Isolement et cryoconservation de cellules mononucléées du sang périphérique humain hautement viables à partir de sang total : un guide pour les débutants

Dans ce protocole, nous visons à fournir un tutoriel étape par étape facile à suivre sur la façon de collecter et de stocker du sang périphérique à haute viabilité et des cellules mononucléaires, ou PBMC, à partir de sang total. Les PBMC comprennent les lymphocytes, les cellules dendritiques et les monocytes. Les PBMC en vrac peuvent être traités pour isoler des types de cellules individuels et sont couramment utilisés dans une grande variété d’expériences et de tests, y compris le séquençage de l’ARN et la cytométrie en flux.

En plus des PBMC, nous montrons également comment collecter du plasma EDTA et une couche leucocytaire entière. Avant de commencer ce protocole, veuillez préparer les matériaux et les réactifs énumérés dans le tableau 2. Notez que ce protocole est conçu pour la collecte de PBMC à partir de six tubes de centrifugation à gradient de densité, chacun produisant environ 12 millions de cellules.

Adaptez-vous en conséquence. À l’aide d’une technique de phlébotomie standard, prélever du sang total dans six tubes de centrifugation à gradient de densité et un tube EDTA jusqu’à ce qu’il soit rempli. Centrifugez tous les tubes à 1800g pendant 20 minutes à température ambiante.

Si nécessaire, les tubes collectés peuvent être stockés jusqu’à quatre heures, puis traités simultanément. Reportez-vous à la vidéo supplémentaire 1 pour une démonstration du fonctionnement d’une centrifugeuse. Après centrifugation du tube contenant le milieu à gradient de densité, le plasma et les PBMC seront au-dessus du milieu à gradient de densité.

Les érythrocytes et les granulocytes vont se déposer au fond. Reportez-vous à la figure 1A pour une visualisation. Après la centrifugation, ouvrez avec précaution le tube de centrifugation à gradient de densité.

À l’aide d’une pipette de transfert, vous pourrez retirer et jeter la couche jaune translucide contenant du plasma. Ne dérangez pas la couche brumeuse de cellules directement au-dessus du milieu à gradient de densité. Optez pour le fait de laisser un excès de plasma plutôt que de jeter les PBMC.

Répétez l’opération pour tous les tubes. À l’aide d’une nouvelle pipette de transfert, pipetez doucement le volume restant contenant les cellules et le plasma résiduel dans chaque tube vers le haut et vers le bas plusieurs fois au-dessus du milieu à gradient de densité. Après la remise en suspension, pipetez le contenu du tube remis en suspension dans un tube conique de 50 ml étiqueté.

Répétez l’opération pour tous les tubes. Remplissez le tube de 50 mL jusqu’à la ligne de 50 mL avec la solution 1 en versant. Centrifugez le tube de 50 mL à 300 g pendant 10 minutes à température ambiante.

Le protocole de collecte de plasma et de buffy détaillé à la section 2 peut être complété pendant cette période. Après centrifugation, la pastille contient des PBMC et le surnageant contient des plaquettes et du plasma résiduel. Jeter autant de surnageant que possible.

Tapotez au besoin pour éliminer les gouttes résiduelles. Verser un tube de 15 mL de la solution 2 dans le tube conique de 50 mL contenant la pastille de PBMC. Retournez doucement le tube pour remettre la pastille en suspension.

Aspirer 15 mL de la solution 3 à l’aide d’une pipette de transfert. Ajouter goutte à goutte dans le tube de 50 ml. La solution 3 contient du DMSO, qui est toxique pour les cellules à température ambiante.

N’ajoutez pas la solution 3 avant qu’elle ne soit prête à être traitée immédiatement. Retournez doucement le tube trois fois pour mélanger. Remplissez chaque flacon cryogénique pré-étiqueté et pré-réfrigéré avec 1 ml de PBMC à l’aide d’une pipette multi-distribution.

Reportez-vous à la vidéo supplémentaire 2 pour une démonstration du fonctionnement d’une pipette à distributions multiples. Placez les flacons cryogéniques dans un récipient de congélation pré-réfrigéré. Ensuite, déplacez le récipient dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius.

Conservez les flacons cryogéniques à l’intérieur du récipient de congélation pendant au moins 12 heures. Ensuite, transférez-le dans une boîte de stockage étiquetée à moins 80 degrés Celsius. Vous pouvez également transférer les flacons cryogéniques congelés dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.

Après centrifugation, la couche supérieure est constituée de plasma, la couche inférieure contient des érythrocytes et l’interface sera constituée des couches leucocytaires. Voir la figure 1B pour une visualisation. À l’aide d’une pipette de transfert neuve, prélevez autant de plasma que possible sans perturber la couche de leucoty.

