Name: Démystifier l’imagerie par bioluminescence in vivo d’un modèle murin de la maladie de Chagas pour des études d’efficacité de médicaments (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Découvrez l'imagerie par bioluminescence in vivo chez la souris pour évaluer l'efficacité des médicaments antiparasitaires contre Trypanosoma cruzi. Cette méthode permet le suivi longitudinal non invasif de la charge parasitaire.

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Les auteurs remercient Amanda Franscisco, John Kelly et Fanny Escudié pour leur formation et leur soutien sur les tests d’efficacité des médicaments, John Kelly et Simone Calderano pour leur soutien dans les études sur les animaux. A.C.S a reçu une bourse CAPES PSDE pour une formation à la London School of Hygiene and Tropical Medicine (Royaume-Uni). Les auteurs tiennent également à remercier la plateforme de recherche en cytométrie en flux et en imagerie (FLUIR) de la plateforme de recherche scientifique de l’Université de São Paulo (CEFAP-USP) pour son soutien technique pour l’analyse de l’équipement IVIS Spectrum, et le Laboratoire de génétique et de contrôle sanitaire ICB-USP pour les tests post-expérimentation pour le contrôle de la qualité des souris en tant qu’exemptes d’agents pathogènes spécifiques. Ce projet a été financé par DNDi. DNDi est reconnaissante envers ses donateurs, publics et privés, qui ont financé toutes les activités de DNDi depuis sa création en 2003. Une liste complète des donateurs de DNDi se trouve à https://dndi.org/about/donors/.

Protocole pour le modèle bioluminescent in vivo de l’évaluation des médicaments contre la maladie de Chagas

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

L’imagerie par bioluminescence est une méthode révolutionnaire qui permet de détecter un gène rapport à l’aide d’un spectre visible et infrarouge de rayonnement électromagnétique. Par conséquent, il n’est pas nécessaire d’utiliser des marqueurs radiomarqués pour tracer votre échantillon35. BLI convient aux modèles de rongeurs et à d’autres petites espèces. Il est très utile pour les études précliniques car il est plus sûr et permet plusieurs tours d’image, causant un minimum d’inconfort chez les animaux. De plus, l’imagerie in vivo est très flexible en raison de la possibilité de combiner la bioluminescence, la fluorescence et d’autres techniques telles que la tomographie par émission de positons36.
L’imagerie optique est régie par des propriétés physiques optiques, comme l’absorption et la diffusion. Tous les tissus absorbent et diffusent différemment la lumière de longueurs d’onde distinctes37. Une étape critique consiste à sélectionner un gène rapporteur sans tenir compte de la longueur d’onde émise de la lumière produite par la réaction chimique. Bien que le niveau d’expression d’un gène rapporteur puisse être élevé in vitro dans les essais bioluminescents, les mêmes niveaux d’expression peuvent ne pas être atteints lors de la progression vers le réglage in vivo. Dans ce protocole, nous avons utilisé la version optimisée pour le codon de Photinus pyralis luciferase (PpyRE9H)38 décalée vers le rouge pour les trypanosomatides9, qui émet de la lumière à 617 nm, l’une des plus appropriées pour les études in vivo 39. Les longueurs d’onde supérieures à 600 nm sont moins absorbées et diffusées par les chromophores endogènes du corps, en particulier l’hémoglobine et la mélanine. Ainsi, les lumières rouges peuvent être transmises à travers plusieurs centimètres de tissu, permettant aux photons d’atteindre la caméra CCD même depuis l’intérieur des tissus viscéraux39,40.
L’un des sujets de préoccupation dans les contextes d’imagerie est le manque de compréhension complète de leur fonction et de leurs effets. Le binning, une technique de prétraitement, combine les informations acquises par des détecteurs contigus dans un pixel plus grand. Ce processus améliore le rapport signal/bruit, réduisant le bruit de fond et améliorant la sensibilité. Cependant, il diminue la précision de la résolution spatiale, ce qui donne une image pixélisée41,42. Ce compromis est un élément important à prendre en compte dans votre stratégie d’imagerie.
Basée sur le profil de produit cible et le profil candidat cible pour la maladie de Chagas34, l’étude de preuve de concept est axée sur la sensibilité pour détecter T. cruzi et aider à établir si un nouveau candidat médicament peut obtenir une guérison stérile (représentée par l’absence de rechute après plusieurs cycles d’immunosuppression). Par conséquent, nous exécutons le BLI en utilisant le facteur de binning le plus élevé sans suraturer l’image. Lorsque l’image est saturée, une nouvelle acquisition est effectuée à l’aide d’un facteur de regroupement inférieur. Au cours de l’analyse, une correction mathématique est appliquée aux images qui nécessitent un regroupement différent. De cette façon, les données finales doivent être présentées à l’aide du même compartimentage. Le tableau 1 montre les différentes valeurs obtenues lorsque des facteurs de compartimentage distincts ont été appliqués dans la même image et les mêmes ROI.
