Name: Profilage du pH luminal dans des organoïdes gastro-intestinaux tridimensionnels à l’aide de microélectrodes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Découvrez le profilage du pH luminal dans des organoïdes gastriques humains tridimensionnels à l'aide de microélectrodes. Cette méthode permet de caractériser la physiologie intraluminale avec une résolution spatiale supérieure pour étudier l'infection par Helicobacter pylori.

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Les auteurs tiennent à remercier Ellen Lauchnor, Phil Stewart, Ph. D., et Bengisu Kilic pour leurs travaux antérieurs et leur aide avec les microcapteurs O2  ; Andy Sebrell pour sa formation en culture d’organoïdes et en micromanipulation ; Lexi Burcham pour son aide à la culture d’organoïdes, à la préparation des milieux, à l’enregistrement des données et à l’organisation ; et la Dre Susy Kohout pour des conseils généraux en électrophysiologie. Nous tenons à remercier la Dre Heidi Smith pour son aide en matière d’imagerie et à reconnaître le Centre d’ingénierie des biofilms de l’Université d’État du Montana, qui est soutenu par le financement du programme MRI de la National Science Foundation (2018562), du M.J. Murdock Charitable Trust (202016116), du ministère américain de la Défense (77369LSRIP et W911NF1910288), et par le Montana Nanotechnology Facility (un membre du NNCI soutenu par la subvention NSF ECCS-2025391).
Un merci spécial à toute l’équipe d’Unisense qui a rendu ce travail possible, en particulier le Dr Andrew Cerskus, le Dr Laura Woods, le Dr Lars Larsen, le Dr Tage Dalsgaard, le Dr Line Daugaard, le Dr Karen Maegaard et Mette Gammelgaard. Le financement de notre étude a été fourni par les subventions R01 GM13140801 (D.B., R.B.) et UL1 TR002319 (K.N.L.) des National Institutes of Health, ainsi que par une bourse d’expansion de la recherche de l’Office for Research and Economic Development (D.B.) de l’Université d’État du Montana. La figure 1A a été créée avec BioRender.

