Name: Isolement de la microglie hypothalamique à partir du cerveau d’une souris adulte fraîchement perfusée par tri cellulaire activé par magnétisme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Découvrez l'isolement de microglie hypothalamique par tri cellulaire activé par magnétisme chez la souris. Cette méthode offre un rendement élevé et une pureté optimale pour étudier les interactions microglie-neurones et l'impact de la nutrition sur le métabolisme cérébral.

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AN est soutenu par l’Institut Universitaire de France (IUF), l’Université de Bordeaux, la Fondation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC), le GLN (Groupe Lipide-Nutrition), et l’Agence Nationale de la Recherche (ANR, PRC 2023-MicroNRJ). CA a été soutenu par la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-ARF201809006962). Ce projet a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon Europe de l’Union européenne dans le cadre des réseaux doctoraux MSCA 2021, n° 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging and age-related diseases, ETERNITY.

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été menées dans le strict respect des recommandations de l’Union européenne (2013/63/UE) et ont été approuvées par le comité d’éthique local de l’Université de Bordeaux (CEEA50) et le ministère français de l’Enseignement supérieur, de la Recherche et de l’Innovation (résumé non technique du projet approuvé NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022).
Le protocole suivant est réalisé sur des souris C57BL/6 adultes âgées en moyenne de 2 à 4 mois. Cependant, elle pourrait être réalisée chez tous les âges et toutes les conditions de souris en tenant compte du fait que le paysage cellulaire immunitaire du SNC peut être altéré et que le pourcentage de macrophages et de monocytes résidents peut être augmenté (par exemple dans le vieillissement et la neurodégénérescence).
1. Préparation des solutions
REMARQUE : Les volumes et solutions suivants se rapportent strictement à l’isolement des cellules Cd11b+.
<ol><li>Déterminer le volume total de D-PBS/0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) requis en fonction du nombre d’échantillons. Préparez la solution à l’aide du D-PBS avec du calcium et du magnésium disponible dans le commerce et de la poudre de BSA (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Préparez des tubes de dissociation étiquetés (C-Tubes) et remplissez-les avec 1 900 μL de tampon Z, fourni dans la trousse de dissociation du tissu cérébral adulte (voir le tableau des matières). Décongelez les enzymes et conservez-les sur de la glace, ainsi que tous les tampons nécessaires dans les étapes suivantes.</li>
	<li>Préparez et placez le volume approprié de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (voir le tableau des matériaux) nécessaire à la perfusion (étape 2.6) sur de la glace. Calculez 10 ml pour chaque animal plus 10 % en excès.</li>
	<li>Pour l’analyse RT-qPCR, préparez un tampon qPCR par échantillon : 2,5 μL de thioglycérol + 250 μL de tampon de lyse, à l’aide d’un kit disponible dans le commerce pour purifier l’ARN (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Pour la quantification des protéines, préparer le tampon de lyse en diluant le cocktail d’inhibiteurs de la phosphatase et le cocktail d’inhibiteurs de la protéase 1:100 dans un tampon d’extraction de mammifères (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Pour la détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et le dosage de la phagocytose, préparer 1x HBSS à partir du 10x HBSS disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Ensuite, préparez le tampon FACS en ajoutant 0,2 % de BSA à 1x HBSS.</li>
</ol>2. Ablation du cerveau
<ol><li>Endormir l’animal avec une dose de 20 mg/kg de xylazine ; Ensuite, euthanasiez la souris avec une surdose de 400 mg/kg de pentobarbital et placez-la en décubitus dorsal dans un plateau de dissection. REMARQUE : D’autres combinaisons d’anesthésiques pour euthanasier l’animal peuvent également fonctionner.</li>
	<li>Remplissez une seringue de 10 ml avec 10 ml de PBS 1x glacé et fixez-la à une aiguille papillon de 21 g.</li>
	<li>Une fois la souris complètement anesthésiée (vérifier en pinçant les pattes pour s’assurer d’une absence de réponse), la respiration arrêtée, et le cœur est en fibrillation, tentez la peau avec des pinces et ouvrez la cavité thoracique avec des ciseaux, au niveau des dernières côtes et du sternum.</li>
	<li>Utilisez les ciseaux pour faire une coupe profonde le long des côtés de la cage thoracique vers le haut de la cage thoracique pour exposer le cœur.</li>
	<li>Insérez l’aiguille 21 G dans la partie distale du ventricule gauche (assurez-vous qu’environ 1/3 de l’aiguille se trouve à l’intérieur du ventricule). Faites immédiatement une incision à travers l’oreillette droite à l’aide des ciseaux.</li>
