Name: Développement d’un test pour le criblage de médicaments à haut débit contre les mycobactéries (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Découvrez un protocole de criblage à haut débit contre Mycobacterium abscessus utilisant une souche double rapporteur et l'automatisation robotisée. Cette méthode accélère la découverte de nouveaux traitements antibactériens efficaces.

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<meta charset="utf8"></head><body>Essai de dépistage à haut débit de Mycobacterium abscessus à l’aide de deux rapporteurs

<ol><li>Victoria, L., Gupta, A., Gomez, J. L., Robledo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+abscessus+complex%3A+A+review+of+recent+developments+in+an+emerging+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium abscessus complex: A review of recent developments in an emerging pathogen.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 659997(2021).</li>
<li>Luthra, S., Rominski, A., Sander, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+antibiotic-target-modifying+and+antibiotic-modifying+enzymes+in+Mycobacterium+abscessus+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of antibiotic-target-modifying and antibiotic-modifying enzymes in Mycobacterium abscessus drug resistance.</a> Front Microbiol. 9, 2179(2018).</li>
<li>Nathavitharana, R. R., Strnad, L., Lederer, P. A., Shah, M., Hurtado, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+questions+in+the+diagnosis+and+treatment+of+pulmonary+M.+abscessus+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Forum+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Top questions in the diagnosis and treatment of pulmonary M. abscessus disease.</a> Open Forum Infect Dis. 6 (7), ofz221(2019).</li>
<li>Cristancho-Rojas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Mycobacterium abscessus.</a> Clin Microbiol Infect. 30 (6), 712-717 (2024).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+repositioning%3A+Progress+and+challenges+in+drug+discovery+for+various+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Drug repositioning: Progress and challenges in drug discovery for various diseases.</a> Eur J Med Chem. 234, 114239(2022).</li>
<li>Doan, T. L., Pollastri, M., Walters, M. A., Georg, G. I. The future of drug repositioning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDoan%2C+TL+%22Annual+reports+in+medicinal+chemistry%22">Annual reports in medicinal chemistry</a>. Macor, J. E. , Academic Press. 385-401 (2011).</li>
<li>Bento, C. M., Gomes, M. S., Silva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+antibacterial+drug+screening+methods%3A+Current+prospects+for+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Evolution of antibacterial drug screening methods: Current prospects for mycobacteria.</a> Microorganisms. 9 (12), 2562(2021).</li>
<li>Attene-Ramos, M. S., Austin, C. P., Xia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Encycl+Toxicol%22%5BJournal%5D)">High throughput screening.</a> Encycl Toxicol. 3, 916-917 (2014).</li>
<li>Gupta, R., Netherton, M., Byrd, T. F., Rohde, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter-based+assays+for+high-throughput+drug+screening+against+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reporter-based assays for high-throughput drug screening against Mycobacterium abscessus.</a> Front Microbiol. 8, 2204(2017).</li>
<li>Bento Clara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+double-reporter+strains+of+Mycobacterium+abscessus+for+drug+discovery%3A+A+study+in+mScarlet%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel double-reporter strains of Mycobacterium abscessus for drug discovery: A study in mScarlet.</a> Microbiol Spectr. , e0036224(2024).</li>
<li>Kolbe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+optimization+of+chromosomally-integrated+fluorescent+Mycobacterium+tuberculosis+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and optimization of chromosomally-integrated fluorescent Mycobacterium tuberculosis reporter constructs.</a> Front Microbiol. 11, 591866(2020).</li>
<li>Lopez-Roa, P., Esteban, J., Munoz-Egea, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+review+on+the+mechanisms+of+pathogenicity+in+Mycobacterium+abscessus%2C+a+rapidly+growing+emerging+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Updated review on the mechanisms of pathogenicity in Mycobacterium abscessus, a rapidly growing emerging pathogen.</a> Microorganisms. 11 (1), 90(2022).</li>
<li>Bray, M. A., Carpenter, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBray%2C+MA+%22Advanced+assay+development+guidelines+for+image-based+high+content+screening+and+analysis+in+Assay+guidance+manual%22">Advanced assay development guidelines for image-based high content screening and analysis in Assay guidance manual</a>. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, Bethesda (MD). (2004).</li>
<li>Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CLSI+document+M07-A10%22">CLSI document M07-A10</a>. , 10th ed, Wayne, PA. (2015).</li>
<li>Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactoferricin+peptides+increase+macrophages%27+capacity+to+kill+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Lactoferricin peptides increase macrophages' capacity to kill Mycobacterium avium.</a> mSphere. 2 (4), e00301-e00317 (2017).</li>
<li>Bento, C. M., Gomes, M. S., Silva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+beyond+typical+treatments+for+atypical+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Looking beyond typical treatments for atypical mycobacteria.</a> Antibiotics (Basel). 9 (1), 18(2020).</li>
<li>Spizek, J., Rezanka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lincosamides%3A+Chemical+structure%2C+biosynthesis%2C+mechanism+of+action%2C+resistance%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Lincosamides: Chemical structure, biosynthesis, mechanism of action, resistance, and applications.</a> Biochem Pharmacol. 133, 20-28 (2017).</li>