Tableau 1 : Influence des paramètres de compartimentage sur la quantification du BLI. Quantification de trois ROI sur l’image du modèle aigu (d13) et du modèle chronique (d118), analysés dans différents facteurs de binning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/DaSilvaetal_Table1_Reviewed.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
En raison du scénario actuel de la maladie de Chagas en clinique, les efforts de découverte de médicaments visent à éliminer complètement les parasites (guérison parasitologique)27,34. Par conséquent, le protocole préclinique in vivo comprend des approches qui surmontent les limites de la sensibilité technique du BLI. L’une des approches consiste à traiter les souris avec du cyclophosphamide pour diminuer la réponse immunitaire qui contrôle la charge parasitaire. Une autre stratégie consiste à diminuer la profondeur des tissus et à éliminer les couches de muscles, de peau et de fourrure qui obstruent le chemin de la lumière vers l’appareil photo. Grâce à la procédure ex vivo, de petites taches bioluminescentes peuvent être détectées, révélant des foyers parasitaires inférieurs au seuil BLI in vivo, comme le montre la figure 5C résultant ex vivo de souris traitées par Posa.
La conception d’une expérience pilote pour évaluer le modèle lui-même et la dynamique de l’infection est cruciale pour établir une expérience précise d’évaluation de l’efficacité des médicaments antiparasitaires. Par conséquent, le chercheur sera en mesure de définir à l’avance les paramètres BLI appropriés et l’évolution du temps d’infection. Dans une expérience exploratoire, un outil qui peut être utile pour définir les paramètres d’acquisition est l'« exposition automatique ». À l’aide de cet outil, le chercheur établit la priorité de trois paramètres (Temps d’exposition, Binning et F/Stop) pour acquérir la meilleure image possible. En particulier, le chercheur doit s’assurer que les images sont acquises dans la plage dynamique de la caméra CCD, sans sursaturation ni sous-exposition, qui peut être vérifiée à travers les limites minimales et maximales de l’échelle et la fonction d’exposition automatique (Menu Édition > Préférences > Acquisition des onglets > Onglet Autoexposition). Dans ce protocole, l’ouverture de l’appareil photo a été réglée à la valeur maximale (F/Stop : 1), et différents temps d’exposition et facteurs de binning ont été définis pour les modèles aigus et chroniques. Ces paramètres permettent de prévoir le temps pour effectuer simultanément différents tours d’image. Étant donné que la méthode du rapporteur est basée sur une réaction enzymatique, la biodistribution du substrat dans la souris et la cinétique de la luciférase influencent le signal bioluminescent et, par conséquent, la quantification de l’infection (Figure 1B). Par conséquent, l’acquisition d’images à différents moments de la cinétique enzymatique introduit une variabilité des données qui ne peut être prise en compte ou corrigée et impacte le calcul du flux total (photons/seconde) ou de la luminance (photons/seconde/cm2/stéradian). De plus, l’infection à T. cruzi présente un positionnement spatial dynamique chez la souris (différentes zones et tissus, profondeur et charge parasitaire). Par conséquent, l’établissement d’une valeur de comptages à acquérir pourrait manquer des sources de signal plus faibles (faible nombre de parasites à un certain endroit plus profond dans le tissu) si la source d’un autre signal plus fort répond aux critères d’auto-exposition définis.
Une fonctionnalité délicate du logiciel Living Image est l’affichage de l’image acquise dans une échelle de couleurs automatique. Il n’est pas possible de prérégler l’échelle pour afficher automatiquement une toute nouvelle image acquise en fonction des valeurs d’échelle sélectionnées (voir l’étape 6.2 du protocole). Cette situation oblige le chercheur à modifier manuellement les images une par une aux valeurs max et min choisies. Par conséquent, les utilisateurs non expérimentés et mal formés ne disposent pas d’une lecture correcte pendant la session d’acquisition, et ils peuvent induire les données en erreur ou perdre des informations importantes à ce moment-là. Pour cela, l’expérience pilote est bénéfique.
