Name: Modélisation in vitro du dépôt de graisse dans la maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Découvrez comment modéliser la stéatose hépatique métabolique en utilisant des cellules HepG2 traitées à l'acide oléique. Cette méthode permet d'étudier l'accumulation lipidique et les mécanismes de la maladie.

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L’étude actuelle a été financée par « Étude sur les questions clés de l’effet curatif de Koumiss sur les maladies régionales de la médecine mongole » en 2018 Projet soutenu du programme de science et de technologie du Département de la science et de la technologie de la région autonome de Mongolie intérieure.

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et réactifs utilisés dans ce protocole.
1. Culture cellulaire
<ol><li>Cultiver des cellules HepG2 dans des flacons de culture contenant du milieu modifié Eagle de Dulbecco (DMEM) (contenant 10 % de sérum de bovin fœtal, 100 unités/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine). Maintenir les flacons de culture à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .</li>
</ol>2. Effet de l’acide oléique sur la viabilité cellulaire mesurée par le kit de comptage cellulaire-8
<ol><li>Dissoudre un volume spécifique d’OA dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) pour obtenir une concentration de 200 mM. Conservez la solution à -20 °C pour une utilisation future.</li>
	<li>Amorcez des cellules HepG2 dans une plaque de 96 puits à une densité cellulaire de 6 × 103 cellules par puits. Ajouter 100 μL de DMEM dans chaque puits. Incuber et cultiver les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant 24 h. Divisez les cellules de l’hépatite G2 en deux groupes :<ol><li>Groupe témoin : ajouter un milieu de culture cellulaire.</li>
		<li>Groupe OA : ajouter OA au milieu de culture cellulaire pour obtenir des concentrations finales de 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM et 1 mM.</li>
	</ol></li>
	<li>Après 24 h d’incubation initiale, jeter le surnageant de chaque puits et ajouter de l’OA selon le groupe spécifié, en ajoutant 100 μL par puits. Pour le groupe témoin, ajouter 100 μL de milieu de culture cellulaire dans chaque puits. Continuez à incuber les cellules pendant encore 24 heures. REMARQUE : Assurez-vous que chaque groupe dispose de six puits répliqués. Pour éviter l’évaporation, ajoutez 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans l’anneau extérieur des puits de la plaque à 96 puits.</li>
	<li>Après 24 h d’incubation, ajouter 10 μL de kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8) dans chaque puits, mélanger doucement et incuber pendant 2 h dans l’obscurité. Retirez la plaque à 96 puits de l’incubateur, placez-la dans le lecteur de microplaques et mesurez la valeur d’absorbance à 450 nm (A450). Les valeurs IG50 ont été comptées en fonction de la DO.</li>
</ol>3. Coloration au rouge O à l’huile pour observer la formation de gouttelettes lipidiques intracellulaires
<ol><li>Ensemencer les cellules HepG2 dans des plaques de culture cellulaire à 6 puits à une densité de 5 × 10 à5 cellules par puits et cultiver les plaques dans un incubateur à température constante pendant 24 h. Reportez-vous à la figure 1 pour une représentation visuelle des étapes décrites.</li>
	<li>Après 24 h de culture cellulaire, ajouter 2 mL de milieu de culture cellulaire contenant de l’OA dans chaque puits, jusqu’à ce que les concentrations finales soient de 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM et 1 mM. Après 24 heures supplémentaires, retirez le milieu de culture cellulaire de chaque puits et lavez-le deux fois avec du PBS. Ajouter 1 mL de fixateur ORO dans chaque puits et incuber pendant 30 min.</li>
	<li>Préparez la solution de coloration ORO en mélangeant la solution de coloration A avec la solution de coloration B dans un rapport de 3:2. Laissez le mélange reposer à température ambiante pendant 10 min, puis filtrez-le une fois à travers un filtre de 0,45 μm. Conservez la solution filtrée dans un tube à centrifuger à l’abri de la lumière jusqu’à l’utilisation.</li>
	<li>Jetez le fixateur et lavez-le deux fois à l’eau distillée. Ajouter 1 mL d’isopropanol à 60 % dans chaque puits et incuber pendant 30 s. Jeter 60 % de la solution d’isopropanol et ajouter 1 mL de solution de coloration ORO fraîchement préparée dans chaque puits avant l’incubation pendant 20 min. Jeter la solution de coloration ORO, ajouter 1 mL d’isopropanol à 60 % dans chaque puits et incuber pendant 30 s. Lavez 5 fois à l’eau pour enlever l’excès de colorant.</li>
	<li>Couvrez les cellules avec de l’eau distillée et observez au microscope. Une fois les images recueillies, jetez le liquide dans la plaque et laissez-le sécher. Ensuite, ajoutez 2 ml d’isopropanol dans chaque puits et secouez la plaque sur un agitateur orbital pendant 10 min. Transférez le liquide dans une nouvelle plaque de 96 puits, avec 16 puits dans chaque groupe, en ajoutant 100 μL par puits. Calculer la teneur en lipides en mesurant la densité optique (DO) de chaque puits à l’aide d’un lecteur de microplaques à 510 nm (A510).</li>
</ol>4. Effets de différentes concentrations d’acide oléique sur les triglycérides totaux dans le surnageant des cellules HepG2
<ol><li>Équilibrez le kit à température ambiante pendant 20 min et préparez les plaques requises pour l’expérience.</li>
	<li>Prélever le surnageant cellulaire et centrifuger à 1 570 × g pendant 10 min. Définir des puits standard et tester des puits d’échantillons. Ajouter 50 μL de concentration étalon (concentration [S0 → S5] suivie de : 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 mmol/L) dans les puits étalons. En plus des puits blancs et standard, ajoutez 10 μL d’échantillons différents dans les puits d’échantillons, puis ajoutez 40 μL de diluant d’échantillon dans chaque puits. Ajouter 100 μL d’anticorps de détection de raifort peroxydase dans chaque puits, sceller avec une membrane à plaque et incuber à 37 °C pendant 1 h dans un four à température constante.</li>
	<li>Jetez le surnageant, séchez-le sur du papier sans poussière et lavez-le bien avec 1 solution de lavage. Laisser reposer à température ambiante pendant 1 min. Répétez le processus de lavage 5 fois.</li>
	<li>Ajouter 50 μL de substrat A et 50 μL de substrat B dans chaque puits. Mélangez délicatement et laissez incuber pendant 15 min à 37 °C. Ajouter 50 μL de solution de terminaison dans chaque puits et mesurer la valeur de DO de chaque puits à 450 nm (A450) en 15 min.</li>
	<li>Tracez la concentration de l’étalon le long de l’axe des x et la valeur d’absorbance (OD) correspondante le long de l’axe des y pour effectuer une régression linéaire et dérivez l’équation de la courbe pour calculer la valeur de concentration de chaque échantillon.</li>
</ol>5. Analyse statistique
<ol><li>Déterminer les différences significatives dans les données quantitatives.</li>
	<li>Calculez la moyenne ± l’écart-type (ET) et représentez graphiquement les données. Considérez que P < 0,05 est statistiquement significatif.</li>
</ol>

