Name: Cultiver un biofilm polymicrobien pertinent pour la fibrose kystique afin de sonder les phénotypes des communautés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 53 s
Description: Apprenez à cultiver un biofilm polymicrobien de quatre espèces mimant l'environnement pulmonaire de la fibrose kystique. Cette méthode permet d'étudier les interactions microbiennes et les changements de phénotypes de Pseudomonas aeruginosa.

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<meta charset="utf8"></head><body>Interactions polymicrobiennes in vitro dans les infections pulmonaires de la fibrose kystique

<ol><li>Cogen, J. D., Nichols, D. P., Goss, C. H., Somayaji, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs%2C+drugs%2C+drugs%3A+Current+treatment+paradigms+in+cystic+fibrosis+airway+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatric+Infect+Dis+Soc%22%5BJournal%5D)">Drugs, drugs, drugs: Current treatment paradigms in cystic fibrosis airway infections.</a> J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S32-S39 (2022).</li>
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<li>Jean-Pierre, F., Vyas, A., Hampton, T. H., Henson, M. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+versus+many%3A+Polymicrobial+communities+and+the+cystic+fibrosis+airway%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">One versus many: Polymicrobial communities and the cystic fibrosis airway.</a> mBio. 12 (2), e00006-e00021 (2021).</li>
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<li>Sosinski, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+restructuring+of+microbiome+niche+space+is+associated+with+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+therapy+in+the+cystic+fibrosis+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cystic+Fibros%22%5BJournal%5D)">A restructuring of microbiome niche space is associated with elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy in the cystic fibrosis lung.</a> J Cystic Fibros. 21 (6), 996(2022).</li>
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<li>Jean-Pierre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+composition+shapes+microbial-specific+phenotypes+in+a+cystic+fibrosis+polymicrobial+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Community composition shapes microbial-specific phenotypes in a cystic fibrosis polymicrobial model system.</a> Elife. 12 (12), e81604(2023).</li>
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<li>Lipuma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sense+and+nonsense+of+antimicrobial+susceptibility+testing+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatric+Infect+Dis+Soc%22%5BJournal%5D)">The sense and nonsense of antimicrobial susceptibility testing in cystic fibrosis.</a> J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S46-S52 (2022).</li>
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<li>Waters, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconciling+antimicrobial+susceptibility+testing+and+clinical+response+in+antimicrobial+treatment+of+chronic+cystic+fibrosis+lung+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Reconciling antimicrobial susceptibility testing and clinical response in antimicrobial treatment of chronic cystic fibrosis lung infections.</a> Clin Infect Dis. 69 (10), 1812-1816 (2019).</li>
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<li>Clay, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lasR+mutant+fitness+in+microoxia+is+supported+by+an+anr-regulated+oxygen-binding+hemerythrin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lasR mutant fitness in microoxia is supported by an anr-regulated oxygen-binding hemerythrin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3167-3173 (2020).</li>
<li>Hoffman, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lasR+mutants+are+associated+with+cystic+fibrosis+lung+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lasR mutants are associated with cystic fibrosis lung disease progression.</a> J Cyst Fibros. 8 (1), 66-70 (2009).</li>
<li>Heirali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sputum+microbiota+in+adults+with+CF+associates+with+response+to+inhaled+tobramycin%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Sputum microbiota in adults with CF associates with response to inhaled tobramycin.</a> Thorax. 75 (12), 1058-1064 (2020).</li>
<li>Nelson, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+tobramycin+primarily+affects+untargeted+bacteria+in+the+cf+sputum+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Maintenance tobramycin primarily affects untargeted bacteria in the cf sputum microbiome.</a> Thorax. 75 (9), 780-790 (2020).</li>
<li>Kesthely, C. A., Rogers, R. R., El Hafi, B., Jean-Pierre, F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+and+genetic+analysis+of+a+cystic+fibrosis+airway-relevant+model+shows+asymmetric+responses+to+growth+in+a+polymicrobial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling and genetic analysis of a cystic fibrosis airway-relevant model shows asymmetric responses to growth in a polymicrobial community.</a> Microbiol Spectr. 11 (5), e0220123(2023).</li>
<li>Jean-Pierre, F., Henson, M. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+modeling+to+interrogate+microbial+disease%3A+A+tale+for+experimentalists%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Metabolic modeling to interrogate microbial disease: A tale for experimentalists.</a> Front Mol Biosci. 8, 634479(2021).</li>