L’une des questions les plus courantes concernant la conception de l’expérience de preuve de concept est de savoir comment choisir la durée et la dose du traitement. Pour les nouvelles entités chimiques, ces paramètres sont généralement définis par l’activité et la sélectivité du composé in vitro, en combinaison avec les données générées par le métabolisme et la pharmacocinétique des médicaments (DMPK) et les études de tolérabilité menées avant les tests d’efficacité in vivo. En résumé, après avoir identifié des composés capables de tuer sélectivement le parasite à l’intérieur des cellules, les premières expériences ADME (absorption, distribution, métabolisme et excrétion) sont réalisées in vitro pour estimer la solubilité aqueuse, la perméabilité cellulaire et la stabilité métabolique des composés, entre autres paramètres. Si les composés présentent un bon équilibre entre les propriétés in vitro (généralement définies dans les profils candidats cibles), ces candidats sont ensuite soumis à des études de pharmacocinétique (PK) in vivo chez des souris saines, qui décrivent l’exposition du composé dans le sang (et éventuellement aussi dans les tissus) et donnent une idée générale de la tolérabilité à différents niveaux de dose17, 34 et 43. Idéalement, l’objectif de l’évaluation pharmacocinétique dans la plupart des maladies infectieuses est de déterminer s’il est possible d’atteindre des concentrations plasmatiques libres (corrigées de la liaison aux protéines plasmatiques) supérieures aux concentrations EC50/EC90 44 - la concentration efficace qui tue ou au moins inhibe la croissance de 50 % ou 90 % des parasites, respectivement - pendant une période suffisamment longue. Si l’exposition est suffisante à un certain niveau de dose, ce schéma peut être utilisé lors des études d’efficacité en utilisant le modèle BLI de Chagas. Pour les études de repositionnement de médicaments, des données pharmacocinétiques in vitro et in vivo doivent être disponibles. Les bases de données chimiques telles que PubChem45 constituent un bon point de départ pour le reprofilage des médicaments, qui fournissent des données reconnues qui peuvent être converties en souris à l’aide de l’échelle allométrique46 pour estimer les schémas de traitement sûrs et non toxiques à tester. Cependant, ce n’est pas toujours le cas. Les études pharmacocinétiques sont encore un domaine négligé dans la science universitaire, et peu d’entreprises pharmaceutiques publient leurs résultats pharmacocinétiques. La communauté scientifique de la découverte de médicaments recommande d’inclure l’évaluation pharmacocinétique in vivo ainsi que les tests d’efficacité des médicaments (pharmacodynamique)47. Par conséquent, l’imagerie préclinique est compatible avec les mesures simultanées de composés, et cette approche associée améliore la robustesse des données.
De plus, la manipulation, le poids et l’état de santé des souris sont surveillés tout au long de l’expérience. Les signes de toxicité et les effets secondaires tels que la courbure, les tremblements, la perte d’équilibre, la réticence à bouger, la réticence à manger ou à boire, la prostration ou toute autre anomalie présente dans le groupe ou par des affections individuelles chez la souris doivent être enregistrés et signalés dans les études précliniques. L’un des objectifs de l’imagerie optique est d’assurer le bien-être des animaux. Ainsi, des critères d’évaluation sans cruauté doivent être appliqués chez les souris présentant des signes de douleur décrits sur l’échelle de Grimace48. De plus, les souris ont été pesées chaque semaine lors de l’acquisition de BLI et, plus souvent, lors de l’administration de médicaments et du traitement CTX. Conformément à la réglementation sur le bien-être animal, les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids corporel doivent être immédiatement euthanasiées sans cruauté.
Le modèle bioluminescent de T. cruzi est aujourd’hui le modèle expérimental de pointe pour la découverte et le développement de nouveaux traitements contre la maladie de Chagas. Un modèle qui reproduit les principales caractéristiques de l’infection à T. cruzi et de la maladie de Chagas49, permettant de surveiller en temps réel la parasitémie et la différenciation de composés avec des profils d’efficacité variés associés à des modes d’action connus. BLI est une technique qui renforce l’affirmation de soi dans l’identification des tissus infectés. Il permet la sélection précise des tissus infectés à utiliser dans un large éventail d’approches, y compris toutes les méthodes classiques déjà appliquées dans la recherche sur T. cruzi 50,51. De plus, il permet aux chercheurs d’explorer des technologies de pointe et d’en développer de nouvelles33. De plus, BLI permet une amélioration du bien-être animal et une utilisation plus rationnelle selon les principes 3R 10,35, tout à la fois.
Plusieurs groupes de recherche axés sur les maladies tropicales négligées sont placés dans des pays où les appareils d’imagerie in vivo ne sont pas disponibles. Pour surmonter le scénario actuel, de nouveaux réseaux internationaux tels que Global BioImaging et leurs consortiums associés promeuvent des actions visant à fournir un accès ouvert aux plateformes d’imagerie et à améliorer la formation du personnel et des scientifiques en imagerie52,53. Ces initiatives, ainsi que des protocoles d’utilisation conviviaux comme celui-ci, peuvent offrir des conditions de démocratisation des technologies haut de gamme pour tous les chercheurs. La mise en œuvre de cette méthode dans la découverte préclinique de médicaments a offert une solide lecture de l’efficacité et une valeur prédictive des résultats cliniques, facilitant ainsi la découverte de médicaments pour la maladie de Chagas.