<li>Hurst-Hess, K. R., Rudra, P., Ghosh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+protection+as+a+mechanism+of+lincosamide+resistance+in+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Ribosome protection as a mechanism of lincosamide resistance in Mycobacterium abscessus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 65 (11), e0118421(2021).</li>
<li>Kang, J. K., Kang, H. K., Hyun, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+effects+of+spiramycin+in+lps-activated+raw+264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory effects of spiramycin in lps-activated raw 264.7 macrophages.</a> Molecules. 27 (10), 3202(2022).</li>
<li>Zimmermann, P., Ziesenitz, V. C., Curtis, N., Ritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunomodulatory+effects+of+macrolides-a+systematic+review+of+the+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunomodulatory effects of macrolides-a systematic review of the underlying mechanisms.</a> Front Immunol. 9, 302(2018).</li>
<li>Pradhan, S., Madke, B., Kabra, P., Singh, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+immunomodulatory+effects+of+antibiotics+and+their+use+in+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of antibiotics and their use in dermatology.</a> Indian J Dermatol. 61 (5), 469-481 (2016).</li>
<li>Volochnyuk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+commercially+available+compounds+for+hts%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Evolution of commercially available compounds for hts.</a> Drug Discov Today. 24 (2), 390-402 (2019).</li>
<li>Sritharan, S., Sivalingam, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+review+on+time-tested+anticancer+drug+doxorubicin%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">A comprehensive review on time-tested anticancer drug doxorubicin.</a> Life Sci. 278, 119527(2021).</li>
<li>Arwanih, E. Y., Louisa, M., Rinaldi, I., Wanandi, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+mechanism+of+acute+myeloid+leukemia+cells+against+daunorubicin+and+cytarabine%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Resistance mechanism of acute myeloid leukemia cells against daunorubicin and cytarabine: A literature review.</a> Cureus. 14 (12), e33165(2022).</li>
<li>Khasraw, M., Bell, R., Dang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epirubicin%3A+Is+it+like+doxorubicin+in+breast+cancer%3F+A+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Breast%22%5BJournal%5D)">Epirubicin: Is it like doxorubicin in breast cancer? A clinical review.</a> Breast. 21 (2), 142-149 (2012).</li>
<li>Schultz, C. W., Nevler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrvinium+pamoate%3A+Past%2C+present%2C+and+future+as+an+anti-cancer+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Pyrvinium pamoate: Past, present, and future as an anti-cancer drug.</a> Biomedicines. 10 (12), 3249(2022).</li>
<li>Bailly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+thiopeptide+thiostrepton.+An+update+of+its+mode+of+action%2C+pharmacological+properties+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The bacterial thiopeptide thiostrepton. An update of its mode of action, pharmacological properties and applications.</a> Eur J Pharmacol. 914, 174661(2022).</li>
<li>Kwok, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiostrepton+selectively+targets+breast+cancer+cells+through+inhibition+of+forkhead+box+m1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Thiostrepton selectively targets breast cancer cells through inhibition of forkhead box m1 expression.</a> Mol Cancer Ther. 7 (7), 2022-2032 (2008).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiostrepton%3A+A+novel+therapeutic+drug+candidate+for+Mycobacterium+abscessus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Thiostrepton: A novel therapeutic drug candidate for Mycobacterium abscessus infection.</a> Molecules. 24 (24), 4511(2019).</li>
<li>Perry, C. M., Scott, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cefdinir%3A+A+review+of+its+use+in+the+management+of+mild-to-moderate+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Cefdinir: A review of its use in the management of mild-to-moderate bacterial infections.</a> Drugs. 64 (13), 1433-1464 (2004).</li>
<li>Ramon-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+clinically+approved+cephalosporins+for+tuberculosis+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Repurposing clinically approved cephalosporins for tuberculosis therapy.</a> Sci Rep. 6, 34293(2016).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+abscessus+l%2Cd-transpeptidases+are+susceptible+to+inactivation+by+carbapenems+and+cephalosporins+but+not+penicillins%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium abscessus l,d-transpeptidases are susceptible to inactivation by carbapenems and cephalosporins but not penicillins.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (10), e00866-e00917 (2017).</li>
<li>Alvirez-Freites, E. J., Carter, J. L., Cynamon, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+activities+of+gatifloxacin+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo activities of gatifloxacin against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1022-1025 (2002).</li>
<li>Braback, M., Riesbeck, K., Forsgren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibilities+of+Mycobacterium+marinum+to+gatifloxacin%2C+gemifloxacin%2C+levofloxacin%2C+linezolid%2C+moxifloxacin%2C+telithromycin%2C+and+quinupristin-dalfopristin+%28synercid%29+compared+to+its+susceptibilities+to+reference+macrolides+and+quinolones%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Susceptibilities of Mycobacterium marinum to gatifloxacin, gemifloxacin, levofloxacin, linezolid, moxifloxacin, telithromycin, and quinupristin-dalfopristin (synercid) compared to its susceptibilities to reference macrolides and quinolones.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1114-1116 (2002).</li>
</ol>