Cellules HepG2 induites par l’acide oléique pour l’analyse de maladies métaboliques 

<ol><li>Alisi, A., Feldstein, A. E., Villani, A., Raponi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pediatric+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+a+multidisciplinary+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Pediatric nonalcoholic fatty liver disease: a multidisciplinary approach.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (3), 152-161 (2012).</li>
<li>Anania, C., Perla, F. M., Olivero, F., Pacifico, L., Chiesa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediterranean+diet+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Mediterranean diet and nonalcoholic fatty liver disease.</a> World J Gastroenterol. 24 (19), 2083-2094 (2018).</li>
<li>Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease+development+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression.</a> Cell Mol Life Sci. 76 (1), 99-128 (2019).</li>
<li>Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+dyslipidemia%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update.</a> Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).</li>
<li>European Association for the Study of the Liver (EASL); European Association for the Study of Diabetes (EASD); European Association for the Study of Obesity (EASO). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EASL-EASD-EASO+Clinical+Practice+Guidelines+for+the+Management+of+Non-Alcoholic+Fatty+Liver+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Obes+Facts%22%5BJournal%5D)">EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the Management of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease.</a> Obes Facts. 9 (2), 65-90 (2016).</li>
<li>Chalasani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+and+management+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+Practice+guidance+from+the+American+Association+for+the+Study+of+Liver+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases.</a> Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).</li>
<li>Díaz, L. A., Arab, J. P., Louvet, A., Bataller, R., Arrese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intersection+between+alcohol-related+liver+disease+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The intersection between alcohol-related liver disease and nonalcoholic fatty liver disease.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 20 (12), 764-783 (2023).</li>
<li>Cotter, T. G., Rinella, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+fatty+liver+disease+2020%3A+The+state+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic fatty liver disease 2020: The state of the disease.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1851-1864 (2020).</li>
<li>Lonardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+mechanisms+for+and+treatment+of+NAFLD+or+NASH+occurring+after+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Metabolic mechanisms for and treatment of NAFLD or NASH occurring after liver transplantation.</a> Nat Rev Endocrinol. 18 (10), 638-650 (2022).</li>
<li>Papatheodoridi, M., Cholongitas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+%28NAFLD%29%3A+Current+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): Current concepts.</a> Curr Pharm Des. 24 (38), 4574-4586 (2018).</li>
<li>Van Herck, M. A., Vonghia, L., Francque, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease-a+starter%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Animal models of nonalcoholic fatty liver disease-a starter's guide.</a> Nutrients. 9 (10), 1072(2017).</li>
<li>Wieckowska, A., Feldstein, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+invasive+versus+noninvasive%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease: invasive versus noninvasive.</a> Semin Liver Dis. 28 (4), 386-395 (2008).</li>
<li>Stein, L. L., Dong, M. H., Loomba, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+sensitizers+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease+and+steatohepatitis%3A+Current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Ther%22%5BJournal%5D)">Insulin sensitizers in nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis: Current status.</a> Adv Ther. 26 (10), 893-907 (2009).</li>
<li>Milić, S., Lulić, D., Štimac, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+obesity%3A+biochemical%2C+metabolic+and+clinical+presentations%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: biochemical, metabolic and clinical presentations.</a> World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).</li>
<li>Neuschwander-Tetri, B. A., Caldwell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+steatohepatitis%3A+summary+of+an+AASLD+Single+Topic+Conference%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference.</a> Hepatology. 37 (5), 1202-1219 (2003).</li>
<li>Du, J., Zhao, L., Kang, Q., He, Y., Bi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+Oil+Red+O+staining+with+the+salicylic+acid+ethanol+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">An optimized method for Oil Red O staining with the salicylic acid ethanol solution.</a> Adipocyte. 12 (1), 2179334(2023).</li>
<li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neutral+lipids+by+Oil+Red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging of neutral lipids by Oil Red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nat Protoc. 8 (6), 1149-1154 (2013).</li>
<li>Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+epidemic+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease+demonstrates+an+exponential+increase+in+burden+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease.</a> Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).</li>
<li>Watkins, P. A., Ellis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+acyl-CoA+synthetases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal acyl-CoA synthetases.</a> Biochim Biophys Acta. 1822 (9), 1411-1420 (2012).</li>
<li>Heeren, J., Scheja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic-associated+fatty+liver+disease+and+lipoprotein+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic-associated fatty liver disease and lipoprotein metabolism.</a> Mol Metab. 50, 101238(2021).</li>
<li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+isoquercitrin+on+free+fatty+acid-induced+lipid+accumulation+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Effect of isoquercitrin on free fatty acid-induced lipid accumulation in HepG2 cells.</a> Molecules. 28 (3), 1476(2023).</li>
<li>Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycopus+lucidus+Turcz.+ex+Benth.+attenuates+free+fatty+acid-induced+steatosis+in+HepG2+cells+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+high-fat+diet-induced+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice.</a> Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hesperetin+ameliorates+hepatic+oxidative+stress+and+inflammation+via+the+PI3K%2FAKT-Nrf2-ARE+pathway+in+oleic+acid-induced+HepG2+cells+and+a+rat+model+of+high-fat+diet-induced+NAFLD%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Funct%22%5BJournal%5D)">Hesperetin ameliorates hepatic oxidative stress and inflammation via the PI3K/AKT-Nrf2-ARE pathway in oleic acid-induced HepG2 cells and a rat model of high-fat diet-induced NAFLD.</a> Food Funct. 12 (9), 3898-3918 (2021).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protopanaxadiol+ameliorates+NAFLD+by+regulating+hepatocyte+lipid+metabolism+through+AMPK%2FSIRT1+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Protopanaxadiol ameliorates NAFLD by regulating hepatocyte lipid metabolism through AMPK/SIRT1 signaling pathway.</a> Biomed Pharmacother. 160, 114319(2023).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zeaxanthin+prevents+ferroptosis+by+promoting+mitochondrial+function+and+inhibiting+the+p53+pathway+in+free+fatty+acid-induced+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Biol+Lipids%22%5BJournal%5D)">Zeaxanthin prevents ferroptosis by promoting mitochondrial function and inhibiting the p53 pathway in free fatty acid-induced HepG2 cells.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1868 (4), 159287(2023).</li>