La maladie de Chagas est endémique en Amérique latine et touche environ sept millions de personnes dans le monde1. Chaque année, plus de 50 000 décès et des pertes économiques d’environ 7 milliards de dollars résultent du caractère invalidant de cette maladie2. La maladie de Chagas est causée par le protozoaire Trypanosoma cruzi, un parasite hétéroxénique hémafloguélate capable d’infecter les mammifères (sauvages et domestiques) et les vecteurs triatomes (Hemiptera, Reduviidae)3 dans les Amériques, où la transmission vectorielle est établie. D’autres voies d’infection importantes comprennent la transfusion sanguine, la transplantation d’organes, la transmission orale (par l’ingestion d’aliments contaminés par un triatome infecté)4 et la transmission congénitale. Les voies de transmission non vectorielles ont contribué à la propagation de la maladie de Chagas dans les zones non endémiques 3,5.
La maladie de Chagas se manifeste en deux phases cliniques. La phase aiguë est, dans la plupart des cas, asymptomatique. Les infections symptomatiques sont généralement associées à des signes non spécifiques tels que la fièvre, la fatigue, la myalgie, la lymphadénopathie, la splénomégalie et l’hépatomégalie. La phase aiguë est également souvent associée à une parasitémie patente et à une circulation systémique des parasites. La mort peut survenir dans jusqu’à 10 % des cas diagnostiqués, en particulier dans les cas d’infection buccale6. La phase chronique est souvent caractérisée par une longue période d’absence de tout symptôme. Avec le temps, environ un tiers des patients infectés des décennies plus tôt présentent des manifestations cardiaques, généralement accompagnées de fibrose et d’inflammation du myocarde, et/ou de troubles gastro-intestinaux principalement liés au développement de syndromes du méga-œsophage et/ou du méga-côlon 3,5,6.
Le traitement étiologique de la maladie de Chagas ne comprend que deux médicaments : le benznidazole et le nifurtimox. Ces agents antiparasitaires sont disponibles depuis plus de 50 ans et ont une toxicité considérable et une efficacité limitée 5,7,8. Par conséquent, il est urgent de développer de nouveaux traitements sûrs et plus efficaces pour les patients atteints de la maladie de Chagas.
Des techniques plus sophistiquées et plus précises permettent aujourd’hui d’obtenir des réponses à des questions anciennes qui permettent des avancées dans la recherche de nouveaux traitements pour la maladie de Chagas. En ce sens, la communauté scientifique bénéficie grandement des parasites génétiquement modifiés pour les études in vivo sur l’évolution de l’infection et l’évaluation de l’efficacité des médicaments 9,10,11,12. Un test longitudinal basé sur le système d’imagerie par bioluminescence (BLI) permet d’évaluer l’efficacité pendant et après le schéma thérapeutique, conduisant à l’identification de composés ayant une activité trypanocide10,13. La méthode BLI fournit une mesure directe de la charge parasitaire, à la fois en circulation ou dans les tissus et les organes, grâce à la quantification de la lumière produite par la lignée11 de T. cruzi CL Brener Luc ::Neon génétiquement modifiée, qui exprime constitutivement la luciférase12 décalée vers le rouge.
Néanmoins, près de 10 ans après la mise en place du modèle animal BLI de la maladie de Chagas et des études d’efficacité des médicaments, seuls quelques groupes de recherche dominent cette technique. Cela est dû non seulement à l’accès limité à un équipement d’imagerie approprié, mais aussi au manque de formation et de disponibilité de protocoles structurés et détaillés. Cette méthode présente plusieurs avantages par rapport à d’autres approches, qui reposent sur l’évaluation de la parasitémie par microscopie, sérologie ou l’évaluation des infections d’organes/tissus par qPCR pour la détection de l’ADN du parasite, car elle permet d’améliorer le bien-être des souris et de réduire l’utilisation d’animaux par la possibilité de générer des données in vivo plus robustes et intégrées. De plus, cette méthode est sans doute plus sensible, car elle permet de détecter facilement les foyers parasitaires dans les organes viscéraux après un traitement médicamenteux10,12. Par conséquent, ce protocole vise à guider les groupes de recherche en parasitologie et autres maladies infectieuses pour établir cette méthodologie dans leurs laboratoires en détaillant les procédures techniques. Nous partageons ici l’expérience acquise grâce à la mise en œuvre du modèle BLI de la maladie de Chagas au Brésil, le premier du genre en Amérique latine, dans le cadre des efforts de découverte de médicaments coordonnés par l’initiative Médicaments contre les maladies négligées (DNDi).