Mycobacterium abscessus (Mab) est un agent pathogène opportuniste responsable d’infections pulmonaires, en particulier chez les personnes atteintes de mucoviscidose et d’autres troubles pulmonaires. Les infections causées par l’épi mab sont tristement difficiles à traiter en raison de leur résistance intrinsèque aux médicaments, comparable à celle de la tuberculose multirésistante1. Les médicaments disponibles sont largement inefficaces en raison de l’enveloppe cellulaire mycobactérienne hautement imperméable et d’un génome qui code pour plusieurs enzymes qui désactivent les antibiotiques2. Ainsi, le traitement comprend la combinaison de plusieurs médicaments prenant des mois à des années. Ce schéma thérapeutique multimédicamenteux complexe, combiné à une faible observance du patient, se traduit par un taux de guérison moyen de 30 % à 50 %3. De plus, la prévalence des infections pulmonaires causées par des mycobactéries non tuberculeuses a augmenté au cours des dernières décennies, y compris celles causées par Mab 1,4. Par conséquent, la communauté scientifique s’efforce de développer de nouveaux composés pour traiter les infections à Mab.
L’une des stratégies poursuivies dans ce but est la réaffectation des médicaments, c’est-à-dire le processus d’identification de nouvelles opportunités thérapeutiques pour les médicaments existants. Cela permet de contourner le plus grand défi accompagnant le pipeline de découverte et de développement d’un nouveau médicament - temps5. Ce concept simple tire parti des profils pharmacocinétiques et d’innocuité déjà établis de plusieurs médicaments pour réduire les coûts de développement et raccourcir le délai nécessaire pour acheminer un médicament du laboratoire au chevet du patient6. Ainsi, des banques qui combinent des centaines à des milliers de ces composés ont été compilées, ce qui permet aux chercheurs de tester rapidement la possibilité de réorienter les médicaments contre leur agent pathogène d’intérêt.
La plupart des études sur le développement de médicaments contre le Mab sont basées sur un test traditionnel de référence qui évalue l’activité in vitro d’un composé contre les mycobactéries - les unités formant des colonies comptant7. Malgré sa précision, cette procédure prend énormément de temps, devenant rapidement irréalisable lorsque quelqu’un vise à tester des banques contenant des milliers de composés. À cette fin, les criblages à haut débit (HTS) ont été intégrés dans le développement de médicaments - des tests robustes qui tirent parti de la robotique et des dispositifs de manipulation des liquides, permettant à des milliers de composés d’être rapidement criblés en parallèle8. Cela se fait généralement en testant initialement une seule concentration, à l’aide de plaques de microtitration de formats 96, 384, 1536 ou 3456 puits, servant de point de départ pour identifier les résultats et les optimiser davantage en cours de développement pour être utilisés cliniquement.
Les dosages basés sur le rapporteur offrent un avantage significatif pour la robustesse des SHD en raison de leur simplicité et de leur sensibilité par rapport à d’autres dosages basés sur les colorants et l’absorbance 7,9. Cependant, à notre connaissance, seules quelques études ont permis d’optimiser un dépistage à haut débit contre Mab9.
Récemment, notre laboratoire a mis au point des souches à double rapporteur capables d’émettre simultanément une luminescence et une fluorescence10. Mab operon_mScarlet est l’une de ces souches. Il est autoluminescent en raison de l’expression de l’opéron LuxABCDE , qui comprend une luciférase bactérienne (par expression des gènes luxAB ) et un substrat aldéhyde à longue chaîne (par expression des gènes luxCDE ). D’autre part, la lecture fluorescente est obtenue par l’expression d’une protéine fluorescente rouge récemment développée, mScarlet, qui surpasse les protéines eGFP et mCherry plus couramment utilisées, fournissant un signal plus puissant11. L’utilisation de cette souche nous permet d’évaluer la viabilité bactérienne en culture liquide en mesurant le signal luminescent dans un lecteur de microplaques sans ajouter de réactifs ni effectuer d’étapes supplémentaires. En termes de détection, la fluorescence intrinsèque permet une visualisation au microscope dans des cellules vivantes ou fixes sans utiliser de colorants ou d’anticorps. Le fait d’avoir une seule souche avec les deux lectures offre aux chercheurs un avantage significatif lorsqu’ils l’utilisent dans les tests HTS - la variabilité réduite entre les tests avec des lectures différentes, car il n’est pas nécessaire d’échanger les souches en fonction de la nature du test.