<li>Hendricks, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+infection+enhances+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+growth+through+dysregulation+of+nutritional+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus infection enhances Pseudomonas aeruginosa biofilm growth through dysregulation of nutritional immunity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (6), 1642-1647 (2016).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0387928</td><td>Préparez un stock de chloroforme à 250 mg/mL directement dans le flacon. Maintenir à -20&deg ;C. Concentration finale 200 &mu ; g/mL dans 2x base ASM.</td></tr><tr><td>Acide 3-morpholinopropane-1-sulfonique (MOPS)</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>Concentration finale 200 mM dans une base ASM 2X.</td></tr><tr><td>Réplicateur à 96 broches</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-9</td><td>Des réplicateurs jetables peuvent également être utilisés. Chat #NC1567338.</td></tr><tr><td>Plaque étalon stérile à 96 puits avec couvercle</td><td>Fisher Scientific</td><td>62406-081</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0</td><td></td></tr><tr><td>AnaeroPack 2,5 L Pot rectangulaire</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-246-385</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2*2H2O&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Préparez un stock de 1 M dans l’eau et filtrez la stérilisation avec un 0,22 &mu ; Filtre M. Concentration finale 3,5 mM dans 2x base ASM.</td></tr><tr>Sang <td></td><td></td> de <td>mouton défribriné</td><td>Pour préparer les plaques de croissance pour Streptococcus et Prevotella.</td></tr><tr><td>Acide désoxyribonucléique provenant de spermatozoïdes de hareng</td><td>Sigma</td><td>D7290</td><td>Concentration finale 1,2 mg/mL dans 2x base ASM.</td></tr><tr><td>FeSO4*7H2O&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA1449830</td><td>Préparez un stock de 1 mg/mL (3,6 mM) dans de l’eau et filtrez, stérilisez avec un 0,22 &mu ; Filtre M. Conserver enveloppé dans du papier d’aluminium. Concentration finale 0,0072 mM dans 2x base ASM.</td></tr><tr><td>GasPaks</td><td>Fisher Scientific</td><td>B260678</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>Préparer comme un stock de 20 % (1,1 m) dans de l’eau et stériliser par autoclave. Concentration finale 6 mM dans 2x base ASM.</td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma</td><td>51280</td><td>Dissoudre 100 mg d’hémine dans 2 mL de 1 M de NaOH, puis augmenter le volume à 200 mL avec de l’eau. Conserver dans une bouteille ambrée ou une bouteille ordinaire enveloppée de papier d’aluminium à 4 °C.</td></tr><tr><td>K2SO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P304-500</td><td>Préparer un stock de 0,25 M dans l’eau et filtrer stériliser avec un Filtre M. Concentration finale 0,54 mM dans 2x base ASM.</td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td></td><td></td><td>Préparez une solution mère de 50 mg/mL dans de l’eau. Filtrer la stérilisation avec un 0,22 &mu ; m filtrer et stocker à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Concentration finale 30,0 mM dans 2x base ASM.</td></tr><tr><td>KNO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>P263-500</td><td>Préparez un stock de 1 M dans l’eau et filtrez-le pour le stériliser avec un 0,22 &mu ; Filtre M. Concentration finale 0,70 mM dans 2x base ASM.</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de L-cystéine</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1038922</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-lactique&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>L1750</td><td>Préparez un stock de 1 M dans l’eau et filtrez pour le stériliser avec un 0,22 & Filtre M. Ajuster le pH à 7,0. Concentration finale 18,6 mM dans 2x base ASM.</td></tr><tr><td>L-Tryptophane</td><td>Sigma</td><td>T0254</td><td>Préparez un stock de 0,1 M dans du NaOH 0,2 M et filtrez la stérilisation avec un & Filtre M. Conserver au réfrigérateur à 4 &deg ; C enveloppé dans du papier d’aluminium. Concentration finale 0,132 mM dans 2x base ASM.</td></tr><tr><td>Mannitol Salt Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11407</td><td>Préparer en suivant les recommandations du fabricant.</td></tr><tr><td>Menadione</td><td>Sigma</td><td>M5625</td><td>Préparez une solution mère de 10 mg/mL dissoute dans de l’éthanol à 96-100 %. Conserver à 4 &deg ; C enveloppé dans une feuille d’aluminium. Vortex avant utilisation.</td></tr><tr><td>MgCl2*6H2O&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA12288A9</td><td>Préparez un stock de 1 M dans l’eau et filtrez, stérilisez avec un 0,22 &mu ; Filtre M. Concentration finale 1,21 mM dans 2x base ASM.</td></tr><tr><td>Mucine de l’estomac porcin - Type II&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>M2378</td><td>Préparez un bouillon de 10 mg/mL (2x) dans de l’eau et mélangez soigneusement avant l’autoclavage. Maintenir à 4 °C.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S375-500 Préparer</td><td>un stock de 0,2 M dans l’eau et filtrer stériliser avec un Filtre M. Concentration finale 2,5 mM dans 2x base ASM.</td></tr><tr><td>N-acétylglucosaminenbsp ;</td><td>Sigma</td><td>A8625</td><td>Préparez un stock de 0,25 M dans l’eau et filtrez-le pour le stériliser avec un produit de 0,22 & Filtre M. Conserver le stock réfrigéré à 4 °C. Concentration finale 0,6 mM dans 2x base ASM.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Concentration finale 103,7 mM dans 2x base ASM.</td></tr><tr><td>NaH2PO4*H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td>Préparer un stock de 0,2 M dans l’eau et filtrer la stérilisation avec un récipient de 0,22 &mu ; Filtre M. Concentration finale 2,6 mM dans 2x base ASM.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>Préparez une solution mère de 5 M. Utiliser pour ajuster le pH de la matière première de base ASM 2x.</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td>Concentration finale 4,6 mM dans 2x base ASM.</td></tr><tr>Acide <td></td><td></td><td>oxolinique</td><td>Préparer une solution mère de NaOH à 10 mg/mL 0,5 M. Filtrer la stérilisation avec un 0,22 &mu ; m filtrer et stocker à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Polymixine B</td><td></td><td></td><td>Préparer une solution mère à 10 mg/mL dans l’eau. Filtrer la stérilisation avec un 0,22 &mu ; m filtrer et stocker à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Pseudomonas Isolation Agar Fisher</td><td>Scientific</td><td>DF0927-17-1</td><td>Préparer en suivant les recommandations du fabricant.</td></tr><tr><td>Todd Hewitt Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0492-17-6</td><td>Préparer en suivant les recommandations du fabricant.</td></tr><tr><td>Bouillon de soja tryptique</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0370-17-3</td><td>Préparer en suivant les recommandations du fabricant.</td></tr><tr><td>Vancomycine</td><td></td><td></td><td>Préparez une solution mère à 50 mg/mL dans de l’eau. Filtrer la stérilisation avec un 0,22 &mu ; m filtrer et stocker à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11929</td><td></td></tr><tr><td>Levure synthétique sans tryptophane&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>Y1876</td><td>Concentration finale 8,0 mg/mL dans 2x base ASM.</td></tr></tbody></table>