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<li>Park, M., Yoo, J. H., Lee, Y. S., Lee, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lonicera+caerulea+extract+attenuates+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+free+fatty+acid-induced+HepG2+hepatocytes+and+in+high+fat+diet-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Lonicera caerulea extract attenuates non-alcoholic fatty liver disease in free fatty acid-induced HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice.</a> Nutrients. 11 (3), 494(2019).</li>
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<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL-dependent+signaling+regulates+autophagic+flux+in+a+murine+model+of+non-alcohol-associated+fatty+liver+and+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">MLKL-dependent signaling regulates autophagic flux in a murine model of non-alcohol-associated fatty liver and steatohepatitis.</a> J Hepatol. 73 (3), 616-627 (2020).</li>
<li>Scavo, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oleic%2Fpalmitic+acid+imbalance+in+exosomes+isolated+from+NAFLD+patients+induces+necroptosis+of+liver+cells+via+the+elongase-6%2FRIP-1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The oleic/palmitic acid imbalance in exosomes isolated from NAFLD patients induces necroptosis of liver cells via the elongase-6/RIP-1 pathway.</a> Cell Death Dis. 14 (9), 635(2023).</li>
<li>Chavez-Tapia, N. C., Rosso, N., Tiribelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+intracellular+lipid+accumulation+in+a+new+model+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Effect of intracellular lipid accumulation in a new model of non-alcoholic fatty liver disease.</a> BMC Gastroenterol. 12, 20(2012).</li>
<li>Ricchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+lipid+accumulation+and+apoptosis+in+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes.</a> J Gastroenterol Hepatol. 24 (5), 830-840 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Le MASLD est un syndrome clinicopathologique caractérisé par un dépôt excessif de graisse intracellulaire dans les hépatocytes en raison de facteurs autres que l’alcool et d’autres agents hépatiques établis18. Le MASLD est étroitement lié au stress métabolique acquis, aux lésions hépatiques, notamment associées à la résistance à l’insuline et à la susceptibilité génétique. Pour étudier et dépister efficacement les médicaments pour la MASLD, il est crucial de sélectionner un modèle expérimental approprié. L’établissement d’un modèle cellulaire est particulièrement vital dans la recherche MASLD, car il permet une compréhension plus approfondie des mécanismes pathologiques et l’évaluation des effets de nouveaux médicaments.
Ce protocole décrit un modèle in vitro de MASLD établi à partir de cellules HepG2 induites par l’OA. La coloration ORO et l’analyse de la teneur en lipides sont des méthodes essentielles pour la création de ce modèle. De plus, l’évaluation de la viabilité cellulaire et de la teneur totale en TG dans les surnageants cellulaires est essentielle pour évaluer la concentration appropriée d’OA. Le critère diagnostique de la MASLD implique la présence de plus de 5% de TG stockés dans les cellules hépatiques19,20. Les modèles de cellules MASLD reposent principalement sur les cellules HepG221, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, connues pour leur utilisation réussie dans la construction de modèles de dégénérescence de la stéatose hépatique dans diverses études nationales et internationales. Bien qu’elles proviennent de cellules d’hépatome, les cellules HepG2 partagent de nombreuses caractéristiques phénotypiques avec les hépatocytes et sont facilement cultivées et propagées29,30. Des tests tels que le kit CCK-8, la coloration ORO, la teneur en lipides et les mesures de la TG totale offrent des approches simples, objectives et raisonnables pour évaluer la viabilité cellulaire, l’accumulation de graisse et la teneur en lipides chez les sujets de l’étude. Dans ce contexte, l’arthrose s’aligne sur la pathogenèse du MASLD31, où l’excès d’énergie est stocké sous forme de lipides lorsque l’apport énergétique dépasse la consommation.
Les chercheurs ont utilisé OA 23,28,31,32,33, acide palmitique34,35 et des combinaisons d’acide oléique/palmitique26,36 pour reproduire le modèle MASLD. L’acide palmitique et l’arthrose contribuent tous deux à la dégénérescence graisseuse du foie et à l’accumulation de TG. L’acide palmitique, l’acide gras saturé le plus abondant dans le corps humain, présente une lipotoxicité importante, entraînant une accumulation de lipides dans les hépatocytes, une augmentation des radicaux réactifs de l’oxygène intracellulaires et la mort ou la nécrose cellulaire37. À l’inverse, l’OA entraîne un dépôt intracellulaire de TG plus prononcé (Figure 6) et une modulation cellulaire moindre38. Ainsi, les chercheurs utilisent souvent des cellules HepG2 induites par l’OA pour établir des modèles MASLD in vitro. Comme décrit à l’étape de protocole 2.2.2, il est crucial de chauffer la solution OA lors de son ajout. Dans cette étude, la coloration ORO et l’analyse du contenu lipidique ont été basées sur le dépôt lipidique des cellules HepG2, soutenant efficacement l’exploration de modèles in vitro de MASLD avec des mécanismes complexes et réduisant le temps et les coûts nécessaires à la recherche.
L’ORO se lie facilement à la TG sous forme de gouttelettes, produisant des taches orange à rouge indiquant la présence de graisse, l’intensité de la couleur dépendant de la concentration en lipides. Cependant, la solution de coloration ORO est instable et sujette aux précipitations, ce qui la rend impropre à une préparation à l’avance. Par conséquent, la solution de coloration ORO a été préparée après l’étape 3.2 du protocole, avec des précautions prises pour éviter l’exposition à la lumière pendant la préparation et l’incubation (étapes 3.2, 3.3 du protocole). À l’étape 3.5 du protocole, la sélection d’images à plusieurs points temporels (3, 6, 9 et 12 heures) représente une modification clé de l’expérience qui est essentielle pour améliorer la précision des résultats. Bien que des concentrations élevées d’OA affectent la survie cellulaire, ce qui représente une limitation de cette méthode, il a été démontré qu’une concentration appropriée d’OA assure la viabilité cellulaire.
Cette étude a utilisé une approche globale, utilisant un kit CCK-8, la coloration ORO, l’analyse de la teneur en lipides et la mesure de la TG totale pour établir et valider le modèle de MASLD. Le kit CCK-8 a été utilisé pour évaluer l’effet des médicaments sur la viabilité cellulaire, ce qui a constitué une étape de validation cruciale. À l’avenir, ce modèle est prometteur pour le criblage de médicaments et la recherche sur les mécanismes visant à comprendre la pathogenèse des MASLD et à identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Afin d’assurer davantage la qualité et la fiabilité de la validation, les niveaux d’expression des protéines cibles impliquées dans le modèle seront analysés à l’aide d’analyses par transfert Western et d’analyses quantitatives de réaction en chaîne par polymérase.

La maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) englobe une gamme d’affections, notamment la stéatose simple, la stéatohépatite non alcoolique (NASH), la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire 1,2,3,4,5,6, toutes attribuées à des facteurs autres que la consommation d’alcool 7. La MASLD est la maladie hépatique la plus répandue causée par des lésions métaboliques du foie, affectant près d’un quart de la population mondiale 8,9,10,11,12. Bien que la pathogenèse précise de la MASLD n’ait pas encore été élucidée, diverses théories tentent d’expliquer son développement. Une notion dominante suggère un abandon de la théorie classique des « deux coups » vers un modèle « à coups multiples »1. Au cœur de ces hypothèses se trouve le rôle de la résistance à l’insuline, qui serait essentielle dans la pathogenèse de la MASLD13. La recherche indique que la résistance à l’insuline dans les hépatocytes entraîne une augmentation des niveaux d’acides gras libres, formant par la suite des triglycérides stockés dans le foie14,15.
Les chercheurs ont utilisé des modèles in vivo et in vitro pour simuler le dépôt de graisse dans le MASLD ; Pourtant, reproduire pleinement son mécanisme pathologique reste un défi. Malgré cette limitation, ces modèles ont joué un rôle déterminant dans l’étude de cibles thérapeutiques potentielles pour la MASLD. Cependant, le développement d’un modèle stable de MASLD est crucial. Bien que les modèles animaux soient efficaces, ils prennent du temps et coûtent cher, ce qui souligne l’intérêt croissant pour les modèles cellulaires in vitro . Ces modèles utilisent souvent un ou plusieurs acides gras libres tels que l’acide oléique (OA) et l’acide palmitique pour recréer le MASLD induit par l’alimentation. Parmi ceux-ci, la lignée cellulaire de l’hépatoblastome humain HepG2 est souvent utilisée pour établir des modèles cellulaires in vitro de MASLD.
L’induction de l’OA stimule les cellules HepG2 à répliquer le dépôt graisseux semblable à la MASLD, une méthode dont l’histoire est bien établie. Le but de cette étude était de démontrer la viabilité, la coloration au rouge d’huile (ORO), la teneur en lipides et le taux de triglycérides (TG) des cellules HepG2 traitées avec 0,25 mM d’OA. L’objectif de cette expérience était de fournir des preuves supplémentaires pour le développement d’études de modélisation MAFLD.