Ce protocole nécessite des organoïdes 3D d’au moins 200 μm de diamètre qui ont une lumière distincte et qui sont intégrés dans une matrice extracellulaire artificielle (ECM, par exemple, Matrigel). Des tissus gastriques humains pour la dérivation d’organoïdes ont été obtenus avec l’approbation du Conseil d’examen institutionnel de l’Université d’État du Montana et le consentement éclairé de patients subissant une endoscopie supérieure à Bozeman Health (protocole # 2023-48-FCR, à D.B.) ou en tant qu’échantillons exemptés d’estomac entier ou de gastrectomie en manchon du National Disease Research Interchange (protocole #DB062615-EX). Le tableau 1 fournit des renseignements sur les raies organoïdes et les numéros de passage utilisés pour cette étude, et la composition des milieux est indiquée au tableau 2. Se référer aux protocoles précédemment publiés pour la génération et la maintenance des lignées d’organoïdes gastro-intestinaux6, 26, 27.
1. Préparation d’organoïdes gastriques humains pour le profilage du pH
<ol><li>Initier et maintenir des cultures d’organoïdes gastriques en utilisant des protocoles standard. Maintenir les organoïdes sur des plaques de 24 puits dans 500 μL de milieu d’expansion par puits (tableau 2). Passage établissait des lignes organoïdes tous les 5 à 7 jours, puis les transférait dans une boîte à fond de verre de 35 mm en préparation des expériences de profilage du pH. REMARQUE : Les cultures d’organoïdes pour nos expériences sont dérivées de préparations de glandes gastriques, qui sont obtenues à partir de tissus adultes comme décrit ci-dessus. Nous utilisons une méthode de digestion tissulaire de la collagénase pour isoler ces glandes avant qu’elles ne soient en suspension dans la MEC, comme décrit précédemment 25,28,29.</li>
	<li>À partir de cultures d’organoïdes en croissance active dans les passages 1 à 15, choisissez des puits contenant au moins 100 organoïdes (environ 2 millions de cellules) d’un diamètre compris entre 200 et 700 μm pour le transfert et l’expansion sur des boîtes de Pétri de 3,5 mm.</li>
	<li>Pendant la préparation des organoïdes pour le placage (étapes 1.4 à 1.8), laisser décongeler les aliquotes de la matrice extracellulaire (MEC) sur de la glace pendant au moins 45 min. Maintenez l’ECM sur la glace tout au long de ce protocole pour éviter la gélification. Préchauffez les plaques de culture cellulaire en les plaçant dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 .</li>
	<li>Retirez le milieu des puits et récoltez les cultures d’organoïdes gastriques en pipetant du PBS glacé sur chaque gouttelette ECM et en grattant le gel avec la pointe d’une pipette P1000. Pipeter le PBS avec les fragments de MEC contenant des organoïdes dans un tube conique de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugez le tube à 200 × g à 4 °C pendant 5 min. Les fragments ECM contenant les organoïdes seront visibles sous forme de couche au fond du tube. Aspirez soigneusement le surnageant et pipetez 350 μL de trypsine-EDTA à 0,25 % dans chaque tube, en mélangeant doucement en pipetant de haut en bas. Incuber les tubes dans un bain-marie à 37 °C pendant 2 à 5 min.</li>
	<li>Après l’incubation avec de la trypsine-EDTA, ajouter 600 μL de DMEM glacé avec pénicilline/streptomycine dans chaque tube et pipeter vigoureusement de haut en bas au moins 40 fois. Centrifugeuse à 200 × g à 4 °C pendant 5 min. Aspirez le surnageant. Pour mettre en place des cultures pour les mesures de pH, remettez en suspension la pastille cellulaire dans une ECM liquide glacée à un rapport v/v de 1:4 entre la pastille organoïde et l’ECM pour le placage.</li>
	<li>Pour chaque échantillon, disposez une plaque de 40 μL d’ECM liquide contenant des organoïdes/fragments d’organoïdes en une fine ligne horizontale le long du diamètre d’une boîte à fond de verre de 35 mm. REMARQUE : La distribution du gel sur la plaque en ligne au lieu d’une gouttelette ronde permet un accès plus facile aux organoïdes individuels en éclaircissant la culture.</li>
	<li>Laisser le gel polymériser pendant 15 à 30 min ; ensuite, ajoutez soigneusement 2 mL de milieu d’expansion organoïde à la plaque en pipetant le long du bord du puits pour éviter de perturber le gel.</li>
	<li>Remplacez le support tous les deux jours. Attendez 4 à 8 jours pour qu’un minimum de 10 organoïdes atteignent un diamètre minimum de 400 μm.</li>
	<li>Pour procéder à une expérience de profilage du pH, assurez-vous que chaque culture contient au moins 10 organoïdes qui répondent aux critères suivants : > 200 μm de diamètre, apparence saine (peu ou pas de matière sombre visible dans les organoïdes observés au microscope à fond clair) et non surpeuplée par d’autres organoïdes.</li>
</ol>2. Déballage et étalonnage des microélectrodes
REMARQUE : Pour permettre des mesures à l’échelle microscopique, une électrode de référence distincte est utilisée en plus de la microélectrode du capteur de pH plutôt que d’utiliser une conception intégrée (et donc plus volumineuse). La microélectrode de pH et l’électrode de référence doivent être stockées humides. Ne laissez pas l’exposition à l’air pendant plus de 10 minutes à la fois. Déterminez la taille de pointe appropriée pour l’application. Ici, nous avons utilisé une microélectrode de pH potentiométrique avec un diamètre de pointe biseauté de 25 μm.
<ol><li>Avec la microélectrode toujours dans son tube de protection, inspectez visuellement l’embout pour tout dommage.</li>
	<li>Connectez l’électrode de référence au câble de l’électrode de pH via le connecteur. Ensuite, connectez la microélectrode à l’amplificateur et l’amplificateur à un PC mis à la terre avec le logiciel à l’aide d’un câble USB (Figure 1A).</li>
	<li>Remplissez deux tubes coniques 2/3 de 50 mL avec de l’éthanol à 70 % et du H2O désionisé (diH2O). Placez la microélectrode et l’électrode de référence dans le tube diH2O, en veillant à ce que les deux pointes apparaissent immergées d’au moins 1 cm dans le liquide. REMARQUE : De grands béchers peuvent également être utilisés pour cette étape et des étapes similaires.</li>
	<li>Laissez les électrodes s’équilibrer pendant ~10 min. REMARQUE : La procédure peut également être interrompue à cette étape et reprise plus tard car les électrodes peuvent être stockées dans diH2O.</li>
	<li>Pendant que les électrodes s’équilibrent, ouvrez le logiciel (icône rouge) sur le poste de travail. Sous l’onglet Paramètres, assurez-vous que la case à côté de la microélectrode est cochée, indiquant qu’elle est correctement connectée et reconnue par le logiciel. Cliquez sur Démarrer l’expérience en haut à gauche de la fenêtre et entrez le nom de fichier et la destination de votre choix. Dans la fenêtre Paramètres d’étalonnage et d’expérience du capteur , cliquez sur Effacer tous les points pour préparer le logiciel à un nouvel étalonnage.</li>
	<li>Remplissez deux tubes coniques de 50 mL 2/3 avec des tampons d’étalonnage de pH 4,01 et pH 9,21. Séchez doucement la tubulure de protection et l’électrode de référence avec une lingette de laboratoire délicate.</li>
	<li>En commençant par les électrodes dans le tampon de pH 4,01, entrez 4,01 comme valeur de pH connue. Une fois que la lecture mV s’est stabilisée, sélectionnez Ajouter un point. Vérifiez que le signal est stable à ~380 mV. Une fois le point ajouté, remettez les deux électrodes dans diH2O pour rincer, puis séchez à nouveau.</li>
	<li>Répétez l’étape précédente avec la mémoire tampon 9.21 et cliquez sur ajouter un point lorsque le signal est stable (~83 mV). Vérifiez que les microélectrodes répondent linéairement entre pH 4,01 et 9,21 ; Par conséquent, seule une courbe d’étalonnage en deux points est nécessaire. Assurez-vous que la ligne résultante entre ces points a une pente négative de 50-70 mV/unité de pH. Cliquez sur Enregistrer et utiliser l’étalonnage. REMARQUE : Vous êtes maintenant prêt à commencer à enregistrer les mesures30.</li>
</ol>3. Profilage du pH des organoïdes gastriques humains
REMARQUE : Le protocole suivant est décrit pour un utilisateur droitier. ATTENTION : Désactivez toutes les options d’économie d’énergie sur votre PC, car les mesures en cours seront interrompues si le PC passe en mode veille.
<ol><li>Assemblez un support annulaire avec une pince sur le côté gauche d’un stéréomicroscope pour maintenir l’électrode de référence. Placez un micromanipulateur fixé à un lourd support de laboratoire sur le côté droit du microscope (Figure 1A).</li>
