Name: Une procédure rationalisée et standardisée pour générer des vecteurs viraux adéno-associés de haute qualité et à forte teneur en titres à l’aide d’une plate-forme d’usine cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Découvrez une méthode optimisée pour produire des vecteurs AAV de haute pureté à l'aide d'une plateforme d'usine cellulaire. Ce protocole améliore le rendement et la qualité pour la thérapie génique.

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TZ a conçu les expériences. TZ, VD, SB et JP ont réalisé les expériences. TZ et VD ont généré des données et les ont analysées. TZ et YX ont écrit le manuscrit. TZ et GG ont révisé le manuscrit. Ce travail a été soutenu par l’hôpital pour enfants UPMC de Pittsburgh.

Efficient Adeno-Associated Virus Vector Production Using a Cell Factory Platform

<ol><li>Arjomandnejad, M., Dasgupta, I., Flotte, T. R., Keeler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+recombinant+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+for+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer.</a> BioDrugs. 37 (3), 311-329 (2023).</li>
<li>Liu, Y., Siriwon, N., A Rohrs, J., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+targeted+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Generation of targeted adeno-associated virus (AAV) vectors for human gene therapy.</a> Curr Pharm Des. 21 (22), 3248-3256 (2015).</li>
<li>Bilal, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+large-scale+Adeno-Associated+Virus+%28AAV%29+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimization of large-scale Adeno-Associated Virus (AAV) production.</a> Curr Protoc. 3 (5), e757(2023).</li>
<li>Rashnonejad, A., Chermahini, G. A., Li, S., Ozkinay, F., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+production+of+adeno-associated+viral+vector+serotype-9+carrying+the+human+survival+motor+neuron+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large-scale production of adeno-associated viral vector serotype-9 carrying the human survival motor neuron gene.</a> Mol Biotechnol. 58, 30-36 (2016).</li>
<li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).</li>
<li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Publisher+Correction%3A+Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Publisher Correction: Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (8), 2597-2597 (2019).</li>
<li>Mueller, C., Ratner, D., Zhong, L., Esteves-Sena, M., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+discovery+of+novel+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Production and discovery of novel recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Curr Protoc Microbiol. 26 (1), 14(2012).</li>
<li>Guo, P., Wiersch, J., Xiao, X., Gittes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+purification+of+AAV+and+delivery+to+the+pancreas+by+intraductal+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Simplified purification of AAV and delivery to the pancreas by intraductal administration.</a> Methods Mol Biol. 1950, 373-387 (2019).</li>
<li>Berns, K. I., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+of+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy+for+human+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Next generation of adeno-associated virus vectors for gene therapy for human liver diseases.</a> Gastroenterol Clin North Am. 48 (2), 319-330 (2019).</li>
<li>Khasa, H., Kilby, G., Chen, X., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+band+centrifugation+for+the+separation+and+quantification+of+empty+and+full+AAV+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Analytical band centrifugation for the separation and quantification of empty and full AAV particles.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 21, 585-591 (2021).</li>
<li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+observation+of+the+recombinant+adeno-associated+virus+2+using+transmission+electron+microscopy+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Comparative observation of the recombinant adeno-associated virus 2 using transmission electron microscopy and atomic force microscopy.</a> Microsc Microanal. 13 (5), 384-389 (2007).</li>
<li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li>
<li>Kato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ-formable%2C+dynamic+crosslinked+poly+%28ethylene+glycol%29+carrier+for+localized+adeno-associated+virus+infection+and+reduced+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ-formable, dynamic crosslinked poly (ethylene glycol) carrier for localized adeno-associated virus infection and reduced off-target effects.</a> Commun Biol. 6 (1), 508(2023).</li>
<li>Sena-Esteves, M., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+fully+packaged+virions+in+column-purified+recombinant+adeno-associated+virus+%28rAAV%29+preparations+by+iodixanol+gradient+centrifugation+followed+by+anion-exchange+column+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Enrichment of fully packaged virions in column-purified recombinant adeno-associated virus (rAAV) preparations by iodixanol gradient centrifugation followed by anion-exchange column chromatography.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 095638(2020).</li>