<table><tbody><tr><td>0,22 et micro ; m filtre</td><td>Millex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA (1x) Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>0,45 & micro ; Filtre m</td><td>Millex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL Crygenic Vials</td><td>CORNING</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 Flacon de culture cellulaire</td><td>CORNING</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire 6 puits</td><td>CORNING</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire 96 puits</td><td>CORNING</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de numération globulaire</td><td>Shanghai Jing Jing Réactif biochimique & Instrument Co.</td><td></td><td></td>02270113</tr><tr><td>Cell Counting Kit-8 tests</td><td>Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.&nbsp ;</td><td>CA1210-1000T</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur CO2</td><td>NUAIRE</td><td>NU-5710E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; DMSO Diméthylsulfoxyde</td><td>Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.&nbsp ;</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>8122691</td><td></td></tr><tr><td>Équipement de marquage enzymatique</td><td>Tecan</td><td>Spark</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, Lignée de</td> cellules <td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td> qualifiée <td>Beijing North China Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC</td> <td>221031</td><td></td></tr><tr><td>Triglycérides humains (TG) ELISA Institut</td><td>de bio-ingénierie Nanjing Jiacheng</td><td>20170301</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé pour la culture cellulaire</td><td>Leica</td><td>DMi1&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co.</td><td></td><td>Kit de</td></tr><tr><td>coloration rouge à l’huile 2021030141, pour cellules cultivées</td><td>Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.&nbsp ;</td><td>G1262</td><td></td></tr><tr><td>Acide oléique&nbsp ;</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A502071</tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>SPSS 24.0</td><td></td><td>Logiciel</td><td></td> de statistiques</tr></tbody></table>