<table><tbody><tr><td>BD LSRFortessa&commerce ; X-20 Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balance de pesée (animalerie)</td><td>Disponible chez plusieurs fournisseurs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td><td>Revvity (anciennement PerkinElmer)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJ Software v10.7.1</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software for Spectrum v4.7.1</td><td>Revvity (anciennement PerkinElmer)</td><td></td><td>Le logiciel d’analyse sans licence appelé 'Aura Imaging' peut être utilisé pour les fonctionnalités les plus basiques fournies par Spectral Instruments Imaging (Bruker company) (https://spectralinvivo.com/software/)</td></tr><tr><td>Logiciel Microsoft Office</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism v8.4.0</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM Low Glucose</td><td>Vitrocell</td><td>D0025</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine 0,5 % EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>LIT medium</td><td>In </td> hygromycine <td></td><td></td></tr><tr><td>B (50 mg/mL)</td><td>Gibco</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Grace&prime ; s Insecte Medium</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>G9771</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>IVISBrite d-luciferin sel de potassium</td><td>Revvity (anciennement PerkinElmer)</td><td>122799</td><td>Peut également être utilisé : VivoGlo Luciferin, grade in vivo (Promega/P1043) ; D-luciférine, sel monopotassique (Thermo Scientific/88293) ou PierceD-Luciférin, sel monosodique* (Thermo Scientific/88291) ; D-luciférine, sel de potassium (GoldBio/LUCK ou eLUCK) ; Sel de D-luciférine, sodium* (GoldBio/LUCNA ou eLUCNA) *Les différences de sel de sodium ou de potassium reposent sur des chances minimales de solubilité, mais n’affectent pas les performances in vivo.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Cyclophosphamide (CTX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0768-5g</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>(Hydroxypropyl)methyl cellulose (HPMC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09963-25G</td><td></td></tr><tr><td>Alcool benzylique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402834</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>P1754-1L</td><td></td></tr><tr><td>Benznidazole</td><td>ELEA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Posaconazole (Noxafil formulation commerciale)</td><td>Schering-Phough</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Disponible chez plusieurs fournisseurs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aiguille de gavage (acier inoxydable droite) - 22GA</td><td>Aton</td><td>&nbsp ; CA2003</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL et aiguille 31G</td><td>Disponible chez plusieurs fournisseurs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL et aiguille amovible 26G</td><td>Disponible chez plusieurs fournisseurs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL et aiguille amovible 24G X&frac34 ;</td><td>Disponible chez plusieurs fournisseurs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue stérile Filtre 0.2 &micro ; m</td><td>Disponible chez plusieurs fournisseurs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A4 Papier noir mat 120gr ou plus épais</td><td>Papier Couleur/ Canson (Disponible chez plusieurs fournisseurs)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>feuille d’aluminium</td><td>Disponible chez plusieurs fournisseurs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambre Neubauer</td><td>Disponible chez plusieurs fournisseurs</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

démystifier l’imagerie par bioluminescence in vivo d’un modèle murin de la maladie de chagas pour des études d’efficacité de médicaments

Demystifying In Vivo Bioluminescence Imaging of a Chagas Disease Mouse Model for Drug Efficacy Studies

Pour contrôler et réduire l’impact sur la santé publique des protozoaires humains tels que la maladie de Chagas, la leishmaniose et la trypanosomiase humaine africaine, il est nécessaire d’accélérer le développement de nouveaux médicaments et vaccins. Cependant, ce processus est rempli de difficultés telles que la biologie très complexe des parasites et la pathogenèse des maladies et, comme c’est souvent le cas pour les maladies tropicales négligées, le financement relativement limité de la recherche et du développement. Ainsi, des modèles d’étude in vitro et in vivo capables de reproduire suffisamment les principales caractéristiques de l’infection et de la maladie tout en assurant une utilisation rationnelle des ressources sont essentiels pour faire progresser la recherche sur ces maladies. Un exemple est le modèle murin d’imagerie par bioluminescence in vivo (BLI) pour la maladie de Chagas, qui permet une détection très sensible de la lumière à longue longueur d’onde générée par les parasites Trypanosoma cruzi exprimant la luciférase. Bien que cette technique soit devenue l’approche standard pour les études in vivo sur l’efficacité des médicaments, les groupes de recherche peuvent encore avoir du mal à la mettre en œuvre en raison d’un manque de formation pratique appropriée sur la manipulation de l’équipement et l’application des procédures de contrôle de la qualité, même lorsque l’équipement BLI approprié est facilement disponible. Compte tenu de ce scénario, ce protocole vise à guider de la planification des expériences à l’acquisition et à l’analyse des données, avec des détails qui facilitent la mise en œuvre de protocoles dans des groupes de recherche ayant peu ou pas d’expérience avec le BLI, que ce soit pour la maladie de Chagas ou pour d’autres modèles murins de maladies infectieuses.

En utilisant un modèle murin adéquat basé sur des parasites transgéniques qui expriment constitutivement la luciférase, il est possible de reproduire les principales caractéristiques de l’infection humaine à T. cruzi causant un minimum de dommages à l’hôte, permettant un suivi en temps réel des parasites par BLI du corps entier de l’hôte de manière longitudinale (à vie), jusqu’à plusieurs mois12.