	<li>Retirez délicatement la microélectrode de son boîtier de protection en la posant à plat sur le banc et en retirant le boîtier d’un mouvement rapide et rapide. ATTENTION : Les microélectrodes sont incroyablement fragiles et il faut veiller à ce que l’embout n’entre pas en contact avec un matériau rigide et solide. Pour de meilleurs résultats, effectuez les mesures sur une paillasse solide, exempte d’équipement qui pourrait provoquer des vibrations de la paillasse ou un mouvement indésirable des électrodes.</li>
	<li>Montez la microélectrode sur un micromanipulateur et disposez le stéréoscope et le micromanipulateur de manière à ce que la microélectrode puisse avancer vers la boîte de culture sans heurter l’objectif ou d’autres parties du microscope.</li>
	<li>Positionnez la boîte de culture contenant les organoïdes de manière à ce que l’on puisse visualiser adéquatement le premier organoïde à profiler (figure 1B).</li>
	<li>Fixez légèrement l’électrode de référence à la pince du support annulaire à gauche du stéréoscope. Positionnez l’électrode de référence de manière à ce qu’elle repose dans le milieu entourant l’ECM. Veillez à ce qu’il ne perturbe pas les organoïdes lorsque la platine est déplacée entre les mesures.</li>
	<li>En regardant directement la plaque de culture (et non dans le microscope), avancez l’extrémité de la microélectrode jusqu’à ce qu’elle soit suffisamment immergée dans le milieu. Sous l’onglet Enregistreur de données du logiciel, cliquez sur le bouton Démarrer (triangle unique pointant vers la droite) pour commencer l’enregistrement. Assurez-vous que la case Calibré est cochée sur le côté droit de l’écran. REMARQUE : Attendez ~10 s pour que chaque lecture se stabilise avant de passer à la région suivante.</li>
	<li>Avant d’entrer dans l’ECM, assurez-vous que la pointe de l’électrode est visible au microscope et qu’elle est positionnée de manière à avancer linéairement vers le premier organoïde d’intérêt. Avancez lentement l’électrode dans le gel, sans entrer en contact avec des organoïdes. Enregistrez au moins trois lectures de pH et calculez la moyenne.</li>
	<li>Positionnez la microélectrode de manière à ce qu’elle soit prête à avancer vers le premier organoïde d’intérêt le long de l’axe perpendiculaire à la surface. Laissez l’électrode faire une petite indentation sur la surface épithéliale sans pénétrer (Figure 1C). REMARQUE : Cette étape vous permettra également de savoir si l’organoïde restera en place ou s’il pourra se déplacer plus librement dans l’ECM.</li>
	<li>D’un mouvement rapide, faites avancer la microélectrode dans l’organoïde. Si l’organoïde se déplace autour de la microélectrode ou s’éloigne, essayez un angle légèrement différent ou appuyez-le contre un autre organoïde ou le bord en plastique entourant le fond en verre de couverture de la parabole. Mesurez le pH luminal (trois fois individuellement) de 10 organoïdes différents pour chaque condition expérimentale. Lorsque vous avez terminé d’enregistrer les mesures, cliquez sur le bouton carré Arrêter. ATTENTION : Estimez le diamètre de l’organoïde pour décider jusqu’où avancer l’électrode dans la lumière de l’organoïde, en prenant soin de ne pas la percer. Pour une précision accrue, mesurez le diamètre avec le logiciel de l’appareil photo de votre microscope, si disponible. REMARQUE : Si l’extrémité de la microélectrode est visiblement recouverte de débris après une ou plusieurs mesures, lavez la microélectrode dans une solution de dissociation cellulaire, PBS, EtOH, puis diH2O avant de continuer.</li>
</ol>4. Profilage motorisé (en option)
REMARQUE : Cette option nécessite un micromanipulateur monté sur un étage de moteur mécanique, qui est finalement contrôlé par un logiciel informatique via un contrôleur de moteur31.
<ol><li>Ouvrez le logiciel de profilage (icône marron) et démarrez une nouvelle expérience sous l’onglet Profilage .</li>
	<li>Les paramètres de l’axe z reconnaîtront automatiquement le moteur lorsqu’un appareil moteur est correctement connecté. REMARQUE : Le mouvement dans les directions x et y est toujours contrôlé manuellement avec cette configuration.</li>
	<li>Recherchez l’onglet d’interaction Profil30. Avant d’appuyer sur le bouton de démarrage, assurez-vous qu’il est possible de passer rapidement à l’observation de l’oculaire du microscope pour assurer l’entrée de l’organoïde à la distance souhaitée. Accédez aux paramètres du profil et procédez comme suit :<ol><li>Indiquez que la distance de départ est de 0 μm. ATTENTION : Si la coquille épithéliale est particulièrement dure sur un organoïde donné, l’organoïde peut être repoussé ou déformé au lieu d’être pénétré. Si c’est le cas, continuez à avancer l’électrode, mais notez le point d’entrée, car le logiciel ne peut pas l’enregistrer automatiquement.</li>
		<li>Pour juger de la taille de l’organoïde profilé, indiquez une distance finale qui ne dépasse pas les 3/4 du diamètre estimé d’un organoïde. REMARQUE : Cette étape particulière est conçue pour éviter d’endommager la pointe de l’électrode.</li>
		<li>Indiquez la taille de pas souhaitée (100 μm), comme illustré à la figure 2E. Assurez-vous que la taille minimale du pas correspond à la taille de l’embout de l’électrode (p. ex., 25 μm pour un embout d’électrode de 25 μm pH-25).</li>
		<li>Indiquez une position sûre à laquelle le moteur ramènera la pointe de l’électrode entre les profilés. REMARQUE : Il doit s’agir d’une hauteur confortable au-dessus de l’échantillon (à l’extérieur de l’organoïde) où le capteur peut être déplacé en toute sécurité latéralement dans les directions x et y avec le micromanipulateur manuel. Laissez l’angle du capteur à son réglage par défaut.</li>
		<li>Pour permettre à l’électrode de s’équilibrer, indiquez au moins 3 s sous Attendre avant la ou les mesures.</li>
		<li>Définissez la ou les périodes de mesure sur au moins 1 s. La moyenne des mesures sur cette période sera calculée. REMARQUE : Si vous effectuez des mesures dans un environnement à fort bruit électrique, il peut être utile d’indiquer une période plus longue.</li>
		<li>Réglez le délai entre les deux à au moins 1 s.</li>
		<li>Définissez le nombre préféré de répétitions à mesurer à chaque profondeur.</li>
		<li>Commencez à enregistrer les mesures en appuyant sur le bouton Démarrer .</li>
	</ol></li>
</ol>5. Nettoyage des électrodes
<ol><li>Replacez l’électrode à nettoyer dans son tube de protection.</li>
	<li>Rincer les électrodes avec du diH2O après les mesures.</li>
	<li>Rincez les électrodes avec de l’éthanol à 70 % pendant quelques minutes.</li>
	<li>Rincez les électrodes avec un tampon de pH 4,01.</li>
	<li>Rincez à nouveau les électrodes avec du diH2O avant de procéder aux mesures.</li>
</ol>6. Stockage des électrodes
REMARQUE : Les deux électrodes doivent être stockées à température ambiante dans un endroit à faible activité, à l’abri des dommages accidentels.
<ol><li>Après avoir utilisé la microélectrode de pH, glissez-la délicatement horizontalement dans son tube de protection (en glissant le long de la paillasse pour un support horizontal).</li>
	<li>En tenant la microélectrode à la verticale (pointe pointée vers le haut), remplissez doucement le tube de protection avec de l’eau stérile. Branchez le tube de protection avec le bouchon fourni avec l’électrode. Assurez-vous que tous les trous dans le tube de protection sont scellés avec du ruban isolant. Conserver dans une boîte incassable jusqu’à la prochaine utilisation. REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser la boîte d’origine dans laquelle les électrodes sont arrivées car elle contiendra des inserts de protection conçus pour maintenir les électrodes en place lorsqu’elles sont stockées.</li>
	<li>Stockez l’électrode de référence dans un bécher ou un cylindre gradué rempli d’une solution de KCl 3M. Couvrir le bécher/cylindre gradué avec un parafilm pour éviter l’évaporation de la solution. REMARQUE : Si vous utilisez un cylindre gradué, il est recommandé de le fixer à la paillasse de laboratoire avec du ruban adhésif pour éviter tout mouvement accidentel.</li>
</ol>7. Injection de rouge de méthyle (facultatif)
REMARQUE : Le rouge de méthyle est un colorant indicateur colorimétrique qui peut être utilisé pour valider les mesures des microélectrodes.
<ol><li>Remplissez un capillaire en verre de 2 μL avec de l’huile minérale stérile, chargez-le sur un auto-injecteur nL commandé par micromanipulateur, puis remplissez-le d’une solution contenant 0,02 % de rouge de méthyle et 150 mM de HCl. REMARQUE : La solution doit apparaître rouge/rose dans le capillaire en raison de l’acidité du HCl.</li>
	<li>Injecter des organoïdes d’au moins 300 μm de diamètre avec 9,2 μL de la solution25.</li>
	<li>Capturez des images ou des vidéos à l’aide d’une caméra adaptée au stéréomicroscope (Figure 2G).</li>
</ol>