	<li>Infusez 10 ml de PBS 1x glacé pour nettoyer le cerveau de toutes les cellules immunitaires circulantes. REMARQUE : Vérifiez visuellement le cerveau pour vous assurer qu’il est propre et bien irrigué.</li>
	<li>Coupez la tête de la souris, extrayez soigneusement le cerveau et placez-la sur une boîte de Pétri remplie de glace et recouverte de papier d’aluminium. REMARQUE : La boîte de Pétri et la feuille aident à voir les morceaux de cerveau. Il est bénéfique de maintenir un environnement frais pendant le hachage des morceaux de cerveau pour limiter les activités métaboliques.</li>
	<li>Isolez l’hypothalamus à l’aide d’une pince et coupez-le en petits morceaux avec des lames de rasoir.<ol><li>Pour identifier et disséquer l’hypothalamus, placez le cerveau à l’envers de sorte que le cortex soit ventral et que l’hypothalamus soit visible dorsalement sur la surface supérieure. Séparez l’hypothalamus, qui est situé au bas du cerveau des deux côtés du troisième ventricule, à l’aide d’une pince incurvée. Le poids moyen de l’hypothalamus des souris C57BL/6 adultes est de 15 mg. REMARQUE : Les morceaux de cerveau doivent être aussi petits que possible (<0,5 mm). La découpe en petits morceaux est une étape critique puisqu’elle permet une meilleure dissociation et un rendement cellulaire plus élevé.</li>
	</ol></li>
	<li>Recueillir les morceaux de l’hypothalamus dans des tubes de dissociation (tubes C) préalablement remplis de 1 900 μL de tampon Z (étape 1.2). REMARQUE : Pour avoir un bon rendement de cellules microgliales suffisant pour effectuer des tests, regroupez un minimum de deux (pour la quantification des protéines) ou trois (pour la qPCR et le RNAseq) hypothalami par tube.</li>
</ol>3. Dissociation tissulaire
REMARQUE : Toutes les étapes doivent être effectuées sur de la glace. Ne vortex pas la suspension cellulaire dans aucune étape ; Mélangez uniquement soigneusement avec une pipette de 1 000 μL.
<ol><li>Préparez le mélange d’enzymes 2 selon le tableau 1 (en calculant le volume total de tous les tubes + 10% en excès). Dans chaque tube C, ajoutez 50 μL de l’enzyme contenue dans le mélange 1 (voir tableau 1) et 30 μL du mélange d’enzymes 2. Toutes les enzymes sont fournies dans le kit de dissociation des tissus cérébraux adultes (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Fermez les tubes C et placez-les à l’envers dans le dissociateur avec les supports chauffants selon les instructions du fabricant. Exécutez le programme 37C_ABDK_02.</li>
	<li>Préparez des tubes à ressort de 15 ml (voir le tableau des matériaux) avec des crépines de 70 μm dessus. Mouillez la passoire avec 2 mL de D-PBS.</li>
	<li>Lorsque le programme de dissociation/digestion est terminé, videz le tube C sur la crépine et grattez avec un embout de 200 μL pour réduire la perte de cellules en augmentant la filtration des cellules et en réduisant l’adhérence de l’homogénat de tissu sur le filtre.</li>
	<li>Lavez le tube avec 2 x 5 mL de D-PBS, videz les lavages sur la passoire et grattez avec une pointe de 200 μL entre les lavages.</li>
	<li>Centrifuger à 300 × g pendant 10 min à 4 °C et aspirer complètement le surnageant. Remettez soigneusement la pastille cellulaire en suspension avec le volume approprié de D-PBS froid conformément au tableau 1.</li>
	<li>Mélanger immédiatement avec précaution 450 μL de réactif à gradient de densité (solution d’élimination des débris, voir le tableau des matériaux) et recouvrir très doucement de 2 mL de D-PBS froid (voir le tableau 1). REMARQUE : Pour obtenir les différentes couches de gradient de densité, le D-PBS doit être superposé doucement goutte à goutte, avec le moins de « perturbation » possible, 1 mL à la fois avec une pipette de 1 mL.</li>
	<li>Centrifugeuse à 3 000 × g pendant 10 min à 4 °C avec accélération lente et freinage lent (si 9 équivaut à plein, utilisez 5).</li>
	<li>Trois phases se forment. Aspirez complètement les deux phases supérieures et jetez-les. Assurez-vous de ne pas aspirer la troisième phase inférieure.</li>
	<li>Remplissez avec 1800 μL de D-PBS froid et retournez doucement le tube 3 fois.</li>
	<li>Centrifuger à 1 000 × g pendant 10 min à 4 °C avec une accélération maximale et un freinage complet et aspirer complètement le surnageant. Remettez soigneusement la pastille en suspension en le pipetant lentement de haut en bas avec 2 mL de D-PBS/BSA.</li>
</ol>4. Isolement magnétique des cellules CD11b+
<ol><li>Centrifuger à 300 × g pendant 10 min à 4 °C et aspirer complètement le surnageant. Remettez soigneusement la pastille cellulaire en suspension dans 90 μL de tampon D-PBS/BSA.</li>
	<li>Ajouter 10 μL du mélange CD11b-microbilles et bien mélanger avec la pipette.</li>
	<li>Incuber pendant 15 min à 2-8 °C au réfrigérateur, pas sur de la glace ; laver les cellules en ajoutant 1 mL de D-PBS/BSA et centrifuger à 300 × g pendant 10 min à 4 °C ; aspirer complètement le surnageant. Remettre en suspension avec précaution dans 500 μL de D-PBS/BSA.</li>