La figure 3 montre une expérience pilote démontrant l’évolution temporelle de l’infection par CL Brener Luc ::Neon du jour 1 post-infection jusqu’à 150 dpi chez des souris BALB/c. Dans les premiers 20 dpi, la charge parasitaire déduite de la bioluminescence augmente, typique du pic de parasitémie, suivie d’une forte diminution de la charge parasitaire, en raison du contrôle immunitaire des souris. Ainsi, la phase aiguë de l’infection est considérée comme les premiers 50 dpi. La phase chronique est définie lorsque l’infection atteint un taux de bioluminescence constant, de 100 à 150 dpi.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig03v2.jpg"> Figure 3 : Comprendre le modèle. Cinétique de l’infection à Trypanosoma cruzi CL Brener Luc ::Neon chez les souris BALB/c (n = 11). Panneau supérieur : images bioluminescentes ventrales et dorsales de différents points temporels pendant 150 jours post-infection (dpi) avec 1 x 10³ de trypomastigotes sanguins par injection intrapéritonéale. Échelle de la carte thermique (en Log10) du signal bioluminescent en radiance (p/s/cm2/sr). Code couleur : Violet = 5 x 103 ; rouge = 1 x 107. Panneau inférieur : quantification du signal bioluminescent en flux total (p/s) de souris corps entier. Les données sont exprimées sous forme de moyennes (lignes) et d’écarts-types (régions ombrées). Les périodes définies pour les phases aiguës et chroniques de l’infection dans ce modèle de souris sont surlignées en orange. Les valeurs moyennes de luminescence des souris non infectées (n = 3) sont indiquées par le seuil (ligne gris clair). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Les résultats thérapeutiques peuvent également être prédits puisque les principales phases de l’infection sont bien reproduites dans un modèle murin. Ainsi, la BLI est maintenant appliquée à la science translationnelle par le biais d’études de preuve de concept qui soutiennent la prise de décision sur le potentiel d’efficacité des composés et la progression dans le pipeline de développement10,27. Dans le modèle murin aigu, le traitement oral doit commencer lorsque l’infection atteint le pic de parasitémie (environ 14-21 dpi), caractérisé par un nombre élevé de trypomastigotes dans la circulation sanguine (environ 1 x 105 trypomastigotes/mL - données non présentées) et une infection systémique. Dans la phase chronique, le traitement des souris commence à 100 dpi, lorsque la charge parasitaire est comparativement beaucoup plus faible, avec une parasitémie subpatente stable.
Pour démontrer l’application du protocole décrit ci-dessus dans l’évaluation des agents antiparasitaires, nous avons comparé l’efficacité thérapeutique du benznidazole (BZ), le médicament standard utilisé pour le traitement de la maladie de Chagas, et du posaconazole (Posa), un inhibiteur de la stérol 14α-déméthylase (CYP51) qui a échoué dans les essais cliniques pour la maladie de Chagas, et qui s’est également avéré inefficace en tant qu’agent antiparasitaire contre T. cruzi in vitro et in vivo, y compris dans le modèle BLI décrit dans le présent protocole 13,18,28,29,30.
Pour le modèle de souris aiguë, des cohortes de 6 souris par groupe ont été traitées par voie orale par gavage31 pendant 20 jours avec Posa à 20 mg/kg ou BZ à 100 mg/kg, une fois par jour. Des souris ont également été traitées avec du BZ pendant 5 jours à raison de 100 mg/kg une fois par jour afin d’évaluer l’effet des traitements courts. Après l’élimination du composé (10 jours après la fin du traitement), les souris BLI négatives ont été immunosupprimées, une condition qui favorise la rechute de l’infection lorsqu’une guérison parasitologique n’est pas obtenue (Figure 4A). Le traitement Posa a entraîné une réduction de 99,49 % ± 0,27 % (moyenne ± écart-type) de la charge parasitaire déduite par bioluminescence à la fin du traitement et est restée à des niveaux similaires à ceux des souris non infectées pendant la période d’élimination du composé médicamenteux (à l’exception de la souris #3, avec un signal transitoire à 40 dpi, et de la souris #2, qui a démontré un point BLI faible à 44 dpi). Par rapport au groupe non traité, le traitement BZ pendant 20 jours a réduit de 100 % ± 0,01 % la charge parasitaire induite par la bioluminescence à la fin du traitement. En revanche, le traitement court avec BZ pendant 5 jours a entraîné une réduction de 99,98 % ± 0,03 % à 19 dpi (similaire au niveau seuil). Cependant, dans ce cas, la réduction de l’IBB était transitoire et, dans les acquisitions subséquentes, toutes les souris présentaient une réactivation de l’infection (figure 