Mesure précise du pH luminal dans des organoïdes gastriques 3D avec des microélectrodes

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

L’accès limité à l’espace luminal des organoïdes a sévèrement limité notre compréhension de la dynamique physiologique de ce microenvironnement. Un outil fiable pour les analyses fonctionnelles de la physiologie luminale élargira notre capacité à exploiter les organoïdes comme modèles in vitro pour la physiologie, la pharmacologie et la recherche sur les maladies. Les organoïdes sont des modèles physiologiquement pertinents qui offrent un potentiel supplémentaire de reproduction de la variabilité génétique au sein de la population humaine. Les méthodes existantes de mesure du pH à l’intérieur de la lumière organoïde ont utilisé des colorants ou des nanoparticules sensibles au pH, méthodes qui doivent souvent être couplées à la microscopie à fluorescence ou à la spectroscopie 16,17,37. La méthode de profilage basée sur des microcapteurs décrite offre une nouvelle voie pour mesurer le pH intraluminal des organoïdes gastro-intestinaux avec une nouvelle précision spatiale. Notre méthode démontre une mesure cohérente et fiable du pH luminal des organoïdes gastro-intestinaux, ainsi que la preuve d’un gradient de pH. Dans des expériences non publiées, nous avons confirmé l’expression des gènes de la famille SLC4A2 et 26A7, qui sont connus pour être responsables de la sécrétion de bicarbonate, ainsi que des gènes SLC9A3, 9A4 et 9A8 qui sont responsables de l’échange de protons (Figure supplémentaire S1)38,39,40,41. Nos études suggèrent une prédominance de la sécrétion de bicarbonate et un manque de cellules pariétales dans nos organoïdes, ce qui pourrait expliquer l’alcalinité.
Il est important de s’assurer que les microélectrodes utilisées sont bien adaptées au microprofilage organoïde, ce qui inclut le choix du bon diamètre de pointe. Nous avons essayé des pointes de 25 μm et de 50 μm et avons obtenu des résultats similaires (Figure 2A), mais nous avons décidé d’aller de l’avant avec la plus petite taille de pointe selon les conseils du fabricant, car on s’attendait à ce qu’elle soit moins invasive et qu’elle offre une résolution spatiale plus élevée, car les mesures sont moyennées sur la zone de la pointe biseautée. Cependant, les pointes plus petites sont plus fragiles. La taille de l’organoïde doit être prise en compte pour déterminer la résolution spatiale souhaitée.
Une étape critique du protocole consistait à s’assurer de la capacité à distinguer le pH intraluminal des organoïdes du pH dans l’ECM et, par la suite, dans le milieu de culture environnant. On s’attendrait à une quantité raisonnable de flux de métabolites dans et hors des organoïdes42. Nous nous attendons à ce que le pH d’un organoïde soit influencé par son environnement et avons constaté que les organoïdes étaient constamment moins alcalins que leur environnement dans six expériences indépendantes (Figure 2D). De plus, la stabilité est tout aussi importante lors du profilage que lors de l’étalonnage des capteurs.
On s’attend à ce que les organoïdes dérivés de tissus présentent un certain degré de variabilité d’un donneur à l’autre, il est donc essentiel de profiler toute lignée d’organoïdes au départ avant d’appliquer toute intervention expérimentale telle qu’un traitement médicamenteux43. Nous émettons l’hypothèse que les fluctuations du pH au sein d’une culture d’organoïdes peuvent être dues à des gradients d’ions locaux à l’échelle microscopique et à la distribution hétérogène du mucus luminal déterminée par immunofluorescence et coloration immunohistochimique (données non publiées). Les variations de pH observées entre les lignes et les passages d’organoïdes individuels peuvent être dues à des différences individuelles dans la composition cellulaire et l’activité sécrétoire des organoïdes. Nous avons également constaté que certaines raies organoïdes étaient intrinsèquement plus difficiles à pénétrer que d’autres. De même, certains peuvent perdre leur intégrité structurelle et s’effondrer lors de l’entrée de l’électrode (figure supplémentaire S2 et vidéo supplémentaire S1). Cela ne semble pas être associé au passage des organoïdes, mais a été observé le plus souvent dans les organoïdes de plus de ~1,5 mm de diamètre. Dans une étude précédente, nous avons montré que le mucus à l’intérieur des organoïdes était distribué de manière hétérogène29. En raison de cette hétérogénéité, il devient difficile de déterminer si (ou dans quelle mesure) la distribution du mucus a eu un impact sur une mesure.
Les microcapteurs sont des outils peu invasifs qui permettent de profiler la physiologie intraluminale des organoïdes à grande vitesse et à haute résolution spatiale. De plus, ces capteurs ne perturbent pas les gradients chimiques et sont peu sensibles aux turbulences dans le microenvironnement d’intérêt. La petite conception est rendue possible par la séparation de l’électrode du capteur de l’électrode de référence. Les sondes de pH standard du laboratoire combinent ces deux électrodes, ce qui permet d’obtenir une taille plus grande. Des nanocapteurs optiques de pH et d’O2 pour les mesures intracellulaires ont été développés par le groupe Cash de la Colorado School of Mines et ont réussi à mesurer les métabolites dans des modèles de souris et de biofilms. Cependant, en raison de l’hétérogénéité de la lumière organoïde, de tels capteurs peuvent conduire à des résultats ininterprétables17. McCracken et al. ont analysé le pH luminal dans des organoïdes gastriques dérivés de cellules souches embryonnaires en injectant SNARF-5F et en visualisant le colorant sensible au pH avec la microscopie confocale en temps réel37. Notamment, les mesures rapportées par McCracken étaient très similaires aux valeurs de pH obtenues dans notre étude actuelle (figures 2B et C). Notre technique pourrait peut-être être appliquée dans une architecture monocouche, avec une configuration plus verticale comme dans le profilage de biofilm, bien que cela puisse présenter un risque d’endommager les électrodes44. Les études futures pourraient également impliquer des mesures séquentielles du pH sur plusieurs jours pour évaluer les changements associés au développement cellulaire. Étant donné que les organoïdes de taille moyenne se rétablissent et guérissent généralement après avoir sondé, un organoïde pourrait théoriquement être sondé plusieurs fois tant que la stérilité des cultures peut être maintenue. Alors que nous affinons notre compréhension de la dynamique du pH dans les modèles organoïdes, la résolution spatiale doit être une priorité pour la cartographie précise du microenvironnement 3D complexe et historiquement inaccessible à l’intérieur.
En résumé, ce protocole fournit une méthode détaillée pour des mesures précises du pH avec une haute résolution spatio-temporelle à l’aide de microélectrodes de pH montées sur un micromanipulateur et un stéréomicroscope. Cette méthode a été validée avec des organoïdes dérivés de cellules souches humaines adultes et convient aux organoïdes épithéliaux d’au moins 200 μm de diamètre qui ont une lumière distincte. Nous prévoyons qu’en sélectionnant des microélectrodes alternatives, cette méthode pourra être facilement adaptée à d’autres types d’organoïdes et à la mesure de composés alternatifs, tels que le NO ou l’O2.

