenses, non cibles, de différentes longueurs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66737/66737fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Échantillon</td>
			<td>Frais1</td>
			<td>Frais2</td>
			<td>Frais3</td>
			<td>Vieux1</td>
			<td>Vieux2</td>
		</tr><tr><td>OD260/OD280</td>
			<td>2.354±0.036</td>
			<td>Réf. 2.245±0.027</td>
			<td>2.060±0.038</td>
			<td>2.143±0.012</td>
			<td>1.753±0.421</td>
		</tr><tr><td>ADN(ng/μL)</td>
			<td>119.91±1.686</td>
			<td>Référence 116.084±4.965</td>
			<td>95.239±3.401</td>
			<td>86.845±6.14</td>
			<td>10.151±0.168</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Mesure de la pureté et de la concentration de l’ADN à l’aide d’un lecteur de microplaques.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Échantillon</td>
			<td>Frais1</td>
			<td>Frais2</td>
			<td>Frais3</td>
			<td>Vieux1</td>
			<td>Vieux2</td>
		</tr><tr><td>ADN(ng/μL)</td>
			<td>Référence 243.333±1.528</td>
			<td>Référence 237.667±2.082</td>
			<td>226.000±2.000</td>
			<td>101.000±0.000</td>
			<td>11.433±0.058</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Mesure de la concentration d’ADN à l’aide d’un fluorimètre.

Cet article décrit un protocole pour l’extraction de l’ADN de mouches nécrophiles fraîches et anciennes à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN commun modifié.

Extraction d’ADN et comparaison entre des échantillons de mouches nécrophiles anciennes et fraîches

A total of five samples of Chrysomya megacephala samples - three fresh samples, one sample stored in alcohol for 2 years, and one sample stored in dry ...

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