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig04v3.jpg"> Figure 4 : Conception de l’expérience de preuve de concept et résultats obtenus avec l’imagerie par bioluminescence dans un modèle aigu de la maladie de Chagas. (A) Schéma du processus chronologique dans un modèle murin de la maladie de Chagas aiguë pour les études précliniques pour l’évaluation de l’efficacité du composé. Points noirs : images de points temporels. Fiole de médecine et barre orange : début et fin du traitement, respectivement. Icône de la seringue : injections de cyclophosphamide. DPP : jour post-infection. Code couleur : gris = infection non traitée ; orange = période de traitement ; bleu = phase d’élimination du composé ; jaune = période d’immunosuppression. (B) Évolution temporelle du traitement de Trypanosoma cruzi. Panneau de gauche : images de bioluminescence ventrale de souris BALB/c (i) non traitées ou traitées pendant 20 jours avec (ii) du posaconazole (Posa) à 20 mg/kg, (iii) du benznidazole (BZ) à 100 mg/kg traités pendant 20 jours et (iv) du BZ à 100 mg/kg traités pendant 5 jours avec (n = 6/groupe). Tous les traitements ont été administrés par voie orale par gavage (10 mL/kg) une fois par jour. La carte thermique à l’échelleLog 10 indique l’intensité du signal bioluminescent de bas niveau (bleu) à élevé (rouge). Graphique de droite : quantification du corps entier des données d’imagerie de bioluminescence. Les données sont exprimées sous forme de moyennes (lignes) et d’écarts-types (régions ombrées). Légende : Fiole de médecine : début du traitement (14 dpi) ; barre orange : fin de traitement (18 dpi/33 dpi) ; injections de cyclophosphamide à l’aide d’une seringue (du 44e au 53e jour) ; point orange : souris analysée par procédure ex vivo ; § données exclues en raison d’une fuite de D-luciférine dans l’urine. (C) Procédure ex vivo pour la détection des foyers de T. cruzi dans les organes et les tissus. La clé de distribution des plaques est présentée au bas de la figure (créée avec BioRender.com : ZY26LG8AOF). Même échelle de radiance que celle montrée dans le panneau in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig04largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Dans ce modèle, le traitement antiparasitaire peut réduire la charge parasitaire en dessous de la limite de détection BLI de 1000 parasites. Ainsi, les souris apparaissent comme BLI moins10. Pour s’assurer qu’une guérison parasitologique a été obtenue, il est nécessaire de promouvoir l’immunosuppression des souris à l’aide d’un traitement au cyclophosphamide29,32. Les souris qui ont encore une charge parasitaire indétectable après un traitement médicamenteux deviendront positives au BLI après l’immunosuppression. Cet effet est montré plus largement par le traitement Posa dans le modèle aigu, qui favorise la rechute du parasite. Dans cette expérience, la procédure ex vivo a été réalisée sur des souris avec le signal bioluminescent le plus faible pour évaluer le tropisme tissulaire du parasite (Figure 4C). Les souris non traitées présentent de forts signaux bioluminescents, en particulier dans le tractus gastro-intestinal (TGI) et les tissus associés tels que la graisse viscérale et le mésentère. De plus, la peau était un site associé à la persistance du parasite. Les souris traitées avec Posa présentaient des taches bioluminescentes de plus faible intensité qui étaient plus limitées au côlon, au mésentère et à la graisse viscérale. D’autre part, chez les souris traitées avec un régime de traitement curatif, comme BZ 100 mg/kg pendant 20 jours, aucun signal bioluminescent n’est détecté même en cas d’immunosuppression. Par conséquent, considérant qu’après avoir favorisé des conditions pour que le signal bioluminescent dépasse le niveau seuil de 1000 parasites10, et augmenté la sensibilité en exposant les organes viscéraux, on considère que BZ 100 mg/kg pendant 20 jours fournit une guérison stérile. L’évaluation de la guérison stérile a été préalablement validée par différentes techniques 10,13,17,33,34.
Un plan d’étude similaire a été appliqué au modèle chronique (figure 5A), dans lequel les souris (n = 6/groupe) ont commencé à être traitées au 100e jour après l’infection. À ce stade, Posa 20 mg/kg, BZ à 100 mg/kg ou 10 mg/kg une fois par jour ont été administrés par voie orale pendant 20 jours. Après la période d’élimination du médicament, les souris BLI négatives ont été immunosupprimées. De plus, pour évaluer la guérison stérile, les souris qui étaient encore BLI-négatives à la fin de la phase d’immunosuppression ont été soumises à une analyse ex vivo .