<li>Matsumoto, M., Wangelin, J. R., Murphy, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+avian+encephalomyelitis+virus+by+ultracentrifugation+in+a+nonlinear+cesium+chloride+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Purification of avian encephalomyelitis virus by ultracentrifugation in a nonlinear cesium chloride gradient.</a> Avian Dis. 22 (3), 496-502 (1978).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Ici, un protocole techniquement avancé pour la production à grande échelle de vecteurs AAV à titre élevé et de haute qualité à l’aide d’une plate-forme d’usine cellulaire (CF10) est introduit, représentant une amélioration significative par rapport aux méthodes conventionnelles de culture cellulaire. L’utilisation d’usines cellulaires simplifie le processus de culture de grands volumes de cellules, facilitant ainsi la production plus efficace de virus AAV1. De plus, en optimisant les conditions de culture, en particulier avec du DMEM à faible teneur en glucose complété par 10 mM d’HEPES et 2% de FBS, une production virale significativement accrue a été confirmée, indiquant le rôle crucial de l’environnement cellulaire dans le rendement du virus.
Le protocole de purification révisé, qui combine l’AAV des granules de cellules et des milieux de culture, résout le problème commun des faibles rendements de virus et des impuretés observés dans de nombreux protocoles existants. Les étapes de l’extraction au chloroforme et de la répartition aqueuse en deux phases éliminent efficacement la plupart des contaminants protéiques, l’AAV restant soluble dans la phase sulfate d’ammonium. L’amélioration du rendement et de la pureté des vecteurs AAV à l’aide de la séparation diphasique PEG/aqueuse combinée à l’ultracentrifugation à gradient d’iodixanol, par opposition aux méthodes traditionnelles d’ultracentrifugation à gradient d’iodixanol, peut être attribuée à une séparation initiale améliorée avec une séparation biphasique PEG/aqueuse, à une pureté raffinée avec l’ultracentrifugation à gradient d’iodixanol et à une réduction de la co-purification des contaminants12. Tout d’abord, l’introduction d’une séparation biphasique PEG/aqueuse avant l’ultracentrifugation améliore considérablement la séparation initiale des particules d’AAV des débris cellulaires et autres contaminants. Le PEG, un polymère de haut poids moléculaire, lorsqu’il est mélangé à une solution aqueuse, crée deux phases distinctes13. Les vecteurs AAV ont tendance à se répartir préférentiellement dans l’une de ces phases (généralement la phase riche en PEG), tandis que de nombreux contaminants et impuretés sont répartis dans les13 autres. Cette répartition sélective concentre efficacement les particules d’AAV et élimine une partie substantielle des impuretés avant même l’ultracentrifugation, augmentant ainsi le rendement et réduisant la charge de contaminants entrant dans l’étape d’ultracentrifugation13. Deuxièmement, l’ultracentrifugation par gradient d’iodixanol affine davantage la pureté des vecteurs AAV. L’iodixanol, un milieu à gradient iso-osmolaire non ionique, permet une séparation plus douce et contrôlée par rapport aux gradients CsCl traditionnels14. Dans ce gradient, les particules AAV migrent vers une position dans le gradient qui correspond à leur densité flottante14. Il est important de noter que ce processus est efficace pour séparer les capsides AAV complètes (contenant la charge utile génétique) des capsides vides (manquant de matériel génétique), ce qui est un déterminant crucial de la qualité du vecteur. La nature iso-osmolaire de l’iodixanol préserve également l’intégrité des capsides AAV mieux que les agents hyperosmolaires comme le CsCl, ce qui pourrait conduire à des rendements plus élevés de vecteurs intacts et fonctionnels14. Enfin, les méthodes traditionnelles d’ultracentrifugation, en particulier celles utilisant des gradients de CsCl, peuvent parfois co-épurer des contaminants qui ont des densités de flottabilité similaires à celles des vecteurs AAV15. En utilisant le cloisonnement PEG comme étape préliminaire, la charge de ces contaminants est considérablement réduite avant l’ultracentrifugation13. Cette réduction de la charge de contaminants signifie que le gradient d’iodixanol peut fonctionner plus efficacement et de manière plus sélective dans la purification des vecteurs AAV, ce qui conduit à une pureté plus élevée15.
La pureté et la qualité des vecteurs AAV sont rigoureusement évaluées par coloration à l’argent et TEM11. L’observation de trois bandes principales correspondant aux protéines de capside AAV VP1, VP2 et VP3, avec une pureté supérieure à 90%, indique l’adéquation de ces vecteurs AAV pour une utilisation in vivo . L’analyse TEM pour déterminer le rapport capside plein/vide est particulièrement cruciale, car une proportion élevée de capsides vides peut entraîner une réduction de l’efficacité de l’administration de gènes et des réponses immunitaires potentielles11. Ce contrôle de qualité, bien qu’essentiel, ajoute à la complexité de la procédure et peut nécessiter une expertise technique supplémentaire.
En conclusion, le protocole offre des avancées techniques significatives dans la production de vecteurs AAV, notamment en termes d’évolutivité et de pureté. Cependant, les complexités associées au processus de purification et la nécessité d’un équipement et d’une expertise spécialisés peuvent encore constituer une limitation mineure de son application dans certains contextes de recherche. Le raffinement et la simplification de ces techniques pourraient rendre cette approche plus accessible et largement applicable dans le domaine de la recherche en thérapie génique.