cultiver un biofilm polymicrobien pertinent pour la fibrose kystique afin de sonder les phénotypes des communautés

Growing a Cystic Fibrosis-Relevant Polymicrobial Biofilm to Probe Community Phenotypes

Comme le montre la figure 2, plusieurs phénotypes ont été rapportés, notamment (1) une réduction du nombre de cellules viables de P. aeruginosa et de S. aureus lors de la culture de communautés planctoniques mixtes par rapport à la monoculture, (2) une augmentation de la croissance polymicrobienne des cellules de S. sanguinis et, (3) une croissance des communautés mixtes de P. melaninogenica comme précédemment rapporté par Jean-Pierre et ses collègues10.
De plus, comme le montre la figure 1, le système in vitro peut également être utilisé pour tester des molécules d’intérêt (par exemple, Abx, métabolites, etc.) une fois que les communautés de biofilms ont été établies. C’est-à-dire que les microbes cultivés en coculture ont montré soit (1) une augmentation de la sensibilité (P. aeruginosa-Figure 3A), (2) une diminution de la sensibilité (S. aureus et S. sanguinis-Figure 3B,C) ou (3) aucun changement (P. melaninogenica-Figure 3D) en présence de la tobramycine, un médicament contre la mucoviscidose, par rapport à la monoculture.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66785/66785fig01v2.jpg"> 
Figure 1 : Flux de travail expérimental. La culture de biofilms monospécifiques et polymicrobiens se fait à l’aide d’une plaque de plastique à fond plat de 96 puits dans laquelle les microbes sont cultivés en ASM pendant 24 h à 37 °C dans des conditions anoxiques. Après l’étape d’incubation initiale, les cellules non attachées sont aspirées et les biofilms préformés sont soit reconstitués avec de l’ASM frais, soit traités avec des molécules d’intérêt. Cette étape peut être répétée sur de nombreuses itérations en fonction de l’hypothèse à tester. À la fin de l’expérience, les cellules sont collectées, diluées en série et plaquées sur des milieux sélectifs pour des comptages viables. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66785/66785fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66785/66785fig02.jpg"> 
Figure 2 : Détection de phénotypes spécifiques polymicrobiens à l’aide de la modélisation in vitro. Les numérations d’UFC/mL de P. aeruginosa (Pa), de S. aureus (Sa), de S. sanguinis (Strep) et de P. melaninogenica (Prev) sont indiquées en monoculture ou en communauté mixte (Mix) pour les fractions de biofilm (B) et de planctonique (P). Les données présentées indiquent la moyenne d’au moins trois répétitions techniques effectuées au moins six jours différents (n = 6) pour chaque colonne de barres. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide de l’analyse de variance à un facteur ordinaire (ANOVA) et des comparaisons multiples de Tukey post-test avec *P &lt; 0,05 ; P &lt; 0,0001, ns = non significatif. Les barres d’erreur représentent l’écart type. bd = en dessous de la détection. Limite de détection = 102 UFC/mL. La figure est modifiée de Jean-Pierre et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66785/66785fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66785/66785fig03.jpg"> 
Figure 3 : Les interactions interespèces ont un impact sur la sensibilité à Abx des agents pathogènes de la mucoviscidose. Les indices sont les numérations d’UFC/mL de (A) P. aeruginosa (Pa), (B) S. aureus (Sa), (C) S. sanguinis (Strep) et (D) de P. melaninogenica (Prev) cultivées en monoculture ou en polymicrobine (Mix) en l’absence ou en présence de tobramycine (+Tb) à une concentration de 100 μg/mL. Les données présentées indiquent la moyenne d’au moins trois répétitions techniques effectuées au moins trois jours différents (n = 3) pour chaque colonne de barres. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide de l’analyse de variance à un facteur ordinaire (ANOVA) et des comparaisons multiples de Tukey post-test avec *P &lt; 0,05 ; **P &lt; 0,01 et ****P &lt; 0,0001. ns = non significatif. Les barres d’erreur représentent l’écart type. bd = en dessous de la détection. Limite de détection = 102 UFC/mL. La figure est modifiée de Jean-Pierre et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66785/66785fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Cultiver un biofilm polymicrobien pertinent pour la fibrose kystique afin de sonder les phénotypes des communautés