Les organoïdes, c’est-à-dire des structures multicellulaires miniatures dérivées de cellules souches, ont révolutionné notre capacité à étudier la physiologie humaine et commencent à remplacer les modèles animaux, même dans les contextes réglementaires1. Depuis la description initiale des organoïdes intestinaux par Sato et al. en 2009, la technologie des organoïdes est devenue immensément populaire2. Un grand nombre d’études ont caractérisé en détail la composition cellulaire et la fonction de modèles d’organoïdes 3,4,5,6. Cependant, l’espace luminal de ces structures multicellulaires 3D reste largement indéfini 7,8. La lumière est la cavité centrale des organoïdes dérivés des tissus muqueux qui est entourée par les parties apicales des cellules épithéliales polarisées. Étant donné que la sécrétion et l’absorption cellulaires se produisent principalement à la surface de l’épithélium apical, le microenvironnement luminal des organoïdes est contrôlé par ces processus physiologiques importants. Les modèles organoïdes actuellement utilisés montrent des variations dans les modèles de signalisation cellulaire, la souche globale, les gradients de concentration de métabolites et les conditions environnementales9. La compréhension de la physiologie luminale des organoïdes est donc nécessaire pour la modélisation précise de la fonction et de la pathologie des organes. Malheureusement, la relative inaccessibilité de la lumière entrave considérablement les analyses fonctionnelles de la physiologie luminale dans les organoïdes 3D10.
La capacité d’examiner les profils de pH est particulièrement importante dans l’estomac, qui est connu pour avoir le gradient de protons le plus raide dans le corps, allant d’environ 1-3 dans la lumière, à presque neutre à l’épithélium 11,12,13. Il reste une lacune importante dans notre compréhension du maintien à l’échelle microscopique du gradient de pH gastrique et de la pertinence des modèles organoïdes pour récapituler ce milieu dynamique à travers la couche de mucus gastrique. Les approches traditionnelles pour l’analyse du pH des organoïdes impliquent l’utilisation de colorants sensibles au pH, qui peuvent être des indicateurs fluorescents ou colorimétriques. McCracken et al. ont utilisé une injection luminale de SNARF-5F-un indicateur de pH ratiométrique dans des organoïdes pour analyser une baisse du pH luminal en réponse à un traitement à l’histamine. De tels colorants peuvent être incorporés dans le milieu de culture, ce qui permet une surveillance non invasive du pH en temps réel. Non seulement les colorants sensibles au pH nécessitent des étapes d’étalonnage complexes qui contribuent à une fiabilité et une précision médiocres des mesures, mais ces colorants ont également tendance à fonctionner dans des plages de détection spécifiques qui peuvent ne pas être représentatives de l’ensemble de la gamme de pH dans le microenvironnement d’intérêt14,15. Il pourrait toutefois être considéré comme raisonnable d’utiliser des colorants indicateurs pour des expériences de confirmation. Des nanocapteurs optiques utilisant des approches de détection du pH basées sur l’optode fluorescent ont également été développés ; Cependant, ces techniques de détection nécessitent une imagerie microscopique et sont également sensibles au photoblanchiment, à la phototoxicité, ainsi qu’au biais d’imagerie16,17. De plus, Brooks et al. ont des plaques multipuits imprimées en 3D contenant des microélectrodes sur lesquelles les organoïdes peuvent être plaqués18. Cependant, cette approche ne permet pas d’effectuer des mesures directement à l’intérieur de la lumière organoïde.
Les mesures du pH à l’aide d’électrodes peuvent atteindre une meilleure précision par rapport à d’autres méthodes, ainsi que fournir une surveillance du pH en temps réel. De plus, les électrodes de pH montées sur des micromanipulateurs permettent une résolution spatiale supérieure des mesures de pH, car l’emplacement précis de la pointe de l’électrode peut être contrôlé avec précision. Cela permet une flexibilité et une reproductibilité maximales dans les analyses de modèles d’organoïdes. Les électrodes utilisées ici sont des microélectrodes de pH miniaturisées qui fonctionnent sur la base de la diffusion de protons à travers du verre de pH sélectif qui entoure un mince fil de platine. La microélectrode est connectée à une électrode de référence Ag-AgCl externe, puis connectée à un millivoltmètre à haute impédance. Le potentiel électrique entre les deux pointes d’électrode lorsqu’elles sont immergées dans la même solution reflétera le pH de la solution19. De tels systèmes de microprofilage ont été utilisés dans l’analyse métabolique de biofilms20,21, d’algues planctoniques22, d’échantillons d’expectorations humaines23 et même de sphéroïdes de cellules souches mésenchymateuses24. Notre laboratoire et Murphy et al. ont déjà utilisé des microélectrodes O2 contrôlées par des micromanipulateurs pour évaluer les concentrations d’oxygène dans les espaces luminaux des organoïdes. Murphy et al. ont associé cette méthode à une modélisation mathématique pour révéler un gradient d’oxygène dans leurs sphéroïdes. Notre groupe a pu trouver des niveaux d’oxygène luminal réduits dans les organoïdes gastriques dérivés des tissus par rapport à la matrice extracellulaireenvironnante 25.
Ici, nous fournissons une méthode détaillée pour le profilage manuel des microélectrodes du pH luminal dans les organoïdes sphériques du tractus gastro-intestinal qui permettra une meilleure compréhension physiologique de leur microenvironnement luminal complexe. Nous prévoyons que cette technique ajoutera une nouvelle dimension à l’exploration de la physiologie des organoïdes grâce à des mesures en temps réel et à haute résolution des niveaux de pH à l’échelle microscopique. De plus, le protocole suivant pourrait être facilement adapté pour l’analyse de O2, N2O, H2, NO, H2S, redox et de la température dans divers types de modèles d’organoïdes. Le profilage physiologique est un outil précieux pour optimiser les conditions de culture d’organoïdes afin de mieux imiter les environnements in vivo , renforçant ainsi la pertinence et l’utilité des modèles d’organoïdes dans la recherche biomédicale.