Les vecteurs de virus adéno-associés (AAV) sont devenus un outil indispensable dans la recherche en thérapie génique, offrant une combinaison unique d’efficacité et d’innocuité pour l’administration de gènes1. Les méthodes traditionnelles de génération d’AAV en laboratoire ont joué un rôle essentiel dans l’avancement de notre compréhension et de notre application de la thérapie génique2. Cependant, ces méthodes, bien que fondamentales, présentent certaines limites et défis, notamment en termes de rendement, d’efficacité temporelle et de qualité des vecteurs produits, notamment le rapport entre les particules pleines et les particules vides3.
Le procédé conventionnel de production d’AAV implique principalement la transfection de cellules HEK2934. Ce processus, généralement mené dans des boîtes de culture cellulaire, nécessite que les cellules soient transfectées avec un plasmide contenant le gène d’intérêt ainsi qu’un plasmide auxiliaire et un plasmide de capside AAV 5,6. Après la transfection, les cellules produisent des particules d’AAV, qui sont ensuite récoltées et purifiées 5,6. Le processus de purification implique souvent l’ultracentrifugation, une étape critique dans l’obtention de vecteurs AAV de haute pureté7. L’ultracentrifugation, en particulier à l’aide de chlorure de césium (CsCl) ou d’un gradient d’iodixanol, est une méthode standard pour séparer les particules d’AAV des débris cellulaires et autres impuretés8. Cette étape est cruciale pour atteindre la pureté et la concentration souhaitées des vecteurs AAV, ce qui a un impact direct sur leur efficacité dans l’administration des gènes8. Malgré son utilisation répandue, l’ultracentrifugation traditionnelle a ses inconvénients. Par exemple, le rendement des vecteurs AAV de cette méthode peut être variable et souvent faible, ce qui pose des défis importants lorsque de grandes quantités de vecteurs à titre élevé sont nécessaires, en particulier pour les études in vivo ou les grands modèles animaux9.
Un autre aspect critique de la qualité du vecteur AAV est le rapport entre les particules pleines et les particules videsde 10. Les préparations AAV contiennent souvent un mélange de ces particules ; Cependant, seules les particules complètes contiennent le matériel génétique thérapeutique. La présence d’une forte proportion de particules vides peut réduire considérablement l’efficacité de l’administration des gènes10. L’évaluation et l’optimisation du rapport entre les particules pleines et les particules vides est donc un paramètre clé dans l’évaluation de l’efficacité des vecteurs AAV. Les méthodes traditionnelles, bien qu’elles soient capables de produire des vecteurs AAV, ont souvent du mal à contrôler ce rapport de manière constante, ce qui entraîne des variations de la puissance du vecteur10.
Ici, une méthode unique est présentée, qui rationalise le processus de génération de vecteurs AAV à haut rendement et de haute pureté à l’aide d’une plate-forme d’usine cellulaire exempte d’utilisation de cultures cellulaires HEK293T à forte intensité de main-d’œuvre dans des boîtes cellulaires, intégrant une séparation biphasique polyéthylène glycol/aqueuse avec ultracentrifugation à gradient d’iodixanol. La pureté du vecteur AAV est confirmée par SDS-PAGE et coloration à l’argent, et le rapport entre les particules pleines et vides est déterminé à l’aide de la microscopie électronique à transmission (MET), ce qui répond aux normes de qualité des études in vivo 11.