	<li>Lancez le programme POSSEL2 sur le séparateur en suivant les instructions à l’écran. Placez les petites colonnes (voir le tableau des matériaux) dans le champ magnétique. REMARQUE : Des colonnes petites ou grandes peuvent être choisies pour le tri des cellules magnétiques, en fonction du nombre moyen de cellules attendues. Les petites colonnes ont une capacité allant jusqu’à 1 × 107 cellules étiquetées et les grandes colonnes jusqu’à 1 × 108. Lors de l’isolement de cellules de petites structures, telles que l’hypothalamus, de petites colonnes sont conseillées. Les volumes de réactifs sont différents lors de l’utilisation de grandes colonnes (voir les instructions du fabricant).</li>
	<li>Mouillez les colonnes (voir le tableau des matériaux) avec 500 μL de D-PBS/BSA. Si la fraction négative des cellules (CD11b-) est nécessaire pour une analyse plus approfondie, placez une plaque collectrice sous les colonnes, puis appliquez une suspension cellulaire dans les colonnes.</li>
	<li>Effectuez trois étapes de lavage en ajoutant 500 μL de D-PBS/BSA à la fois dans la colonne, en attendant à chaque fois que la mémoire tampon passe à travers la colonne. REMARQUE : il est important d’éviter que la partie supérieure de la colonne ne se dessèche, il est donc conseillé de ne pas attendre que tout le tampon soit passé.</li>
	<li>Transvaser la totalité de l’effluent de la fraction CD11b des puits de la plaque collectrice dans des tubes de 15 millilitres.</li>
	<li>Retirez la colonne du séparateur, placez-la sur un tube de 5 ml et pipetez 1 ml de D-PBS/BSA dans la colonne.</li>
	<li>Rincez immédiatement la fraction cellulaire marquée magnétiquement en appliquant fermement le piston fourni avec la colonne.</li>
	<li>Éventuellement, comptez les cellules CD11b+ à l’aide d’un hémacytomètre ou de toute autre méthode ; attendez-vous à ~15 000 cellules par hypothalamus.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 300 ×g pendant 10 min à 4 °C et jeter le surnageant.</li>
</ol>5. Analyses
<ol><li>Pour l’analyse RT-qPCR, remettre en suspension les pastilles cellulaires avec un tampon qPCR (pour la préparation, voir l’étape 1.3) et stocker les tubes à - 80 °C jusqu’à l’extraction de l’ARNm. Isolez l’ARN total, puis traitez-le et analysez-le conformément aux directives MIQE14. Enfin, synthétisez l’ADNc et effectuez une qPCR à l’aide d’un appareil RT-PCR. Voir le tableau des matériaux pour tous les kits disponibles dans le commerce utilisés.</li>
	<li>Pour la quantification des protéines, lavez les pastilles cellulaires avec du D-PBS (sans BSA) au moins 2 fois pour éliminer les BSA. Ensuite, remettre en suspension les pastilles cellulaires de deux hypothalamus avec 20 μL de tampon de lyse. Procédez à la quantification des protéines à l’aide d’un kit de dosage des protéines (voir le tableau des matériaux). REMARQUE : Nous avons suivi les instructions du fabricant15 pour quantifier les protéines afin d’effectuer le test d’activité des kinases sérine/thréonine.</li>
	<li>Pour la détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules microgliales, remettre la pastille en suspension dans 1x HBSS. Traitez les cellules en suivant le protocole du fabricant du kit pour le test de cytométrie en flux (voir le tableau des matériaux). Ensuite, remettez en suspension les cellules traitées dans 200 μL de tampon FACS (pour la préparation, voir l’étape 1.5) et effectuez un FACS pour détecter les cellules en stress oxydatif.</li>
	<li>Pour le dosage de la phagocytose, incuber les cellules triées dans du D-PBS/BSA avec des billes de latex fluorescentes (voir le tableau des matériaux) pendant 30 min. Adaptez le nombre de billes pour avoir 4 billes par cellule en moyenne. Centrifuger ensuite à 300 × g pendant 7 min à 4 °C, remettre en suspension dans 200 μL de tampon FACS, et lire l’émission de fluorescence par FACS (λex 575 nm ; λem 610 nm).</li>
</ol>

Isolement de la microglie hypothalamique chez la souris à l’aide de MACS pour des essais in vitro

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Le protocole actuel présente l’isolement de la microglie hypothalamique à partir du cerveau de souris adulte fraîchement perfusé par tri cellulaire activé magnétiquement. Les résultats présentés ci-dessus confirment la pureté et la viabilité des cellules isolées, ainsi que l’efficacité de cette méthode pour caractériser fonctionnellement la microglie ex vivo, par exemple par l’activité phagocytaire et la quantification de la production de ROS. Les méthodes classiques d’isolement d’une population cellulaire spécifique pourraient également être utilisées pour les cellules microgliales. Le fractionnement par gradient de densité est une méthode bien connue pour la séparation de différentes cellules et de leurs particules en fonction de leur taille et/ou de leur densité. Cette technique pourrait être appliquée pour l’isolement et la culture de microglie primaire. Cependant, la purification de la microglie adulte nécessite un tri supplémentaire des cellules cérébrales isolées à l’aide d’un tri cellulaire activé par fluorescence ou immunomagnétique.