modélisation in vitro du dépôt de graisse dans la maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique

In Vitro Modeling of Fat Deposition in Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease

La prévalence de la maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) a augmenté en raison de changements dans les modèles économiques et de mode de vie, entraînant d’importants problèmes de santé. Des rapports antérieurs ont étudié l’établissement de modèles animaux et cellulaires pour la MASLD, mettant en évidence les différences entre eux. Dans cette étude, un modèle cellulaire a été créé en induisant l’accumulation de graisse dans le MASLD. Les cellules HepG2 ont été stimulées avec l’acide oléique, un acide gras insaturé, à diverses concentrations (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) pour émuler le MASLD. L’efficacité du modèle a été évaluée à l’aide de tests du kit de comptage cellulaire 8, de la coloration Oil Red O et de l’analyse de la teneur en lipides. Cette étude visait à créer un modèle cellulaire simple à utiliser pour les cellules MASLD. Les résultats des tests du kit de comptage cellulaire 8 ont montré que la survie des cellules HepG2 dépendait de la concentration d’acide oléique, avec un IG50 de 1,875 mM. La viabilité cellulaire dans les groupes 0,5 mM et 1 mM était significativement plus faible que dans le groupe témoin (P < 0,05). De plus, la coloration au rouge d’huile O et l’analyse de la teneur en lipides ont examiné les dépôts de graisse à diverses concentrations d’acide oléique (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) sur les cellules HepG2. La teneur en lipides des groupes 0,25 mM, 0,5 mM et 1 mM était significativement plus élevée que celle du groupe témoin (P < 0,05). De plus, les taux de triglycérides dans les groupes OA étaient significativement plus élevés que ceux du groupe témoin (P < 0,05).