<table><tbody><tr><td>293T/17 cellules</td><td>ATTC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>324506-100ml</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Seringue Henke-Ject</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-211</td><td></td></tr><tr><td>10 % pluronic F68 solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>24-040-032</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS Tampon</td><td>Biorad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-630-080</td><td></td></tr> Solution <tr><td>d’acétate d’uranyle à 2 %</td><td>Sciences de microscopie électronique</td><td>22400-2</td><td></td></tr><tr><td>4 %&ndash ; 20 % Precast Protein Gels</td><td>biorad</td><td>4561094</td><td></td></tr><tr><td>40 % PEG solution</td><td>Sigma</td><td>P1458-50ML</td><td></td></tr><tr><td>AAV6 référence capsides complètes</td><td>Charles River Laboratories</td><td>RS-AAV6-FL</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Cell Detachment Solution Fisher</td><td>Scientific</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma</td><td>E1014-25KU</td><td></td></tr><tr><td>BioLite Culture cellulaire Boîtes traitées 150 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-556-003</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtration centrifuge</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC905024</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp ; Filtres à seringue PES</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-29</td><td></td></tr><tr><td>Cassettes de dialyse, 10 K MWCO</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI66810</td><td></td></tr><tr><td>Unités de filtration jetables en PES 1 L 0,2 & micro ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB12566506</td><td></td></tr><tr><td>Unités de filtration PES jetables 1 L 0,45 & micro ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB12566507</td><td></td></tr><tr><td>Unités de filtration PES jetables 500 mL 0,2 & micro ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB12566504</td><td></td></tr><tr><td>DMEM hyperglucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-569-044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM faible glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>10567022</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S1620</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 300 Mesh, Cu</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>FCF300-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>glycérol</td><td>Sigma</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>LB gélose</td><td>Sigma</td><td>L2897-250G</td><td></td></tr><tr><td>LB bouillon</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9732-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCL2&middot ; 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M9272-100G</td><td></td></tr><tr><td>NEB cellules compétentes stables</td><td>NEB</td><td>C3040H</td><td></td></tr><tr><td>Nest Biofactory 10 chambres</td><td>MidSci</td><td>771302</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740424</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>31-985-088</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Gradient Medium</td><td>Millipore Sigma</td><td>D1556-250ml</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-CMV-GFP</td><td>Addgene</td><td>105530</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-DJ</td><td>Cell BioLab</td><td>VPK-420-DJ</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-RC6</td><td>Cell BioLab</td><td>VPK-426</td><td></td></tr><tr><td>pAdDeltaF6</td><td>Addgene</td><td>112867</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Promega</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>PEI Max</td><td>Polysciences, Inc</td><td>49553-93-7</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-163</td><td></td></tr><tr><td>Rouge phénol</td><td>Millipore Sigma</td><td>1.07242.0100</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Silver Stain Kit Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>24612</td><td></td></tr><tr><td>Tube QuickSeal</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9144589</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma</td><td>1162245000</td><td></td></tr><tr><td>désoxycholate de sodium&nbsp ;</td><td>Millipore Sigma</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>Rotor en titane à angle fixe Type 70 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>substrat de transfert Western</td><td>ThermoFisher&nbsp ;</td><td>Référence 32209</td><td></td></tr></tbody></table>

une procédure rationalisée et standardisée pour générer des vecteurs viraux adéno-associés de haute qualité et à forte teneur en titres à l’aide d’une plate-forme d’usine cellulaire