Plus précisément, le FACS s’appuie sur des anticorps biochimiques marqués par fluorescence pour marquer les cellules et les distinguer en fonction d’un grand nombre de variables qui vont au-delà des marqueurs de surface, tels que leur taille et leur état métabolique. Néanmoins, le processus de purification cellulaire pourrait être plus lent et moins doux, augmentant le nombre de cellules mortes, tout en nécessitant un rendement initial substantiel. Par conséquent, le petit nombre de microglies hypothalamiques est déjà un facteur limitant. MACS utilise des billes magnétiques conjuguées à certains anticorps contre des épitopes cellulaires spécifiques et pourrait fonctionner avec un rendement initial modeste, facilitant les études spécifiques à une région sur la dynamique microgliale. En raison du fort champ magnétique des microbilles, un étiquetage minimal est requis ; par conséquent, il est plus doux que le FACS, assurant le maintien de l’intégrité des cellules. De plus, MACS est plus rapide que FACS lorsque la manipulation simultanée de nombreux échantillons est nécessaire. Cela présente l’avantage distinct de maintenir une viabilité cellulaire élevée qui pourrait également provenir d’un faible rendement initial (tableau 3).
Les principaux défis de l’isolement de la microglie de l’hypothalamus, qui peuvent être résolus efficacement par la technologie MACS, comprennent l’obtention d’un rendement final suffisant et la préservation de l’intégrité cellulaire. La quantité de cellules requise dépend de la nature de l’analyse post-isolement choisie. Par exemple, l’étude du rôle fonctionnel de la microglie in vitro nécessite un nombre important de cellules. Cela souligne l’importance d’un pool initial de la même région cérébrale à partir de souris distinctes avec des conditions identiques avant de procéder au processus d’isolement. À l’inverse, des techniques telles que le séquençage de cellules uniques de haute précision ne nécessitent pas une grande population cellulaire et, à son tour, il n’est pas nécessaire de regrouper plusieurs souris.
Pour maximiser le rendement cellulaire, il est crucial de respecter des étapes spécifiques du protocole. Une dissociation efficace est initiée en coupant l’hypothalamus en petits morceaux, puis en s’assurant qu’ils sont maintenus dans le tampon au fond du tube pendant le processus. Ensuite, une combinaison de dissociation mécanique et de dégradation enzymatique de la matrice extracellulaire assure un rendement cellulaire significativement élevé. Cependant, il faut être extrêmement prudent dans l’interprétation des résultats puisque la dissociation enzymatique effectuée à 37 °C pourrait induire des changements transcriptionnels et traductionnels19. Pour prévenir les altérations techniques, les témoins appropriés avec des inhibiteurs transcriptionnels et translationnels pourraient être utilisés19. Il est également possible de procéder à la dissociation enzymatique à une température plus basse, comme dans une chambre froide (l’efficacité peut être réduite), bien que la dissociation puisse reposer davantage sur l’effet mécanique que sur l’effet enzymatique. Après dissociation, la suspension cellulaire est prélavée et transférée dans les crépines, et deux autres lavages approfondis des tubes sont effectués pour éviter la perte de cellules. Une autre étape critique est l’élimination des débris et de la myéline obtenue par la centrifugation à gradient de densité et la formation de différentes couches. Par conséquent, l’obtention d’un rendement final considérable nécessite une manipulation méticuleuse du tissu hypothalamique et de la suspension cellulaire, en les maintenant toujours sur la glace pour ralentir le métabolisme et maintenir leur phénotype in vivo .