Most in vitro models lack the capacity to fully probe bacterial phenotypes emerging from the complex interactions observed in real-life environments. This ...

growing-cystic-fibrosis-relevant-polymicrobial-biofilm-to-probe

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Ce flux de travail peut être utilisé pour effectuer des tests de sensibilité aux antibiotiques à l’aide d’un modèle ex vivo établi de biofilm bactérien dans les poumons des personnes atteintes de fibrose kystique. L’utilisation de ce modèle pourrait améliorer la validité clinique des essais MBEC (concentration minimale d’éradication du biofilm).

Tests d’efficacité des antibiotiques dans un modèle ex vivo de biofilms de Pseudomonas aeruginosa et de Staphylococcus aureus dans le poumon de la fibrose kystique

Cette méthodologie permet d’établir un modèle de biofilm polymicrobien dans la mucoviscidose pour les tests de sensibilité aux antimicrobiens dans les laboratoires de recherche et cliniques. Ce modèle fournit des résultats précis et fiables sur une gamme de sorties.

Développement d’un modèle de biofilm de colonie polymicrobienne pour tester les antimicrobiens dans la mucoviscidose

Cette étude décrit un cadre pour l’élaboration d’un modèle de biofilm polymicrobien agrégé et l’optimisation d’un protocole d’extraction d’ARN afin d’évaluer l’expression du gène Pseudomonas aeruginosa reflétant l’environnement pulmonaire de la fibrose kystique. Les applications comprennent l’évaluation des effets antimicrobiens et l’étude d’alternatives antibiotiques dans des conditions pertinentes pour la fibrose kystique.

Modèle de biofilm agrégé de fibrose kystique pour étudier l’expression génique liée à l’infection

Jared Leadbetter explique pourquoi la communauté microbienne de l'intestin des termites est un excellent système pour étudier les interactions complexes entre les microbes. La relation symbiotique existant entre l'insecte hôte et la lignocellulose dégradants microbes de l'intestin est expliqué, ainsi que les utilisations industrielles de ces microbes pour la biomasse végétale et de biocarburants générant dégradants.

Enquêter la communauté microbienne dans l&#39;intestin postérieur des termites - Interview

Jared Leadbetter nous emmène pour une promenade dans la nature par la diversité de la vie dans la résidence hindgut termites - un micro-environnement contenant 250 espèces différentes se trouvent nulle part ailleurs sur Terre. Jared révèle que la symbiose présenté par ce système est multi-couches et implique non seulement une relation entre les termites et de ses habitants intestin, mais implique aussi un réseau complexe de symbiose entre les microbes de l'intestin lui-même.

Couches de Symbiose - Visualisation de la communauté microbienne Termite Intestin postérieur

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Procédé pour quantifier la taille et la forme de orofaciale embryons de Xenopus laevis a été développé. Dans ce protocole, les mesures traditionnelles de taille sont combinés avec la morphométrie géométrique pour permettre des analyses plus poussées de développement oro-faciale et des anomalies.

Quantification de Orofacial phénotypes dans Xenopus

Apprenez à cultiver un biofilm polymicrobien de quatre espèces mimant l'environnement pulmonaire de la fibrose kystique. Cette méthode permet d'étudier les interactions microbiennes et les changements de phénotypes de Pseudomonas aeruginosa.

Cultiver un biofilm polymicrobien pertinent pour la fibrose kystique afin de sonder les phénotypes des communautés

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