Préparation d’un modèle murin de pancréatite aiguë sévère par une combinaison de céruleine et d’injection intrapéritonéale de lipopolysaccharide

Le traitement de la pancréatite aiguë sévère est difficile en raison des taux de mortalité élevés à l’aide de modèles animaux, en particulier de souris avec un fond sélectionné C57BL/6J. Nous étudions les SAP en tant que pathologique pour identifier des cibles thérapeutiques et développer de nouveaux traitements, en fournissant une méthode de polysouris à l’une des recherches SAP.

Cette recherche a révélé une expression élevée des gènes HMGB1 qui endommageait la pancréatite, suggérant son association avec le calcul inflammatoire de la pancréatite aiguë sévère. Notre protocole implique la céruleine pour induire la contraction de la vésicule biliaire et perturber le jeûne chez la souris, entraînant des lésions du tissu pancréatique en bloquant la sécrétion de liquide digestif. Combiné à l’injection de LPS, nous avons induit une pancréatite sévère avec défaillance d’organe chez la souris. Cette approche est non invasive et facile à mettre en œuvre avec des cycles courts et une répétabilité élevée.

[Manifestant] Pour commencer, mesurez et enregistrez le poids de la souris expérimentale. Pour l’injection intrapéritonéale de Caerulein, saisissez et tenez la souris avec le ventre vers le haut et la tête positionnée plus bas que la queue. Tenez la seringue dans la main droite et insérez l’aiguille dans la peau sous-cutanée du côté gauche de la ligne blanche abdominale. Déplacez l’aiguille vers l’avant d’environ trois à cinq millimètres et insérez-la dans la cavité abdominale à un angle de 45 degrés. Gardez l’aiguille immobile et injectez lentement la Caerulein. Retirez l’aiguille, puis massez doucement et appuyez sur le site d’injection avec un coton-tige stérile pour diffuser complètement le médicament dans la cavité abdominale. 12 heures après l’injection, placez la souris au milieu de la grille dans la boîte expérimentale, face à l’expérimentateur. Allumez le logiciel de suivi vidéo et configurez la surveillance pour quatre champs de vision simultanés. Marquez la longueur et la largeur de l’objet expérimental qui peut se déplacer à l’intérieur de la boîte sur l’écran de surveillance en temps réel. Enregistrez l’activité de la souris pendant 15 minutes. Les changements macroscopiques mesurés dans le modèle de souris atteintes au pancréas au cours des cinq cycles ont démontré que les souris du groupe 5 des lésions pancréatiques maintenaient un faible niveau de distance de mouvement en trois minutes, tandis que le rapport d’immobilité en trois minutes augmentait à chaque cycle suivant. Le groupe 5 de lésions pancréatiques a montré la plus petite distance de mouvement totale par rapport aux autres groupes expérimentaux, et la différence était statistiquement significative. À l’exception du groupe témoin et du groupe 1 des lésions pancréatiques, tous les groupes ont montré une croissance négative de la valeur D, le groupe 5 des lésions pancréatiques montrant le plus grand changement. L’analyse du taux de survie a indiqué un taux de mortalité de 80 % dans le groupe 5 des lésions pancréatiques au cinquième jour, contrairement aux autres groupes qui n’ont montré aucune différence significative par rapport au groupe témoin. Après 36 heures d’injection intrapéritonéale de Caerulein, euthanasier et fixer la souris en position couchée sur une plaque de mousse. Faites une incision médiane abdominale et retournez le tube de l’intestin grêle vers la droite pour exposer le pancréas. Débranchez le duodénum et le canal pylorique. Localisez l’intestin grêle sous le pancréas, puis libérez entièrement le tissu pancréatique le long du canal intestinal. À l’aide d’une pince édentée, clampez la rate et tirez doucement vers le haut. Disséquez brusquement le tissu ligamentaire pancréatique postérieur jusqu’à la tête du pancréas. Débranchez ensuite les canaux biliaires et les vaisseaux sanguins. Retirez le tissu pancréatique de la cavité abdominale et séchez l’humidité de surface avec du papier absorbant. Mesurez et enregistrez le poids du tissu pancréatique. Après avoir préparé des coupes de paraffine, déparaffinez les tissus pancréatiques deux fois dans du xylène pendant cinq minutes chacune. Traitez chaque section avec 100 microlitres de protéinase K et incubez à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ajoutez la quantité requise de peroxyde d’hydrogène à 3 % dans le tissu et incubez pendant 20 minutes pour l’infiltrer complètement. Couvrez toute la surface de l’échantillon avec 50 microlitres de tampon d’équilibrage et incubez pendant 10 minutes. Ajoutez ensuite 56 microlitres de tampon d’incubation TDT à chaque échantillon de tissu et incubez pendant une heure. Lavez les sections de tissu quatre fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune avant de les incuber pendant 30 minutes dans 100 microlitres de solution réactionnelle de streptavidine-HRP. Pour la coloration DAB, ajoutez 50 microlitres de DAB à chaque section de tissu. Immergez les sections dans une solution de coloration à l’hématoxyline pendant trois à cinq minutes avant de rincer à l’eau pure. Déshydratez les échantillons avec quatre doses d’éthanol anhydre frais pendant cinq minutes chacune. Effectuez un examen histologique au microscope à lumière blanche. La coloration TUNEL sur les tissus pancréatiques de souris a révélé une augmentation de la nécrose cellulaire dans le groupe 5 des lésions pancréatiques, avec des valeurs d’échelle de gris significativement plus élevées et des taux de nécrose positifs par rapport aux autres groupes. L’immunotransfert protéique a évalué l’expression de la caspase-3, un marqueur de la nécrose cellulaire, et a montré une augmentation significative des tissus du groupe de lésions pancréatiques 5. La cytométrie en flux de suspensions de cellules acineuses pancréatiques, marquées avec un IPC d’ajustement Nexin 5, a indiqué un taux de mortalité cellulaire nettement plus élevé dans le groupe de lésions pancréatiques 5 par rapport aux autres, avec une signification statistique.