Ainsi, ce travail a mis au point un test à haut débit contre Mab à l’aide d’une souche double rapporteure conçue en interne (Figure 1). Cela a permis d’évaluer rapidement l’activité in vitro des médicaments 1280 destinés à être repositionnés à l’aide d’une bibliothèque commerciale (voir la table des matériaux). Tout d’abord, les activités ont été évaluées dans un essai de culture en bouillon utilisant la luminescence, et deuxièmement, en utilisant des macrophages infectés par Mab tirant parti du signal fluorescent, imitant mieux le processus d’infection observé in vivo12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig01v2.jpg"> Figure 1 : Résumé graphique du protocole établi. L’acteur clé de ce criblage est une souche mycobactérienne à double rapporteur développée en interne, qui est utilisée dans toutes les expériences. Tout d’abord, à l’aide d’un distributeur de réactifs et de bactéries planctoniques, un premier criblage est effectué en testant les composés à une concentration unique. Les résultats positifs identifiés se poursuivent lors de l’essai de validation, où trois concentrations différentes sont testées. Les deux expériences sont réalisées à l’aide de la lecture luminescente. Les résultats validés se poursuivent dans le test d’infection, où trois concentrations différentes sont également testées, et où des macrophages dérivés de la moelle osseuse sont infectés au MOI 1. Un système d’imagerie à haut contenu acquiert le signal fluorescent bactérien, et un logiciel d’analyse est utilisé pour évaluer la charge intracellulaire à l’aide de la formule de la mycocharge. Le nombre de composés diminue à mesure que la complexité du test augmente. Créé avec BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>10 % Neutre formalin tamponné</td><td>Bio Optica</td><td>05-01005Q</td><td>solution de fixation</td></tr><tr><td>384-puits noir à fond rond polypropylène non traité microplaque</td><td>Corning</td><td>3658</td><td>Des microplaques blanches peuvent être utilisées ; polystyrène peut être utilisé</td></tr><tr><td>50 TS Washer</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Breathe-Easy membrane d’étanchéité</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>cellule :: explorer</td><td>Revvity</td><td></td><td>robot de manutention</td></tr><tr><td>d’équipement Clarithromycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3487-100MG</td><td>Dissous dans du DMSO jusqu’à la concentration souhaitée</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/4121/PB15</td><td>Dilué dans un milieu de croissance liquide jusqu’à la concentration souhaitée</td></tr><tr><td>Harmony 5.1</td><td>Logiciel d’analyse de</td><td>la</td><td></td> révérence</tr><tr><td>Heracell VIOS 160i CO2 Incubateur, 165 L</td><td>Incubateur à cellules Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JANUS avec bras à 4 pointes et bras MDT</td><td>Revvity</td><td></td><td>manipulateur de liquide</td></tr><tr><td>KB 8182</td><td>Incubateur Termaks</td><td></td><td>avec agitation</td></tr><tr><td>Libra S4+</td><td>Biochrom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multidrop&nbsp ; Distributeur de réactifs combiné</td><td>Système</td> d’imagerie Thermo Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>Opera Phenix Plus</td><td>Revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate</td><td>Revvity</td><td>6055302</td><td>Nécessaire pour les microscopes à haut contenu</td></tr><tr><td>Tampon phosphate salin (PBS) 1x</td><td>solution de lavage</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Prestwick Chemical libraries&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Bibliothèque chimique commerciale destinée à la réaffectation de médicaments</td></tr><tr><td>Incubateur à secouer 3031</td><td>GFL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VICTOR Nivo</td><td>Revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milieu de culture cellulaire :</td><td></td><td></td><td>Si nécessaire, ajouter 10 % de supplément</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10938-025</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>LCCM</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Milieu conditionné à partir d’une lignée cellulaire L929 qui libère un facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) ; supplément de milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>L-glutamine (200 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium 100 mM (100X)</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>< forte> solution de lavage par infection </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Eau</td><td></td><td></td> apirogène <td>Plusieurs fournisseurs disponibles</td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée Hank’s 10x</td><td>Gibco</td><td>14060-040</td><td>Diluer à 1x avec de l’eau apirogène</td></tr> <tr><td>< forte> Solution perméabilisante </forte></td><td></td><td></td><td>PBS avec 0,1 % Triton X100</td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Autres fournisseurs disponibles</td></tr><tr><td>Staining solution</td><td></td><td></td><td>PBS avec DAPI (500 ng/mL) et HCS Far Red (10 ng/mL)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>HCS Far Red&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>H32721</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles</td></tr> <tr><td><fort>Milieu de croissance liquide</fort></td><td></td><td></td><td>Si nécessaire, ajoutez 10 %</td></tr><tr><td>de supplément Middlebrook 7H9 Broth</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4780</td><td>0,05 % de concentration finale. Autres fournisseurs disponibles</td></tr> <tr><td>Supplément de milieu de croissance liquide :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9702-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose anhydre</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0450/60</td><td></td></tr></tbody></table>