De plus, il y a certains points sur lesquels nous devons être extrêmement prudents pour obtenir la plus grande pureté de la microglie et maintenir le phénotype des cellules microgliales. Initialement, la perfusion effectuée à 4 °C est cruciale pour l’élimination de toutes les cellules CD11b+ circulantes, assurant la plus grande pureté potentielle de la microglie. Cependant, en cas de rupture de la barrière hémato-encéphalique, un pourcentage plus élevé de cellules immunitaires circulantes peut coloniser le cerveau, interférant avec l’étude de la microglie elle-même. Pour atténuer ce problème, une autre approche consiste à mettre en œuvre un cycle secondaire d’isolement magnétique à l’aide de microbilles conjuguées à l’anticorps CD45. CD45 est un marqueur de surface cellulaire présentant une expression élevée dans les macrophages20 et le flux ultérieur de ce cycle ne comprend que les cellules microgliales. Cette stratégie d’utilisation de deux tours d’isolation magnétique renforce la spécificité du processus ; Néanmoins, cela prend plus de temps, ce qui pose un risque potentiel d’interruption de l’intégrité cellulaire et/ou du phénotype de la microglie. Par conséquent, un facteur crucial pour préserver les caractéristiques fonctionnelles et l’intégrité des cellules consiste à isoler rapidement le tissu cérébral et à le maintenir sur la glace jusqu’à ce que le processus de dissociation soit initié. En résumé, cette approche analytique améliore la compréhension de la fonction et du comportement des microglies, fournissant des informations précieuses sur leurs réponses dynamiques dans l’hypothalamus.

Les microglies correspondent à 5 à 20% des cellules neurales totales et sont les seules cellules gliales qui proviennent de progéniteurs érythromyéloïdes dans le sac vitellin et commencent à coloniser le cerveau en développement vers le jour embryonnaire E9.5 1,2. Ce sont des cellules à longue durée de vie avec la capacité de s’auto-renouveler lentement, indépendamment des cellules dérivées de la moelle osseuse3. En tant que cellules parmi les plus dynamiques, elles sont capables d’acquérir divers phénotypes en réponse à des signaux contextuels et environnementaux 2,4. Parmi les signaux capables de moduler leur activité, les lésions du système nerveux central (SNC), l’activité neuronale, ainsi que les nutriments, sont les plus puissants. De plus en plus de recherches ont démontré le rôle central de la microglie dans les blessures, les maladies neurodégénératives et l’obésité2,5,6. Néanmoins, le rôle précis de la microglie dans les processus physiologiques et la physiopathologie nécessite des études plus approfondies. Par conséquent, leur caractérisation transcriptionnelle, métabolique et fonctionnelle dans différentes conditions est d’une grande importance et nécessite leur isolement, car les études in situ sont appropriées pour la localisation de l’ADN, de l’ARN et des protéines et les comparaisons qualitatives, ainsi que pour la caractérisation morphologique de la microglie.
Il existe diverses techniques décrites pour l’isolement de la microglie, parmi lesquelles la méthode du gradient de Percoll7, le tri cellulaire par cytométrie en flux (FACS)8 et le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS). Le choix de la méthode appropriée dépend des objectifs de l’étude et du niveau de pureté requis pour les applications en aval. L’isolement de la microglie pure du cerveau de la souris adulte, en particulier des petites structures cérébrales comme l’hypothalamus, est difficile en raison du nombre limité de cellules microgliales. La dissociation douce automatisée de l’hypothalamus à l’aide de la technologie Miltenyi permet de purifier un rendement microglial relativement élevé en peu de temps, avec la possibilité de procéder jusqu’à huit échantillons en même temps avec un Octo Dissociator gentleMACS.
L’homogénéisation des tissus est suivie d’une purification de la microglie à l’aide de la technologie MACS basée sur la colonne et des billes supermagnétiques de taille nanométrique CD11b+. Par conséquent, tous les échantillons sont traités exactement de la même manière, ce qui permet d’obtenir des cellules CD11b+ intactes. Il convient de noter que CD11b n’est pas exclusivement présent dans la microglie, mais qu’il est également exprimé sur d’autres cellules de la lignée myéloïde, notamment les macrophages et les monocytes9. Pour limiter cela, la perfusion cérébrale avec une solution saline glacée avant l’extraction de l’hypothalamus (voir l’étape 2.6 du protocole) assure l’élimination de la plupart des cellules myéloïdes, ne laissant qu’une fraction potentiellement faible des macrophages résidents ou de ceux qui adhèrent aux vaisseaux sanguins. Les macrophages et les monocytes résidents d’un SNC sain à l’état d’équilibre constituent un pourcentage mineur de l’ensemble des cellules immunitaires cérébrales (~10% et <2% respectivement)10,11. Par conséquent, lorsque les cellules cérébrales sont triées avec des billes CD11b+, les microglies et les macrophages peuvent être isolés, bien que la grande majorité soient des microglies.
Le rendement final des microglies et le maintien de leur viabilité nous ont permis d’effectuer des essais ex vivo, ainsi que des essais in vitro, avec l’avantage d’analyser des régions cérébrales spécifiques d’intérêt. Les dernières preuves ont montré que la population de microglies est très hétérogène, représentant l’expression génique spécifique à une région et les caractéristiques morphologiques et la fonction 2,12,13. Par conséquent, le protocole actuel vise à isoler et à analyser la microglie adulte d’une manière spécifique à la région. En effet, nous pouvons caractériser les profils génétiques, transcriptionnels et translationnels de la microglie hypothalamique adulte en utilisant des méthodes telles que la RT-qPCR et le séquençage de l’ARN, ainsi qu’en effectuant des analyses fonctionnelles in vitro.