Ensuite, versez 0,5 mL d’aliquotes dans des flacons cryogéniques pré-étiquetés. Aspirez la couche de couche leucocytaire et transférez-la dans le flacon cryogénique étiqueté de manière appropriée. Notez que certains plasmas et érythrocytes peuvent contaminer la collection de la couche leucocytaire.

Après la collecte, conservez les flacons cryogéniques dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Vous pouvez également le stocker dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme. Avant de commencer le protocole de décongélation PBMC, veuillez préparer les matériaux et réactifs énumérés dans le tableau 3.

Ce protocole est conçu pour la décongélation d’un tube de 1,5 mL contenant environ 2 millions de cellules. Adaptez-vous en conséquence. Notez que le nombre absolu de cellules peut différer considérablement entre différents patients et différentes conditions de traitement.

Transférez les PBMC congelés de l’entreposage à l’aide de glace sèche et décongelez-les dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant environ 4 minutes. Si on le souhaite, une aliquote peut être prélevée pour le comptage des cellules et les mesures de viabilité, comme indiqué à la section 4 du protocole écrit. Après la décongélation, ajoutez 1 mL de solution 4 dans chaque flacon cryogénique.

Ensuite, versez le contenu dans un tube pré-étiqueté de 50 ml contenant 10 ml de solution 4 pour chaque tube PBMC décongelé. Tapotez pour éliminer les gouttes résiduelles. Placez la crépine cellulaire sur le tube vide de 50 ml, puis versez la suspension cellulaire à travers la crépine cellulaire.

Si nécessaire, tapotez légèrement pour briser la tension superficielle. Centrifugez chaque tube contenant les cellules filtrées à 400 g pendant 7 minutes à température ambiante. Après la centrifugation, versez le surnageant contenant du DMSO.

Tapotez au besoin pour éliminer les gouttes résiduelles. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu souhaité adapté aux besoins expérimentaux en aval, tels que des milieux de culture cellulaire ou des cocktails d’anticorps de cytométrie en flux. Poursuivez votre expérience.

Après la collecte et la cryoconservation des PBMC, la viabilité des PBMC, des monocytes et des lymphocytes décongelés à partir de 56 échantillons uniques a été évaluée par cytométrie en flux à l’aide des réactifs énumérés dans le tableau 4 en suivant les instructions du fabricant indiquées dans les figures 2A à la viabilité moyenne et à l’écart-type des PBMC, des monocytes et des lymphocytes de 94 plus ou moins 4 %, 98 plus ou moins 1,1 % et 93 plus ou moins 5,6 %, respectivement, a été réalisé, comme le montre la figure 2G. Les mesures de viabilité par exclusion du bleu trypan ont donné une viabilité moyenne de 88 plus ou moins 7,5 % et un nombre de cellules de 2,3 fois 10 puissance 6 plus ou moins 1,9 fois 10 puissance 6. L’analyse par cytométrie en flux a également montré que les monocytes vivants représentaient 17 plus ou moins 5,9 % et les lymphocytes 53 plus ou moins 13 % des PBMC totaux.

Par la suite, les monocytes ont été triés par cytométrie en flux à partir de PBMC décongelés à partir de 59 échantillons uniques et soumis à la préparation de banques et au séquençage de l’ARN, comme décrit ailleurs. Un nombre total de séquences moyen et d’écart-type de 18 plus ou moins 16,3 millions a été obtenu avec un alignement de lecture de 93 plus ou moins 6,3 % et un contenu GC de 49,6 plus ou moins 1,4, comme le montrent les figures 3A et B.A Un pourcentage de lectures de 88 plus ou moins 3,6 % a été trouvé avec un sous-ensemble de 56 échantillons uniques. Ces paramètres démontrent que des PBMC hautement viables adaptés aux applications en aval, y compris le séquençage d’ARN de haute qualité, peuvent être obtenus par des opérateurs de tout niveau de formation en laboratoire utilisant ce protocole.

Lors de l’exécution de ce protocole, il est essentiel de travailler rapidement pour éviter la mort cellulaire, en particulier après l’ajout de la solution 3, qui est toxique pour les cellules à température ambiante. De plus, les cellules doivent également être manipulées en douceur pour minimiser les dommages. Ce protocole fournit une méthode efficace et facile à suivre pour l’isolement des PBMC, du plasma EDTA et de la couche leucocytaire.

Ces cellules immunitaires peuvent être utilisées pour un large éventail d’expériences et de tests axés sur le rôle du système immunitaire dans différents contextes biologiques.