développement d’un test pour le criblage de médicaments à haut débit contre les mycobactéries

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Évaluation du facteur Z La figure 2 représente les données d’une des deux expériences réalisées pour calculer le facteur Z'. Le témoin positif était la clarithromycine à 4 μg/mL. Les deux expériences ont donné des facteurs Z' de 0,64 et 0,62, ce qui signifie que les conditions et la lecture utilisées pour ce test peuvent être appliquées au test de dépistage qui a suivi (Z' &gt; 0,5). Néanmoins, le facteur Z a été calculé pour toutes les expériences restantes (test d’infection) afin de contrôler les performances de chaque expérience.
Comme preuve de concept du test HTS conçu, une bibliothèque de composés destinés à la réaffectation de médicaments a été testée. Il comprend 1280 molécules diverses et petites, dont 95% sont des médicaments approuvés par la FDA et l’EMA. Ces molécules offrent une grande diversité chimique et pharmacologique.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig02.jpg"> Figure 2 : Résultats de l’évaluation du facteur Z. L’anticorps monoclonal à 2,5 x10 5 UFC/mL a été incubé avec et sans clarithromycine à 4 μg/mL pendant 48 h à 37 °C. Après la période d’incubation, la luminescence a été mesurée pour évaluer la viabilité mycobactérienne. Le graphique montre les valeurs de luminescence individuelles des mycobactéries viables traitées et non traitées dans une expérience indépendante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Projection de la bibliothèque pour les visites Tous les composés ont été testés à 6,66 μM contre Mab. En raison de la taille de la bibliothèque, les composés ont été divisés en quatre plaques de microtitration différentes à 384 puits (figure 3A-D). Les résultats ont été normalisés pour le solvant et l’effet de bord vérifié.
Dans cet essai de dépistage, trente-trois résultats ont été identifiés, dont trente ont considérablement diminué l’émission de luminescence, réduisant ainsi la viabilité mycobactérienne (figure 3). Il est intéressant de noter que trois composés ont conduit à une émission de luminescence plus élevée, peut-être liée à une augmentation du métabolisme bactérien ou à une prolifération (Figure 3). Les 33 résultats ont été retenus pour l’essai de validation, y compris les trois composés qui augmentaient la luminescence, afin de vérifier si ce profil serait conservé.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig03.jpg"> Figure 3 : Résultats du criblage en banque. (A-D) Le Mab à 2,5 x 105 UFC/mL a été incubé avec 1280 composés à 6,66 μM pendant 48 h à 37 °C. Après l’incubation, la luminescence a été mesurée pour évaluer la viabilité mycobactérienne. Les graphiques montrent le RLU d’une expérience indépendante, présenté sous forme d’unités arbitraires après normalisation du solvant et de l’effet de bord. L’AVG RLU et l’écart-type correspondant ont été calculés pour chaque plaque afin de déterminer un seuil (en gris ; AVG ± 3SD). Les symboles ronds représentent un composé testé. En bleu, tout composé en dehors de ce seuil est considéré comme un succès. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Test de validation des résultats positifs Les concentrations utilisées pour ce test étaient de 13,3 μM, 6,66 μM et 3,3 μM. Chaque composé a été testé en double pour augmenter la robustesse.
Il est important de noter que les composés 30, 31 et 32, précédemment associés à des RLU plus élevés (figures 3A, C), ont conservé ce profil, avec plus de 200 % de la viabilité mycobactérienne obtenue dans les puits traités avec le composé 32 (figure 4).
Les composés 20 et 33 ont été jugés inactifs, car la viabilité mycobactérienne est proche de 100 % dans toutes les concentrations testées (figure 4).
Les composés 9 et 21 présentaient une inactivité similaire aux deux concentrations les plus faibles ; cependant, contrairement à 20, ils restent actifs au plus haut, 13,3 μM, le composé 21 affichant une puissance plus élevée (figure 4).
Le composé 3 présente également une inactivité à la concentration la plus faible et une perte d’activité à 6,66 μM, bien que inférieure à celle du composé 21 (figure 4). Ce n’est qu’à la concentration la plus faible que les composés 2, 7, 8, 10, 16, 18, 24 et 28 ont montré un potentiel thérapeutique plus faible. Cependant, 2, 10 et 28 conduisent toujours à &lt;50% de la viabilité mycobactérienne.