A Streamlined and Standardized Procedure for Generating High-Titer, High-Quality Adeno-Associated Virus Vectors Utilizing a Cell Factory Platform

La recherche préclinique en thérapie génique, en particulier sur des modèles de rongeurs et de grands animaux, nécessite la production de vecteurs AAV à haut rendement et pureté. Les approches traditionnelles dans les laboratoires de recherche impliquent souvent une utilisation intensive de boîtes de culture cellulaire pour cultiver HEK293T cellules, un processus qui peut être à la fois laborieux et problématique. Ici, une méthode interne unique est présentée, qui simplifie ce processus avec une plate-forme spécifique d’usine de cellules (ou d’empilements de cellules, CF10). L’intégration d’une séparation biphasique polyéthylèneglycol/aqueuse avec une ultracentrifugation à gradient d’iodixanol améliore à la fois le rendement et la pureté des vecteurs AAV générés. La pureté des vecteurs AAV est vérifiée par SDS-PAGE et coloration à l’argent, tandis que le rapport entre les particules pleines et vides est déterminé à l’aide de la microscopie électronique à transmission (MET). Cette approche offre une plate-forme d’usine cellulaire efficace pour la production de vecteurs AAV à haut rendement, associée à une méthode de purification améliorée pour répondre aux exigences de qualité des études in vivo .

Dans ce protocole détaillé étape par étape, il est démontré qu’une plateforme standardisée permet de fabriquer un virus AAV à titre élevé et de haute qualité avec le CF10 dans un laboratoire de recherche à grande échelle. Par rapport aux boîtes de culture cellulaire conventionnelles, le CF10 offre un moyen pratique de cultiver de grandes quantités de cellules et de produire le virus AAV (Figure 1). Plusieurs conditions de culture ont été testées pour déterminer si les cellules dans un environnement optimal peuvent favoriser la production virale. Un DMEM à faible teneur en glucose complété par 10 mM d’HEPES et 2% de FBS a montré la meilleure production d’AAV.
Plusieurs protocoles ont été testés pour purifier les AAV. La plupart des procédures ont de faibles rendements en virus et une impureté des capsides AAV. Ici, un protocole de purification révisé a été développé, combinant l’AAV à partir de pastilles cellulaires et de milieux de culture (Figure 2). Nous avons constaté que 80 % des AAV se trouvaient dans les cellules, et 20 % des AAV dans les milieux de culture, qui étaient sécrétés par les cellules. Les deux parties de l’AAV ont été traitées avec de la DNase pour éliminer l’ADN libre. Le désoxycholate de sodium a été utilisé pour libérer davantage d’AAV des cellules. Les AAV ont ensuite été extraits par une extraction au chloroforme suivie d’une répartition aqueuse en deux phases. Ces étapes ont permis d’éliminer la plupart des contaminants protéiques. L’AAV reste soluble dans la phase sulfate d’ammonium.
Les contaminants restants ont été éliminés par ultracentrifugation discontinue à gradient d’iodixanol (figure 3A). Le gradient a également été utile pour éliminer les capsides AAV vides, en particulier lors de la deuxième série d’ultracentrifugation du gradient d’iodixanol.
La pureté du virus AAV a été déterminée par coloration à l’argent. Lorsque trois bandes principales correspondant à la protéine de capside de l’AAV, VP1, VP2 et VP3, avec une pureté supérieure à 90 %, ont été obtenues, le virus AAV était adapté à une utilisation in vivo (figure 3B). Le rapport de la capside pleine à la capside vide de l’AAV a été consulté par TEM (figure 3C). Seule une capside complète avec un insert de transgène permettrait l’expression du transgène dans le tissu ciblé. Une partie élevée de la capside vide pourrait également induire une réponse immunitaire à la capside AAV. Ces contrôles de qualité sont nécessaires pour chaque virus AAV produit et purifié avant utilisation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig01.jpg"> Figure 1 : Illustration schématique de la production d’AAV par la méthode de triple transfection à HEK293T cellules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig02.jpg"> Figure 2 : Illustration schématique de la purification AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig03.jpg"> Figure 3 : Purification de l’AAV par ultracentrifugation du gradient d’iodixanol et vérification de la pureté du virus AAV. (A) Couches du gradient d’iodixanol et position de l’aiguille pour la récolte. (B) Gel représentatif évaluant la teneur et la pureté de la capside. M : marqueur moléculaire ; R : référence AAV6 pleine capside ; S1 : capside AAVDJ fabriquée en interne avec un cycle d’ultracentrifugation ; S2 : capside AAVDJ fabriquée en interne avec deux cycles d’ultracentrifugation ; S3 : capside AAV6 fabriqué en interne. (C) Image au microscope électronique d’AAV. Virus collecté après purification. Les capsides virales contenant un génome viral apparaissent sous la forme d’hexagones blancs homogènes, tandis que les capsides vides apparaissent sous la forme d’hexagones avec un bord blanc mais un centre sombre. Barre d’échelle : 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Calculateur de l’IPE pour les emballages AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%201%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Tableau des volumes bruts d’AAV-PEG-Sulfate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%202%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 3 : Préparation du gradient d’iodixanol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%203%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 4 : Préparation du deuxième gradient d’iodixanol rond. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%204%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 5 : Amorces de titrage AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%205%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Dossier supplémentaire 1 : Compositions des tampons utilisés pour l’étude. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Alors que le domaine de la thérapie génique continue d’évoluer, il existe un besoin croissant de méthodes innovantes capables de relever ces défis. Ici, une méthode unique est présentée, qui rationalise le processus de génération de vecteurs AAV à haut rendement et de haute pureté à l’aide d’une plate-forme d’usine de cellules, répondant aux normes de qualité des études in vivo .