<table><tbody><tr><td>Kit de dissociation cérébrale adulte</td><td>Miltenyi</td><td>130-107-677</td><td>Le kit contient le tampon Z, le tampon Y, les enzymes A et P, la solution d’élimination des débris, le tampon A (pour dissoudre l’enzyme A).</td></tr><tr><td>Albumine Bovine FrV BSA</td><td>EuroMedex</td><td>04-100-812-C</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Microglie) Microbilles, humaines et souris - petite taille</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-636</td><td></td></tr><tr><td>CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10492</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger, couvercle Snap-Pop 15 mL</td><td>CellTreat</td><td>978449</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, calcium, magnésium, glucose, pyruvate</td><td>Gibco</td><td>14287-072</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Dissociator avec radiateurs</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Halt Phosphatase Cocktail (100x)</td><td>Thermofisher</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail, sans EDTA (100x)</td><td>Thermofisher</td><td>78437</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x), calcium, magnésium, sans rouge phénol</td><td>Thermofisher</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>billes de latex, polystyrène modifié au carboxylate, rouge fluorescent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3280</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler&nbsp ; 480 SYBR Vert I Maître</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>Ce réactif a été utilisé pour effectuer la PCR.</td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (70 & micro ; m)</td><td>Miltenyi</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay</td><td>Kit Thermofisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>M-PER Tampon d’extraction de mammifères</td><td>Thermofisher</td><td>78503</td><td></td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td>Désigné comme petites colonnes dans le protocole.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Séparateur MultiMACS Cell24 Plus</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-637</td><td></td></tr><tr><td>PBSS, pH 7,4</td><td>Thermofisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>qScript XLT cDNA SuperMix Quanta</td><td>biosciences</td><td>733-1177</td><td>Le kit a été utilisé pour synthétiser l’ADNc.</td></tr><tr><td>ReliaPrep RNA Miniprep Systems</td><td>Promega</td><td>Z6011</td><td>Le kit contient du 1-thioglycérol et un tampon BL (appelé tampon de lyse dans le protocole) et il a été utilisé pour isoler l’ARN total.</td></tr><tr><td>Vacutainer safety-lok 21 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>367282</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement de la microglie hypothalamique à partir du cerveau d’une souris adulte fraîchement perfusée par tri cellulaire activé par magnétisme  

Isolation of Hypothalamic Microglia from Freshly Perfused Adult Mouse Brain by Magnetic-Activated Cell Sorting

Les microglies, en tant que macrophages résidents du cerveau, sont essentielles au maintien de l’homéostasie du cerveau. Ils façonnent les circuits neuronaux au cours du développement, surveillent leur environnement à la recherche de débris ou de cellules mortes, et réagissent aux infections et aux lésions cérébrales, parmi de nombreuses autres fonctions. Cependant, leur rôle important dans le neurodéveloppement, la plasticité synaptique et la physiopathologie n’a pas été entièrement défini, ce qui souligne la nécessité d’études plus approfondies. Pour obtenir une compréhension plus complète du rôle de la microglie dans ces processus, nous devons isoler la microglie et la caractériser génétiquement, métaboliquement et fonctionnellement. Cependant, l’isolement des microglies chez les souris adultes, en particulier dans les petites structures cérébrales, est difficile car elles représentent un petit pourcentage de l’ensemble des cellules cérébrales et le rendement des microglies isolées est souvent trop faible. Ici, l’isolement magnétique de la microglie à l’aide de microbilles CD11b+ nous permet de trier les cellules microgliales de l’hypothalamus d’un cerveau de souris adulte fraîchement perfusé. La méthode actuelle nous permet d’obtenir une pureté et un rendement relativement élevés dans un court laps de temps tout en maintenant la viabilité cellulaire.

L’évaluation du rendement final repose sur le niveau de pureté et la quantité de cellules isolées et pourrait être déterminée par RT-qPCR, comptage cellulaire et quantification des protéines. La pureté des cellules magnétiques isolées de l’hypothalamus a été confirmée par l’analyse de l’expression génique de CD11b, C1qa, Gad1 et GFAP avec RT-qPCR (Figure 1). CD11b et C1qa sont principalement exprimés par la microglie à l’état d’équilibre, le SNC16 et Gad1 et GFAP servent respectivement de marqueur neuronal et astrocytaire. L’ADNc total d’un hypothalamus variait de 55 à 98 ng. Il convient de noter que seule la fraction positive présentait une expression de CD11b et C1qa, indiquant l’absence de toute perte potentielle de cellules microgliales dans la fraction négative. Les amorces sont fournies dans le tableau 2.