Effet de l’acide oléique sur la viabilité cellulaire Les cellules HepG2 ont été exposées à des concentrations variables d’OA (0 mM, 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM), ce qui a entraîné une diminution des taux de survie cellulaire à 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM et 1 mM par rapport à 0 mM. Une signification statistique a été observée à 0,5 mM (P &lt; 0,05) et 1 mM (P &lt; 0,05) par rapport à 0 mM. Les résultats de l’impact de l’OA sur la viabilité cellulaire, tels qu’évalués par le kit CCK-8, sont présentés à la figure 2. La valeur IG50 pour les cellules HepG2 traitées par l’OA a été calculée à 1,875 mM.
Coloration au rouge O à l’huile pour observer la formation de gouttelettes lipidiques intracellulaires La coloration ORO est une méthode couramment utilisée pour la visualisation des lipides16,17. Par conséquent, la formation de gouttelettes lipidiques dans les cellules HepG2 incubées avec l’OA pendant 24 h a été observée au microscope après coloration ORO. Comme le montrent les figures 3 et 4, l’intensité de la coloration rouge dans les cellules traitées à l’OA était plus élevée que dans les cellules non traitées. Des gouttelettes lipidiques rouges étaient présentes dans le plasma des cellules HepG2 après le traitement par l’OA, les quantités de gouttelettes lipidiques et de lipides augmentant avec l’augmentation des concentrations d’OA (figure 5).
Effets de différentes concentrations d’acide oléique sur les triglycérides totaux dans le surnageant des cellules HepG2 Les résultats expérimentaux, comme l’illustre la figure 6, ont révélé que, par rapport au groupe témoin, le traitement des cellules HepG2 avec des concentrations variables d’OA (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) a entraîné une augmentation significative de la teneur en TG du surnageant cellulaire dans le groupe OA (P &lt; 0,05).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig01.jpg"> Figure 1 : Organigramme pour la coloration au rouge d’huile. Abréviations : OA = acide oléique ; OD = densité optique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig02.jpg"> Figure 2 : Effet de l’acide oléique sur la viabilité cellulaire, évalué à l’aide d’un test de comptage cellulaire-8. Chaque barre représente la moyenne ± ET (n = 6). *P &lt; 0,05. Abréviation : OA = acide oléique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig03.jpg"> Figure 3 : Images de coloration en O rouge à l’huile de plusieurs points temporels (directions 3, 6, 9 et 12 heures). La formation de gouttelettes lipidiques a été détectée à l’aide d’un microscope inversé pour la culture cellulaire à un grossissement de 40x. Barre d’échelle = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig04.jpg"> Figure 4 : Effet de l’acide oléique sur les gouttelettes lipidiques dans les cellules, évalué par coloration au rouge d’huile. La formation de gouttelettes lipidiques a été détectée à l’aide d’un microscope inversé pour la culture cellulaire à un grossissement de 40x. Barre d’échelle = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig05.jpg"> Figure 5 : Effet de l’acide oléique sur la teneur en lipides dans les cellules, évalué par la valeur de la densité optique. Les changements de pli relatifs sont présentés dans les valeurs de densité optique dans différents groupes. Chaque colonne représente la moyenne ± ET (n = 16). *P &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig06.jpg"> Figure 6 : Effets de diverses concentrations d’acide oléique sur les taux de triglycérides totaux dans le surnageant des cellules HepG2. Les changements de pli relatifs sont présentés dans la valeur des taux de triglycérides dans différents groupes. Chaque colonne représente la moyenne ± ET (n = 3). *P &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Cet article décrit l’utilisation de cellules HepG2 induites par l’acide oléique comme modèle de maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique.

Modélisation in vitro du dépôt de graisse dans la maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique

The prevalence of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) has surged due to changes in economic and lifestyle patterns, leading ...

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Découvrez comment modéliser la stéatose hépatique métabolique en utilisant des cellules HepG2 traitées à l'acide oléique. Cette méthode permet d'étudier l'accumulation lipidique et les mécanismes de la maladie.

Modélisation in vitro du dépôt de graisse dans la maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique

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