<table><tbody><tr><td>3 M KCl</td><td>Unisense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipette sérologique Wobble-not, emballée individuellement, papier/plastique, sac, stérile</td><td>CellTreat</td><td>229091B</td><td></td></tr><tr><td>10 mL pipette sérologique Wobble-not, emballée individuellement, papier/plastique, sac,</td> stérile <td>CellTreat</td><td>229092B</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger de 15 mL - support à mousse,</td><td>CellTreat</td><td>229412</td><td></td></tr> <tr><td>stérilePlaque de culture tissulaire à 24 puits, CellTreat</td><td></td><td>stérile 229124</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pipette sérologique Wobble-not, emballée individuellement, papier/plastique, sac,</td><td>CellTreat</td><td>229093B</td><td></td>stérile</tr><tr><td>Boîte de 35 mm | N° 1.5 Recouvrement | Diamètre du verre de 20 mm | Tube</td> à centrifuger <td>non enduit MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>50 mL - Rack à mousse,</td><td>CellTreat</td><td>stérile 229422</td><td></td></tr><tr><td>70 % d’éthanol</td><td></td><td>BP82031GAL BP82031GAL</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu ; m Passoire à cellules, emballée individuellement, stérile</td><td>CellTreat</td><td>229483&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>1 000 et micro ; L Pointes de pipette à faible rétention allongées, en rack, stériles</td><td>CellTreat</td><td>229037</td><td></td></tr><tr><td>solution d’amphotéricine B (Fungizone)</td><td>HyClone Laboratories, Inc</td><td>SV30078.01</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>Nuaire&nbsp ;</td><td>NU-425-600</td><td>Classe II Type A/B3</td></tr><tr><td>Albumine sérique</td><td>bovine Bioréactifs Fisher</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td>Solution de récupération cellulaire</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>Solution de dissociation cellulaire</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 (DMEM avancé)</td><td>Gibco</td><td>12-491-015</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modification of Eagles Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15017CV</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>HyClone Laboratories, Inc</td><td>SH30088</td><td></td></tr><tr><td>G418 Sulfate</td><td>Corning</td><td>30-234-CR</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de gentamycine</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Free Acid</td><td>Cytiva</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>HP Pavillion 2-en-1 14" Laptop Intel Core i3</td><td>HP</td><td>M03840-001</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144C-212</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Fisher Scientific</td><td>11676604</td><td></td></tr><tr><td>iPhone 12 appareil photo</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Cytiva</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1 pli</td><td>Fisher Scientific</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>M 205 FA Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Membrane Matrix 354234</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>MC-1 UniMotor Controller Unisense</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methyl red</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MM33 Micromanipulateur</td><td>Marzhauser Wetzlar</td><td>61-42-113-0000</td><td>Droitier</td></tr><tr><td>MS-15 Platine motorisée</td><td>Unisense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoject-II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>nanolitre auto-injecteur</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15-140-148</td><td></td></tr><tr><td>Microélectrodes de pH</td><td>Unisense</td><td>50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160</td><td>Le logiciel SensorTrace n’est pas compatible avec les ordinateurs Apple</td></tr><tr><td>Référence Electrode</td><td>Unisense</td><td>REF-RM-001652</td> Le <td>logiciel SensorTrace n’est pas compatible avec Ordinateurs Apple</td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>16-141-0</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur d’appareil photo pour smartphone</td><td>Gosky</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spécifications Support de laboratoire LS</td><td>Unisense</td><td>LS-009238</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,025 %, rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>UniAmp Unisense</td><td></td><td>11632</td><td></td></tr><tr><td>United Biosystems Inc&nbsp ; MINI RACLEURS CELLULAIRES 200/PK</td><td>Fisher</td><td>MCS-200</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorhydrate</td><td>Tocris Bioscience</td><td>12-541-0</td><td></td></tr><tr><td>&micro ; Kit d’étalonnage de sonde</td><td>Unisense/ Mettler Toledo</td><td>51-305-070, 51-302-069</td><td>pH 4,01 et 9,21, sachets de 20 mL</td></tr></tbody></table>

profilage du ph luminal dans des organoïdes gastro-intestinaux tridimensionnels à l’aide de microélectrodes