Une procédure rationalisée et standardisée pour générer des vecteurs viraux adéno-associés de haute qualité et à forte teneur en titres à l’aide d’une plate-forme d’usine cellulaire

Preclinical gene therapy research, particularly in rodent and large animal models, necessitates the production of AAV vectors with high yield and purity. ...

Ce projet vise à fournir un protocole noelle pour les productions à grande échelle de vecteurs viraux adéno-associés à haute teneur et de haute pureté en utilisant une plateforme d’usine cellulaire et des conditions culturales optimisées. Le processus de purification révisé combine l’AEV des deux fractions cellulaires et l’utilisation d’une pétition en deux phases, suivie de notre artification par gradient permettant d’obtenir un rendement et une pureté supérieurs. Malgré les progrès récents, certains défis subsistent dans les laboratoires de recherche universitaires.Il s’agit notamment d’optimiser les conditions de culture évolutives, d’utiliser d’autres cellules, de réduire le pourcentage de capsides vides et d’équilibrer le rendement viral avec la pureté. Par rapport à d’autres techniques, notre protocole offre une évolutivité via des usines cellulaires, un rendement accru avec des conditions de culture optimisées et une pureté accrue des vecteurs viraux adéno-associés grâce à un processus de purification en deux étapes. Ce protocole évolutif avec une pureté virale adéno-associée supérieure a ouvert la voie à des études précliniques plus importantes dans les laboratoires de recherche universitaires.Ce qui pourrait conduire à un développement plus sûr et plus efficace de la thérapie génique en raison de l’amélioration de la qualité des vecteurs.

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Recombinant virus adéno-associés (rAAVs) vecteurs sont de plus en plus précieux...

Production et titrage des adéno-associé recombinant vecteurs viraux

Nous décrivons ici une stratégie efficace et reproductible pour produire, titre et contrôle de la qualité des lots de vecteurs de virus adeno-associé. Il permet à l’utilisateur d’obtenir une préparation de vecteur avec haut-titre (≥1 x 1013 vecteur génomes/mL) et une grande pureté, prêt à être utilisé in vitro ou in vivo .