À l’échelle mondiale, les quatorze composés restants étaient actifs dans toutes les concentrations testées.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig04.jpg"> Figure 4 : Résultats du test de validation des résultats. À raison de 2,5 x 105 UFC/mL, chaque occurrence précédemment identifiée étant à 13,3 μM, 6,66 μM et 3,3 μM (1,3 %, 0,7 % et 0,3 % de DMSO, respectivement) pendant 48 h à 37 °C. Après la période d’incubation, la luminescence a été mesurée pour évaluer la viabilité mycobactérienne. Le graphique montre les pourcentages de mycobactéries viables traitées par rapport aux mycobactéries non traitées d’une expérience indépendante, chaque composé étant testé en double. Les symboles ronds représentent les doublons de chaque composé. Les barres représentent la moyenne de ces doublons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Dosage de l’infection Sur trente-trois composés testés, vingt-huit ont été sélectionnés pour l’essai d’infection (figure 4). Les composés 7, 8, 9, 20 et 33 n’ont pas été retenus pour cet essai. Alors que 9, 20 et 33 ont été laissés de côté en raison de leur inactivité lors de la validation (figure 4), les deux premiers ont été laissés de côté pour des raisons techniques. Néanmoins, ces composés ont été identifiés comme étant la rifampicine et le linézolide, des antibiotiques déjà utilisés pour traiter les infections à Mab12. Tous les composés testés dans le cadre de l’essai d’infection ont été identifiés et sont énumérés dans le tableau 1. L’activité antimicrobienne des composés contre les macrophages infectés par Mab a été évaluée en utilisant la fluorescence intrinsèque de la bactérie comme lecture.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composé</td>
			<td>Nom</td>
			<td>Composé</td>
			<td>Nom</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>Le sulfathiazole</td>
			<td>18</td>
			<td>Cévuroxime</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>Ciprofloxacine</td>
			<td>19</td>
			<td>La rifaximine</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>Céfotaxime</td>
			<td>21</td>
			<td>Cefdinir</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>Daunorubicine</td>
			<td>22</td>
			<td>Clarithromycine</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>Doxorubicine</td>
			<td>23</td>
			<td>Bésifloxacine</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>Thiostrepton</td>
			<td>24</td>
			<td>Lévofloxacine</td>
		</tr><tr><td>10</td>
			<td>Amikacine</td>
			<td>25</td>
			<td>La rifabutine</td>
		</tr><tr><td>11</td>
			<td>Moxalactam</td>
			<td>26</td>
			<td>Gatifloxacine</td>
		</tr><tr><td>12</td>
			<td>Sulfaméthizole</td>
			<td>27</td>
			<td>Épirubicine</td>
		</tr><tr><td>13</td>
			<td>Sulfamonométhoxine</td>
			<td>28</td>
			<td>Pamoate de pyrvinium</td>
		</tr><tr><td>14</td>
			<td>Céfoxitine</td>
			<td>29</td>
			<td>Moxifloxacine</td>
		</tr><tr><td>15</td>
			<td>Novobiocine</td>
			<td>30</td>
			<td>Troleandomycine</td>
		</tr><tr><td>16</td>
			<td>Cefmétazole</td>
			<td>31</td>
			<td>Lincomycine</td>
		</tr><tr><td>17</td>
			<td>Roxithromycine</td>
			<td>32</td>
			<td>La spiramycine</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Liste des composés testés dans le test d’infection. Les composés validés à l’étape 4 ont été testés dans le test d’infection (étape 5).
La toxicité des composés vis-à-vis des macrophages infectés par Mab a été le premier paramètre évalué. Le seuil établi pour juger un composé toxique ou non toxique était de 85 % de macrophages viables (figure 5). Sur les vingt-huit composés testés, 4, 5, 6, 27 et 28 ont été jugés toxiques. (Figure 5). Par conséquent, ces cinq composés ont été exclus de l’évaluation suivante de l’activité intramacrophage.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig05.jpg"> Figure 5 : Toxicité des occurrences vis-à-vis des macrophages infectés par Mab. Les BMM de souris BALB/c ont été infectées par Mab (MOI = 1) et incubées avec chaque coup précédemment identifié à 13,3 μM, 6,66 μM et 3,3 μM (1,3 %, 0,7 % et 0,3 % de DMSO, respectivement) pendant 48 h à 37 °C avec 7 % de CO2. Les cellules ont été imagées à l’aide d’un microscope à fluorescence de dépistage à haut contenu, en utilisant le nombre de noyaux (colorés avec du DAPI) pour mesurer la viabilité cellulaire. Le graphique montre les pourcentages de macrophages infectés viables traités par rapport aux macrophages infectés viables non traités de deux expériences indépendantes. Des symboles ronds représentent la viabilité de la cellule pour chaque essai. Les barres représentent la moyenne de deux expériences indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Pour inférer l’activité intramacrophagique des vingt-trois composés restants contre les anticorps mabiques intracellulaires (figure 6), la formule de la mycocharge (expliquée précédemment à l’étape 6) a été utilisée pour obtenir le pourcentage de viabilité mycobactérienne normalisé par rapport aux macrophages