Profiling Luminal pH in Three-Dimensional Gastrointestinal Organoids Using Microelectrodes

L’optimisation et la caractérisation détaillée des modèles d’organoïdes gastro-intestinaux nécessitent des méthodes avancées d’analyse de leurs environnements luminaux. Cet article présente une méthode hautement reproductible pour la mesure précise du pH dans la lumière d’organoïdes gastriques humains 3D via des microélectrodes contrôlées par micromanipulateur. Les microélectrodes de pH sont disponibles dans le commerce et se composent d’embouts en verre biseautés de 25 m de diamètre. Pour les mesures, la microélectrode de pH est avancée dans la lumière d’un organoïde (>200 μm) qui est suspendu dans Matrigel, tandis qu’une électrode de référence repose immergée dans le milieu environnant dans la plaque de culture. 
En utilisant de telles microélectrodes pour profiler les organoïdes dérivés du corps gastrique humain, nous démontrons que le pH luminal est relativement constant dans chaque puits de culture à ~7,7 ± 0,037 et que des mesures continues peuvent être obtenues pendant un minimum de 15 min. Dans certains organoïdes plus grands, les mesures ont révélé un gradient de pH entre la surface épithéliale et la lumière, ce qui suggère que les mesures de pH dans les organoïdes peuvent être réalisées avec une haute résolution spatiale. Dans une étude précédente, des microélectrodes ont été utilisées avec succès pour mesurer les concentrations d’oxygène luminal dans les organoïdes, démontrant la polyvalence de cette méthode pour l’analyse des organoïdes. En résumé, ce protocole décrit un outil important pour la caractérisation fonctionnelle de l’espace luminal complexe au sein des organoïdes 3D.