Production, Purification et contrôle de la qualité pour les vecteurs de base de Virus Adeno-associé

Nous fournissons ici une procédure détaillée pour la production à grande échelle de vecteurs AAV de qualité recherche en utilisant des cellules HEK 293 adhérentes cultivées dans des piles de cellules et la purification par chromatographie d’affinité. Ce protocole donne systématiquement &gt;1 x 1013 génomes vectoriels/mL, fournissant des quantités vectorielles appropriées pour les études sur les grands animaux.

Production de vecteurs de virus adéno-associés dans des piles cellulaires pour des études précliniques dans de grands modèles animaux

Dans ce protocole, le vecteur AAV2 est produit en co-cultivant des cellules d’insectes Spodoptera frugiperda (Sf9) avec la protéine fluorescente verte (GFP) baculovirus (BV)-AAV2 ou un gène thérapeutique et des cellules Sf9 infectées par BV-AAV2-rep-cap en culture de suspension. Les particules d’AAV sont libérées des cellules à l’aide d’un détergent, clarifiées, purifiées par chromatographie sur colonne d’affinité et concentrées par filtration à flux tangentiel.

Développement de procédés pour la production et la purification du vecteur du virus adéno-associé (AAV)2 à l’aide d’un système de culture cellulaire baculovirus-insecte

Ici, un protocole de production d’AAV à base de cellules HEK293 en suspension est présenté, ce qui permet de réduire le temps et la main-d’œuvre nécessaires à la production de vecteurs à l’aide de composants disponibles à des fins de recherche auprès de fournisseurs commerciaux.

Production de lots de vecteurs associés à l’adénographie à haut rendement à l’aide de cellules en suspension HEK293

Nous avons développé une matrice extracellulaire et des poumons décellularisé bioréacteur roman biomimétiques qui peuvent être utilisés pour générer des tissus pulmonaires fonctionnelles. Par ensemencement des cellules dans la matrice et la culture dans le bioréacteur, nous générons des tissus qui démontre les échanges gazeux efficaces lorsqu'elles sont transplantées in vivo pour de courtes périodes de temps.

Procédure pour l&#39;ingénierie du poumon

Monocouches auto-assemblées (SAM) formé à partir de thiols à long alcane sur l'or de fournir des substrats bien définis pour la formation de motifs protéiques et de l'isolement cellulaire. D'impression par microcontact hexadecanethiol l'aide d'un polydiméthylsiloxane (PDMS) de timbre suivie par remblayage avec un glycol terminée alcane thiols monomère produit un modèle où les protéines et les cellules s'adsorbent seulement pour la région estampillé hexadecanethiol.

Créer deux dimensions Substrats motifs pour le confinement des protéines et de cellules

Test de microtension environnement contrôlé de nanocomposites polymères mécaniquement adaptatifs pour<em&gt; Ex vivo</em&gt; Caractérisation

Nous avons développé une culture de cellules automatisé et plate-forme d'interrogation pour les expériences de stimulation cellulaire micro-échelle. La plate-forme offre un contrôle simple, polyvalent et précis dans la culture et la stimulation de petites populations de cellules, et la récupération de lysats pour les analyses moléculaires. La plate-forme est bien adapté aux études qui utilisent des cellules précieux et / ou des réactifs.

Une plate-forme automatisée polyvalent pour micro-échelle expériences de stimulation cellulaire

Déformation mécanique rapide des cellules a émergé comme une méthode prometteuse, indemne de vecteurs pour la délivrance intracellulaire de macromolécules et des nanomatériaux. Ce protocole fournit des instructions détaillées sur la façon d'utiliser le système pour une large gamme d'applications.

Presser cellule comme, microfluidique Delivery Platform intracellulaire robuste

Découvrez une méthode optimisée pour produire des vecteurs AAV de haute pureté à l'aide d'une plateforme d'usine cellulaire. Ce protocole améliore le rendement et la qualité pour la thérapie génique.

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