infectés non traités. La plupart des composés ont perdu leur potentiel thérapeutique contre les mycobactéries internalisées (figure 6) par rapport au test de validation des résultats (figure 4), car le nombre de résultats est passé de vingt-cinq à six à la concentration testée la plus élevée. Étonnamment, les trois composés qui ont augmenté la viabilité du Mab planctonique par rapport aux bactéries non traitées (30, 31 et 32 ; Les figures 3 et 4) ont montré une activité antimycobactérienne contre les anticorps monoclonaux intracellulaires, les composés 30 et 32 présentant une différence statistique significative par rapport au DMSO, même à 3,3 μM dans le cas du composé 32 (figure 6). Les mycobactéries traitées avec les composés 11 et 23 ont montré une viabilité &lt;50 % à 13,3 μM ; cependant, ce n’était pas significativement différent de celui du témoin DMSO (figure 6). Les composés 21, 26 et 29 étaient suffisamment puissants à 13,3 μM pour justifier une différence statistique significative, 29 étant les plus actifs (Figure 6). Enfin, les composés 17, 22 et 25 étaient extrêmement puissants dans toutes les concentrations testées contre les mycobactéries internalisées. Il s’agit de la roxithromycine, de la clarithromycine et de la rifabutine, respectivement (tableau 1). Des trois composés, la clarithromycine était le plus actif contre Mab, la viabilité mycobactérienne n’ayant jamais dépassé 10 %, présentant une valeur p &lt;0,0001 dans toutes les concentrations testées par rapport au DMSO (figure 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig06.jpg"> Figure 6 : Activité intramacrophagique des occurrences contre les macrophages infectés par Mab. Les BMM de souris BALB/c ont été infectées par Mab (MOI = 1) et incubées avec chaque résultat précédemment identifié à 13,3, 6,66 et 3,3 μM (1,3, 0,7 et 0,3 % de DMSO, respectivement) pendant 48 h à 37 °C avec 7 % de CO2. Les cellules ont été imagées à l’aide d’un microscope à fluorescence de dépistage à haut contenu, et le signal fluorescent a été utilisé pour calculer la mycocharge (voir l’étape 6). Le graphique montre les pourcentages de Mycoload trouvés dans les macrophages infectés traités par rapport aux macrophages infectés non traités dans deux expériences indépendantes. Les statistiques ont été réalisées à l’aide de l’ANOVA à deux facteurs avec le test de comparaison multiple de Dunnet ; *, p &lt; 0,05 ; **, p &lt; 0,01 ; , p. &lt; 0,001 ; , p &lt; 0,0001 par rapport au DMSO (contrôle des solvants). Les astérisques suivent le même code couleur pour chaque concentration que la légende du graphique. Des symboles ronds représentent la Mycoload pour chaque dosage. Les barres représentent la moyenne de deux expériences indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : Exemple de disposition d’une plaque à 384 puits utilisée dans l’évaluation du facteur Z. Blanc - puits vides (milieu de croissance liquide uniquement) ; jaune - contrôle positif (bactéries traitées avec un antibiotique) ; rouge - contrôle négatif (bactéries non traitées). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2 : Exemple d’une disposition de plaque à 384 puits utilisée dans le criblage de bibliothèque. Blanc - puits vides (milieu de croissance liquide uniquement) ; vert - contrôle des solvants ; rouge - contrôle négatif (bactéries non traitées) ; bleu - composés à cribler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 3 : Exemple d’une disposition de plaque de 384 puits utilisée pour la validation des résultats. Blanc - puits vides (milieu de croissance liquide uniquement) ; vert - contrôle des solvants (en doubles) ; rouge - contrôle négatif (bactéries non traitées) ; bleu - composés à cribler (en doublets). Les couleurs délavées représentent des dilutions en série de 1:2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 4 : Exemple d’une disposition de plaque à 96 puits utilisée pour un test d’infection. Blanc - puits vides (eau pour éviter l’évaporation) ; rouge - contrôle négatif (macrophages non traités) ; jaune - contrôle positif (macrophages traités avec un antibiotique) ; vert - contrôle des solvants ; bleu - composés à tester. Les couleurs délavées représentent des dilutions en série de 1:2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%204.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 5 : Protocole d’analyse d’images. Un protocole détaillé d’analyse d’images est utilisé dans ce travail, qui peut être adapté à des logiciels open source. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%205.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Développement d’un test pour le criblage de médicaments à haut débit contre les mycobactéries