La sécrétion d’acide est une fonction cruciale de l’estomac humain. Cependant, la question de savoir dans quelle mesure la sécrétion d’acide peut être modélisée dans les organoïdes est encore un sujet de débat 6,32,33,34. Nous avons donc développé le protocole détaillé ci-dessus pour mesurer avec précision la production d’acide dans les organoïdes gastriques. Notamment, nous avons utilisé des organoïdes dérivés de cellules souches adultes non stimulés cultivés dans des conditions d’expansion standard qui avaient été passés plusieurs fois, ce qui a conduit à la perte de cellules pariétales35. Par conséquent, la présence de cellules pariétales sécrétant de l’acide et la libération active d’acide n’étaient pas attendues dans notre système modèle.
Pour nos expériences, nous avons utilisé des organoïdes d’un diamètre compris entre 200 et 1 000 m ensemencés sur des plats à fond de verre. Tout d’abord, nous avons testé deux tailles de pointe différentes pour les microélectrodes : une pH-25 avec un diamètre de pointe de 25 μm et une pH-50 avec un diamètre de pointe de 50 μm. Comme le montre la figure 2A, il n’y avait pas de différence significative entre les mesures obtenues avec les pointes plus petites et celles obtenues avec les pointes plus grandes. Il est intéressant de noter que le pH de base dans les organoïdes avait tendance à être légèrement alcalin à ~ pH 8. À l’aide de l’embout pH-25 de 25 μm, nous avons ensuite évalué la variation du pH luminal au sein de dix organoïdes différents maintenus sur la même plaque de culture, avec trois mesures obtenues à partir de chaque organoïde (Figure 2B). À l’intérieur d’une plaque, le pH luminal des organoïdes individuels n’a montré que de légères variations non significatives (8,16 ± 0,12 ; p ≥0,0445-0,99) (Figure 2B). Nous avons également comparé les mesures de pH intraluminal dans cinq raies organoïdes différentes avec des passages allant de 3 à 16 (Figure 2C). Encore une fois, nous avons trouvé des mesures de pH cohérentes dans chaque culture, mais une variabilité significative entre les lignées d’organoïdes. Cependant, le pH luminal est généralement resté entre pH 7,3 et pH 8,2, à un ordre de grandeur près, et il n’y avait pas de tendance apparente pour le pH moyen lorsque l’on compare les nombres de passages précoces et tardifs (figure 2C). Nous avons ensuite demandé si le pH de la lumière organoïde était directement lié au pH du milieu d’expansion organoïde et de la matrice extracellulaire (MEC). La comparaison entre les milieux, la MEC entourant les organoïdes et la lumière des organoïdes a révélé des différences significatives de pH, le pH luminal des organoïdes étant inférieur à celui de la MEC et le pH de la MEC inférieur à celui des milieux d’expansion des organoïdes environnants (figure 2D), ce qui suggère que le pH luminal des organoïdes était pertinent sur le plan physiologique plutôt que directement déterminé par l’environnement de culture. Dans le cadre de six expériences indépendantes, nous avons mesuré un pH luminal moyen proche de la neutralité à 7,13 ± 0,09.
Un micromanipulateur motorisé a été utilisé pour obtenir des mesures de pH de la lumière organoïde avec une plus grande résolution spatiale. Cette approche est pertinente si le pH ou d’autres gradients dans la lumière organoïde29 remplie de mucus doivent être enregistrés. La figure 2E montre deux séries représentatives de mesures de pH dans de grands organoïdes (&gt;1 000 μm de diamètre), démontrant le point d’entrée dans chaque organoïde et se terminant à une profondeur de ~800 μm. Comme les deux organoïdes profilés n’avaient pas le même diamètre, les mesures ne sont pas immédiatement comparables. Quoi qu’il en soit, nous montrons des preuves d’un léger gradient de pH de Δ0,6 entre la surface épithéliale et la lumière organoïde plus profonde (Figure 2E). Pour déterminer la faisabilité d’effectuer des mesures de pH dans les organoïdes au fil du temps, ce qui permettrait de mesurer les réponses au traitement en temps réel, nous avons enregistré le pH intraluminal à l’intérieur d’un organoïde représentatif pendant environ 20 minutes et avons constaté que la lecture restait très cohérente après une période d’adaptation initiale (Figure 2F). Pour valider les mesures du pH luminal avec une méthode indépendante, nous avons utilisé un colorant colorimétrique sensible au pH (rouge de méthyle) que nous avons injecté dans la lumière organoïde à l’aide d’un auto-injecteur de nanolitres monté sur micromanipulateur (Figure 2G). La coloration jaune du colorant a confirmé que la lumière organoïde avait un pH &gt;6,2, ce qui correspond aux mesures des microélectrodes qui ont montré un pH presque neutre. Dans l’ensemble, ces résultats représentatifs illustrent la faisabilité et la reproductibilité des mesures de pH basées sur des microélectrodes dans des cultures d’organoïdes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66900/66900fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble de la méthode. (A) Schéma de principe de la configuration du profilage. La microélectrode de la figure 1A a été tirée du site Web d’Unisense. 36 (B) Image représentative de la culture d’organoïdes prête à être profilée, de la MEC environnante et des milieux environnants (barre d’échelle = 5 mm). (C) Exemple de positionnement correct des microélectrodes en préparation du palpage organoïde (barre d’échelle = 500 μm). Abréviation : ECM = matrice extracellulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/66900fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66900/66900fig02.jpg"> Figure 2 : Validation du profilage des microcapteurs dans les organoïdes gastriques humains. (A) Comparaison des mesures de pH à lumière moyenne à l’aide d’embouts de microélectrodes de 25 μm (pH-25) et 50 μm (pH-50). Données provenant de 10 organoïdes individuels, chacun provenant d’une seule expérience représentative. (B) Trois mesures répétées du pH ont été obtenues pour 10 organoïdes individuels. ANOVA à un facteur avec comparaisons multiples (p = 0,1229). (C) les mesures de pH obtenues avec une électrode de pH-25 sont cohérentes dans chacune des cinq raies organoïdes analysées à différents nombres de passage ; 4 à 10 organoïdes mesurés par ligne en fonction de la taille et de la disponibilité. ANOVA à un facteur avec comparaisons multiples (p &lt; 0,0001). (D) Mesures du pH dans les organoïdes gastriques et le Matrigel et les milieux environnants (n = 6 expériences indépendantes). Mesures obtenues par des organoïdes épithéliales gastriques pénétrants avec un pH-25. Chaque point de données est la moyenne de 10 mesures de pH individuelles au sein d’un seul organoïde. ANOVA à un facteur (p &lt; 0,0001). (E) Profils de pH épithélial-lumière de deux organoïdes représentatifs à l’aide d’un micromanipulateur motorisé. (F) Stabilité du pH dans le temps (~19,8 min) dans un organoïde représentatif. (G) Micro-injection de colorant indicateur de pH rouge de méthyle et de HCl dans la lumière organoïde gastrique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/66900fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">Donneur</td>
		</tr><tr><td>Figure</td>
			<td>Ligne</td>
			<td>Passage</td>
			<td>Sexe</td>
			<td>Âge</td>
			<td>Ethnicité</td>
		</tr><tr><td>2A</td>
			<td>35</td>
			<td>6</td>
			<td>F</td>
			<td>40</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2B</td>
			<td>7</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>4</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>F</td>
			<td>45</td>
			<td>C</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>34</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>44</td>
			<td>Inconnu</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>35</td>
			<td>6</td>
			<td>F</td>
			<td>40</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2C</td>
			<td>7</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2D</td>
			<td>36</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">Inconnu</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>37</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">Inconnu</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>31</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>45</td>
			<td>H</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>9</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>4</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2E</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>43</td>
			<td>Inconnu</td>
		</tr><tr><td>2e étage</td>
			<td>34</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>33</td>
			<td>C</td>
		</tr><tr><td>2G</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Milieu d’expansion organoïde gastrique humain (L-WRN)</td>
		</tr><tr><td>Fluide conditionné L-WRN</td>
			<td>50%</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F12 avancé</td>
			<td>37%</td>
		</tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td>
			<td>1%</td>
		</tr><tr><td>L-glutamine</td>
			<td>1%</td>
		</tr><tr><td>La gentamycine</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr><tr><td>Amphotéricine B</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr><tr><td>Tampon HEPES</td>
			<td>0.40%</td>
		</tr><tr><td>Y-27632</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr><tr><td>Réf. SB-431542</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2.
Figure supplémentaire S1 : Expression du transporteur d’ions dans les organoïdes gastriques humains. Nombre de copies relatif normalisé à l’ARNr 18S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240425%20Supplemental%20Figure%201%20Revised.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S2 : Organoïde gastrique humain à architecture déformée après ponction avec la sonde du microcapteur de pH. Barre d’échelle = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240229%20Supplemental%20Figure%202.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Vidéo supplémentaire S1 : Tentative infructueuse de profilage dans une culture d’organoïdes gastriques. La microélectrode de pH de 25 μm est avancée manuellement vers l’organoïde d’intérêt. Après une tentative ratée en raison d’une erreur d’évaluation de l’angle, un angle différent est tenté et il est révélé que l’organoïde n’a pas l’intégrité structurelle pour être profilé (la structure sphérique n’est pas solide et se déforme lors de la pénétration avec l’électrode). L’utilisateur est ensuite redirigé pour tenter un autre organoïde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240229%20Supplemental%20Video%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Le présent protocole décrit les mesures du pH dans les organoïdes gastriques dérivés de tissus humains à l’aide de microélectrodes pour la caractérisation spatio-temporelle de la physiologie intraluminale.

Profilage du pH luminal dans des organoïdes gastro-intestinaux tridimensionnels à l’aide de microélectrodes

The optimization and detailed characterization of gastrointestinal organoid models require advanced methods for analyzing their luminal environments. This ...

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Des cellules en croissance dans un (3-D) environnement tridimensionnel représentent une amélioration marquée par rapport à la culture des cellules dans des environnements 2-D (par exemple, des flacons ou des boîtes). Nous décrivons ici le développement d'un modèle organotypique 3-D multicellulaire de la muqueuse intestinale humaine en culture en microgravité fournies par rotation paroi vasculaire (RWV) bioréacteurs.

Développement d&#39;un modèle organotypique multicellulaire en trois dimensions de la muqueuse intestinale humaine Grown Sous microgravité

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Profilage du pH luminal dans des organoïdes gastro-intestinaux tridimensionnels à l’aide de microélectrodes

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