De plus, les niveaux mineurs des marqueurs neuronaux et astrocytaires garantissent que la grande majorité des cellules isolées sont des microglies, car les macrophages et les monocytes résidents ne constituent que 10 % du paysage cellulaire immunitaire total d’un cerveau sain10,11. Ces résultats prouvent l’efficacité de la sélection magnétique et ouvrent la voie à l’application de la RT-qPCR pour évaluer les niveaux d’expression de tous les gènes d’intérêt dans les cellules microgliales hypothalamiques fraîchement triées. De même, une analyse RNAseq peut être effectuée sur des microglies triées par hypothalamose pour avoir une vue complète de leur transcriptome.
La quantité de cellules isolées a été déterminée par comptage cellulaire et s’est avérée être de ~15 000 cellules par hypothalamus (mentionné à l’étape 4.10 du protocole). De plus, la concentration en protéines dans les microglies triées a été quantifiée, révélant une concentration moyenne de 0,5 μg/μL dans les cellules CD11b+ isolées de deux hypothalamis regroupés (figure 2). Cette connaissance permet de réaliser différents dosages en fonction d’un seuil protéique minimum. De plus, en regroupant davantage d’hypothalamies, une concentration plus élevée peut être obtenue, ce qui élargit la portée des analyses potentielles. Les protéines extraites de la microglie hypothalamique facilitent diverses techniques, notamment les immunodosages AlphaLISA et les dosages d’activité kinase.
De plus, le protocole décrit permet aux chercheurs d’effectuer plusieurs analyses ex vivo , permettant d’explorer l’activité microgliale et leur rôle dans l’hypothalamus dans des contextes physiologiques et pathologiques. La quantification de la production de ROS représente un aspect crucial de la réponse immunitaire microgliale17. Par conséquent, après la séparation, la microglie peut être traitée avec des réactifs disponibles dans le commerce qui permettent la détection des ROS dans les cellules vivantes en présentant un signal fluorescent accru lors de l’oxydation. Une microglie isolée magnétiquement à partir de trois hypothalamus regroupés est suffisante pour détecter les ROS par FACS, comme le montre la figure 3A, bien que nos résultats montrent une variabilité assez élevée de la production cellulaire de ROS parmi les conditions que nous avons analysées. Il convient de noter qu’avec le kit commercial mentionné ci-dessus (voir le tableau des matériaux), nous avons également pu évaluer la viabilité de cellules Cd11b+ triées, grâce à une coloration de cellules mortes imperméable aux cellules qui présente une augmentation de la fluorescence lors de la liaison de l’ADN. Plus précisément, nos données montrent que 99 % des cellules sont vivantes (Figure 3B). Des stratégies de déclenchement ont été utilisées pour distinguer les cellules vivantes et mortes, ainsi que les cellules stressées par oxydation et les cellules non stressées, en fonction de leurs propriétés de fluorescence.
Une autre caractéristique principale de l’activité microgliale est la phagocytose, un processus dynamique et étroitement régulé qui joue un rôle clé dans la surveillance immunitaire, la réparation des tissus et l’homéostasie globale du système nerveux central18. Remarquablement, les cellules Cd11b+ triées avec des billes couplées magnétiques peuvent être cultivées pendant 24 h, puis incubées avec des microbilles de latex fluorescentes à différents points temporels pour évaluer, soit par FACS, soit par microscopie à fluorescence, les altérations de l’activité phagocytaire dans différentes conditions. Les microglies fraîchement triées peuvent également être exposées à des billes fluorescentes ou à tout type de particules couplées à pHrodo (par exemple, des synaptosomes) directement dans le tube, et la phagocytose peut être évaluée par analyse FACS.
Plus précisément, nous avons incubé directement dans le tube contenant une suspension cellulaire triée, une microglie isolée de deux hypothalamis mélangés ou d’un cerveau entier avec des billes de latex fluorescentes. Les microglies qui phagocytent au moins une bille fluorescente peuvent être distinguées des cellules non phagocytaires par cytométrie en flux, car la microglie phagocytaire présente une fluorescence accrue. Des témoins négatifs, non incubés avec des billes, ont été utilisés pour le gating. Dans nos deux conditions expérimentales (souris nourries avec de la nourriture vs régime riche en graisses (HFD)), nous avons observé un très faible pourcentage de microglie phagocytaire (Figure 4A). Cependant, ce résultat est montré ici pour démontrer l’efficacité de cette méthode, qui, remarquablement, permet également de différencier les cellules qui ont phagocyté 1 bille, 2 billes, 3 billes, et ainsi de suite (Figure 4B). Enfin, toutes les approches omiques pourraient être appliquées à la microglie hypothalamique isolée. Nous suggérons de regrouper trois hypothalamus afin d’avoir suffisamment de cellules pour effectuer ces tests.