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente un test permettant d’évaluer l’efficacité des médicaments contre l’infection à Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  Un modèle d’infection in vitro contenant des agrégats de Mtb/macrophages est généré qui imite l’infection in vivo. Lors de l’introduction d’antibiotiques appropriés, leur efficacité est testée par dosage de la résuzarine pour surveiller la survie des bactéries avec des concentrations de médicament croissantes.

Un test pour évaluer l’efficacité d’un médicament contre un modèle d’infection à Mycobacterium tuberculosis

Ici, nous décrivons une analyse phénotypique applicable aux écrans à haut débit/à haute teneur de l’ARN synthétique de petit-interférent (siRNA), du composé chimique, et des bibliothèques mutantes de tuberculose de mycobactérie. Cette méthode repose sur la détection de Mycobacterium tuberculosis marqué par fluorescence dans une cellule hôte marqué par fluorescence à l’aide d’une microscopie confocale automatisée.

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

Nous avons mis au point un système modulaire de criblage à haut débit pour la découverte de nouveaux composés contre la tuberculose Mycobacterium, ciblant les bactéries à croissance intracellulaire et en bouillon ainsi que cytotoxicité contre la cellule hôte mammifère.

Système d&#39;efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

De nouveaux modèles et tests qui amélioreraient le processus de développement précoce des médicaments antituberculeux de nouvelle génération sont hautement souhaitables. Nous décrivons ici un test rapide, peu coûteux et compatible BSL-2 pour évaluer l’efficacité d’un médicament contre Mycobacterium tuberculosis qui peut être facilement adapté au criblage à haut débit.

Un haut-débit Assay Compatible pour évaluer l&#39;efficacité des médicaments contre Macrophage repiquées<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Cette méthode décrit l'utilisation de système d'imagerie infrarouge à base de colorants pour la détection du virus H1N1 dans broncho-alvéolaire (LBA) des souris infectées avec une sensibilité élevée. Cette méthodologie peut être effectuée dans un 96 - ou 384 puits de plaque, il faut &lt;volume de 10 ul de matériel d'essai et a le potentiel pour le dépistage simultané de plusieurs agents pathogènes.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Nous décrivons une cellule unique à haut débit essai pour mesurer la cytotoxicité des lymphocytes T lorsqu'ils sont incubés avec les cellules cibles tumorales. Ce procédé utilise une matrice élastomère dense, de puits sous-nanolitres (~ 100.000 puits / matrice) à l'espace confiner les cellules T et les cellules cibles à des rapports définis et est couplée à la microscopie par fluorescence pour surveiller effecteur-cible conjugaison et l'apoptose subséquente.

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Trois essais, y compris l'effet cytopathique (CPE) à base de test, essai dose-réponse et (TOA) test à temps de Addition ont été développés, optimisés, validés et utilisés pour identifier de nouveaux antiviraux contre le virus de la fièvre catarrhale (BTV), ainsi à déterminer le Mécanisme d'action-de-possible (MOA) pour antiviraux nouvellement identifiés.

Les tests pour l&#39;identification de nouveaux antiviraux contre la fièvre catarrhale Virus

Les essais in vitro pour mesurer la réplication du virus a été grandement améliorée par la mise au point de virus à ARN recombinants exprimant la luciférase ou d'autres enzymes capables de bioluminescence. Ici, nous détaillons un pipeline de criblage à haut débit qui combine ces souches recombinantes de la rougeole et les virus de chikungunya à isoler antiviraux à large spectre de bibliothèques chimiques.

Criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de l&#39;ARN virus

Nous décrivons ici la cytotoxicité cellulaire et simples essais d'infectivité rondes qui permettent la sélection rapide et précise des composés de déterminer leur cytotoxicité cellulaire (CC 50) et les valeurs IC50 contre WT et VIH-1 résistant médicament.

Dépistage rapide du VIH de la transcriptase inverse et inhibiteurs de l&#39;intégrase

Ce protocole décrit un test qRT-PCR à haut débit pour l’analyse des signatures d’expression d’IFN de type I et III. Le test discrimine les différences de paires de bases uniques entre les transcrits très similaires de ces gènes. Grâce à l’assemblage par lots et au pipetage robotisé, les tests sont cohérents et reproductibles.

Haut-débit quantitative en temps réel RT-PCR analyse pour déterminer les profils d&#39;expression de types I et III sous-types d&#39;interféron

Découvrez un protocole de criblage à haut débit contre Mycobacterium abscessus utilisant une souche double rapporteur et l'automatisation robotisée. Cette méthode accélère la découverte de nouveaux traitements antibactériens efficaces.

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