Dans les infections chroniques, le traitement avec Posa à 20 mg/kg a entraîné une diminution de 95,03 % ± 6,18 % de la charge parasitaire déduite de la bioluminescence à la fin du traitement et est resté à des niveaux similaires chez les souris non infectées pendant la période d’élimination du médicament. Après l’immunosuppression, la majorité des souris ont montré un niveau variable de signal et de distribution BLI (Figure 5B). La procédure ex vivo a révélé qu’une souris BLI négative du corps entier traitée avec Posa avait une tache bioluminescente dans le côlon détectable par examen ex vivo (Figure 5C).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig05v3.jpg"> Figure 5 : Conception de l’expérience d’évaluation des médicaments et résultats obtenus dans le modèle chronique de l’infection à Trypanosoma cruzi par imagerie par bioluminescence. (A) Schéma de conception d’expérience d’un modèle murin de maladie de Chagas chronique. Points noirs : images de points temporels. Fiole de médecine et barre orange : début et fin du traitement, respectivement. Icône de la seringue : injections de cyclophosphamide. Dpi : jour post-infection. Code couleur : Gris = infection non traitée ; orange = période de traitement ; bleu = phase d’élimination du composé ; jaune = immunosuppression ; lilas = rechute. (B) Évaluation longitudinale de l’efficacité du traitement dans le modèle chronique de la maladie de Chagas. Panneau gauche : BLI ventral de souris BALB/c (i) non traitées ou traitées pendant 20 jours avec (ii) posaconazole (Posa) à 20 mg/kg ; (iii) benznidazole (BZ) à 100 mg/kg, et (iv) BZ à 10 mg/kg (n = 6/groupe). Tous les traitements ont été administrés par voie orale par gavage une fois par jour. Graphique de droite : somme des données brutes de flux total ventral et dorsal. Légende : fiole de médecine : début du traitement (102 dpi) ; barre orange : fin de traitement (121 dpi) ; Barre jaune et icône de seringue : injections de cyclophosphamide (du jour 131 au jour 142). Point orange : souris analysée par procédure ex vivo. ! La souris est morte pendant l’anesthésie. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66740/66740eq01.jpg" style="margin: auto;"> La souris présente des anomalies abdominales. L’échelle de la carte thermique (Log10) indique l’intensité de bioluminescence en unité de luminance de niveau faible (3 × 10,5 en bleu) à élevée (1 × 10,7 en rouge). (C) Analyse ex vivo du tropisme de T. cruzi dans les tissus. Détection par bioluminescence d’organes excisés chez des souris immunodéprimées in vivo BLI-négatives après traitement avec Posa et BZ à 100 mg/kg ou des souris avec le signal le plus faible dans les groupes non traités et BZ à 10 mg/kg. La clé de distribution des plaques est illustrée au bas de la figure (créée avec BioRender.com : ZY26LG8AOF). L’échelle de radiance est égale à celle d’un panneau in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig05largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Le traitement avec BZ à 100 mg/kg a réduit la bioluminescence à des niveaux seuils (93,87 % ± 2,14 %) à 122 dpi et au-delà jusqu’à la fin de l’expérience. Si l’on considère l’analyse ex vivo , BZ a atteint un taux de guérison de 100% (6/6 souris), car aucune souris n’a présenté un retour de signal bioluminescent même lorsque les organes immunodéprimés et internes ont été examinés. Cela signifie qu’il n’y a pas de rechute. Néanmoins, le schéma de traitement BZ avec une concentration plus faible a entraîné une légère réduction de la bioluminescence (85,95 % ± 18,43 %), mais aucun remède, car les souris ont continué à montrer des foyers de signal bioluminescents détectables à tous les points temporels ultérieurs. Ainsi, ce modèle permet une différenciation quantitative entre les traitements inefficaces (posaconazole et traitement sous-optimal au benznidazole) et les traitements efficaces (dosage optimal et durée du traitement au benznidazole).
Figure supplémentaire 1 : Analyse pré-infection de l’expression de la luciférase dans la population de T. cruzi par mesure de la fluorescence du gène rapporteur mNeonGreen. Cytométrie en flux de la protéine fluorescente mNeonGreen exprimée constitutivement par le parasite CL Brener Luc ::Neon. Histogramme normalisé du nombre de parasites (axe Y) par l’intensité de fluorescence mNeonGreen (axe X). La légende interne montre la souche et la forme analysées, la médiane de fluorescence et le pourcentage de la population de fluorescence. Les lignes de grille sont définies par la souche de type sauvage (WT) de CL Brener comme contrôle non fluorescent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Figure%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Exemple de table d’analyse dans la mesure BLI. Données brutes obtenues à partir de la quantification par imagerie par bioluminescence du 19e jour post-infection dans le modèle aigu utilisé dans les résultats représentatifs présentés à la figure 4B. Description des groupes : Témoin en tant que souris non infectées (n = 3/groupe) ; véhicule comme des souris infectées non traitées ; posaconazole (Posa) à 20 mg/kg pendant 20 jours ; benznidazole (BZ) à 100 mg/kg pendant 20 jours ; BZ à 100 mg/kg traité pendant 5 jours (n = 6/groupe). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Table1.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Le protocole fourni ici décrit en détail les étapes détaillées de la réalisation d’études d’efficacité médicamenteuse dans un modèle bioluminescent d’infection à Trypanosoma cruzi , en mettant l’accent sur l’acquisition, l’analyse et l’interprétation des données. Des procédures de dépannage et de contrôle de la qualité visant à minimiser les problèmes techniques sont également fournies.

Démystifier l’imagerie par bioluminescence in vivo d’un modèle murin de la maladie de Chagas pour des études d’efficacité de médicaments

To control and decrease the public health impact of human protozoan diseases such as Chagas disease, leishmaniasis, and human African trypanosomiasis, ...

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