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66769/66769fig01.jpg"> Figure 1 : Évaluation de la pureté des cellules CD11b+ par RT-qPCR. Quantification dans des cellules triées de l’expression de l’ARNm de l’intégrine CD11b, de la sous-unité A C1q du sous-composant C1q du complément, de la décarboxylase de l’acide glutamique Gad1 et de la protéine acide fibrillaire gliale GFAP normalisée sur les niveaux d’ARNm des gènes d’entretien Eef1a1 et Sdha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66769/66769fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66769/66769fig02.jpg"> Figure 2 : Quantification des protéines à partir de cellules hypothalamiques après tri cellulaire. Quantification de la concentration en protéines dans les cellules CD11b+ et CD11b-. Les cellules CD11b+ et CD11b- ont été lysées dans 20 μL de tampon de lyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66769/66769fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66769/66769fig03.jpg"> Figure 3 : Détection de ROS dans des cellules vivantes microgliales. Quantification de (A) cellules stressées par oxydation et (B) de cellules vivantes dans une population de cellules Cd11b+ triées, avec des tracés de contour FACS relatifs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66769/66769fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66769/66769fig04.jpg"> Figure 4 : Quantification de l’activité phagocytaire microgliale. (A) Quantification des cellules phagocytaires dans les cellules Cd11b+ triées à partir de deux hypothalamus ou d’un cerveau, avec tracé des contours FACS relatifs. (B) Pourcentage de cellules phagocytaires selon le nombre de billes phagocytées avec le tracé de contour FACS relatif. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66769/66769fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Mélange d’enzymes 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Enzyme A</td>
			<td>Zone tampon Y</td>
			<td>Enzyme P</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Solution d’élimination des débris</td>
			<td>Superposition D-PBS</td>
		</tr><tr><td>Structure de 15 à 100 mg</td>
			<td>1000 μL</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Préparation du mélange de dissociation (les volumes se réfèrent à un seul échantillon) et des superpositions de gradient.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Gènes</td>
			<td colspan="3">Protéine</td>
			<td colspan="3">En avant</td>
			<td colspan="3">Inverse</td>
		</tr><tr><td>Itgam</td>
			<td colspan="3">Intégrine alpha M (CD11b)</td>
			<td colspan="3">CTCATCACTGCTGGCCTATACAA</td>
			<td colspan="3">GCAGCTTCATTCATCATGTCCTT</td>
		</tr><tr><td>Sdha</td>
			<td colspan="3">Complexe de succinate déshydrogénase Sous-unité A de la flavoprotéine</td>
			<td colspan="3">CCCTCTCATATGTGGACATCAA</td>
			<td colspan="3">CAAGGTCTTGTCGATAACAGGT</td>
		</tr><tr><td>C1QA</td>
			<td colspan="3">Composant du complément 1, sous-composant q, polypeptide alpha</td>
			<td colspan="3">CGAGGTGTGGATCGAAAAGG</td>
			<td colspan="3">GAAGATGCTGTCGGCTTCAGT</td>
		</tr><tr><td>Gad1</td>
			<td colspan="3">glutamate décarboxylase 1</td>
			<td colspan="3">GACCAATCTCTGTGACTCGCTTAG</td>
			<td colspan="3">CTGGTCAGTGTATCGGAGGTCTT</td>
		</tr><tr><td>Gfap</td>
			<td colspan="3">protéine acide fibrillaire gliale</td>
			<td colspan="3">AGGTCCGCTTCCTGGAACA</td>
			<td colspan="3">GGGCTCCTTGGCTCGAA</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Séquences d’amorces RT-qPCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tri cellulaire par cytométrie en flux (FACS)</td>
			<td>Tri cellulaire activé magnétiquement (MACS)</td>
		</tr><tr><td>Anticorps biochimiques marqués par fluorescence</td>
			<td>Billes magnétiques conjuguées à des anticorps</td>
		</tr><tr><td>Différenciation au-delà des marqueurs de surface cellulaire</td>
			<td>Différenciation uniquement en fonction des marqueurs de surface cellulaire</td>
		</tr><tr><td>Rendement initial substantiel</td>
			<td>Rendement initial modeste</td>
		</tr><tr><td>Plus lent que MACS pour la manipulation simultanée de nombreux échantillons</td>
			<td>Plus rapide que le FACS pour la manipulation simultanée de nombreux échantillons</td>
		</tr><tr><td>Moins doux que MACS</td>
			<td>Plus doux que le FACS</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 3 : Représentation des caractéristiques et des limites des FACS et MACS

Nous décrivons un protocole permettant d’isoler les cellules microgliales de l’hypothalamus de souris (ou de petites structures cérébrales équivalentes) en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS), dans un délai relativement court. La microglie hypothalamique triée par MACS peut être utilisée pour l’analyse ex vivo et peut être utilisée pour effectuer des essais in vitro .

Isolement de la microglie hypothalamique à partir du cerveau d’une souris adulte fraîchement perfusée par tri cellulaire activé par magnétisme  

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Isolement de la microglie hypothalamique à partir du cerveau d’une souris adulte fraîchement perfusée par tri cellulaire activé par magnétisme (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement de la microglie hypothalamique à partir du cerveau d’une souris adulte fraîchement perfusée par tri cellulaire activé par magnétisme

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