Préparation de suspension unicellulaire de cellules épithéliales thymiques de souris et coloration de molécules intracellulaires pour l’analyse cytométrique en flux
26 juillet 2024
Nous décrivons des protocoles pour la préparation de la suspension unicellulaire de cellules épithéliales thymiques de souris et la coloration de molécules intracellulaires pour l’analyse cytométrique en flux.
Les lymphocytes T sont des cellules immunitaires qui protègent notre corps contre les maladies infectieuses et le cancer. Le thymus est un organe qui produit des lymphocytes T et sélectionne les lymphocytes T en développement en fonction des composants du corps. Nous nous intéressons à la façon dont le thymus produit et sélectionne les lymphocytes T qui sont protecteurs pour notre corps et pourtant tolérants pour le corps.
Notre laboratoire a contribué à l’analyse des cellules épithéliales thymiques, qui jouent un rôle clé dans la production et la sélection des cellules T dans le thymus. L’analyse au niveau de la cellule unique des cellules épithéliales thymiques nous a aidés à mieux comprendre le mécanisme moléculaire du développement et de la sélection des cellules T. Les cellules épithéliales thymiques sont très diversifiées avec des structures complexes, ce qui rend leur isolement difficile.
La technologie actuelle pour isoler les suspensions à cellule unique est limitée et doit être améliorée. Malgré cela, l’isolement unicellulaire des cellules épithéliales thymiques améliore notre compréhension de la machinerie moléculaire impliquée dans leur développement et leur fonction. Nous espérons que notre étude contribuera à la compréhension de la génération et de la régénération des cellules immunitaires.
Nous croyons qu’il servira de pierre angulaire importante pour faire progresser la santé humaine. Après avoir récolté le thymus de la souris, placez-le dans cinq millilitres de RPMI 1640 contenant 10 millimolaires HEPES dans un plat en plastique de 60 millimètres sur glace. Sous un microscope à dissection, utilisez une pince à épiler incurvée à pointe fine pour enlever le sang, le non-thymus et les tissus adipeux.
Coupez le thymus en petits morceaux avec des ciseaux à disséquer. Transférez les morceaux de thymus dans un tube de 15 millilitres contenant trois millilitres d’un milligramme par millilitre de collagénase et de dispase, et une unité par millilitre de DNase dans RPMI 1640 contenant 2 % FBS. Incuber le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Mélangez ensuite la suspension à l’aide d’une pipette de transfert en plastique de trois millilitres et poursuivez l’incubation pendant environ 30 minutes ou jusqu’à ce que les fragments de tissu ne soient plus visibles. Ajouter cinq millilitres d’EDTA à cinq millimolaires dans un HBSS contenant 1 % de FBS. Filtrez la suspension cellulaire à travers une maille en nylon de 60 microns dans un nouveau tube de 50 millilitres.
Centrifugez la suspension à 350 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de tampon FACS. Rangez les cellules sur de la glace et déterminez les numéros de cellule à l’aide d’un compteur de cellules. Après avoir récolté le thymus d’une souris nouveau-née, utilisez une pince à épiler incurvée à pointe fine pour enlever le sang, le non-thymus et les tissus adipeux.
Transférez le thymus dans un tube de 1,5 millilitre contenant 0,2 millilitre de RPMI 1640 contenant 10 millimolaires HEPES. À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, jeter le milieu, puis ajouter 0,5 millilitre de 0,5 milligramme par millilitre de collagénase et de dispase et une unité par millilitre de Dnase dans RPMI 1640 contenant 2 % FBS. Incuber le tube dans un bloc de chaleur à 37 degrés Celsius.
Pendant l’incubation, mélanger délicatement à l’aide d’une pipette d’un millilitre. Après 10 minutes, ajoutez 0,5 millilitre d’EDTA à cinq millimolaires dans HBSS contenant 1 % FBS. Filtrez la suspension cellulaire à travers un maillage en nylon de 60 microns dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.
Ajoutez neuf millilitres de RPMI 1640 contenant 10 millimolaires HEPES dans le tube. Centrifugez la suspension cellulaire à 350 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis remettez la pastille en suspension dans un à trois millilitres de tampon FACS. Rangez les cellules sur de la glace et déterminez les numéros de cellule à l’aide d’un compteur de cellules.
Pour commencer, ajoutez 16 fois 10 à la puissance 6 cellules de thymus de souris néonatales ou postnatales dans un tube à fond rond en polystyrène de cinq millilitres. Centrifugez la suspension cellulaire à 350 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 microlitres de concentration de travail d’anticorps monoclonal anti-récepteur FC dans le tampon FACS.
Incuber le tube à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajoutez 40 microlitres chacun d’anticorps monoclonal anti-CD45, d’anticorps monoclonal anti-EpCAM, d’anticorps monoclonal anti-Ly-51 et d’UEA-1 dans le tampon FACS. Mélangez le contenu d’un tube et incubez à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes.
Après l’incubation, ajoutez deux millilitres de tampon FACS. Centrifugez la suspension cellulaire à 350 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis remettez la pastille en suspension dans un microlitre de solution de Ghost Dye violet 510. Mélangez le contenu d’un tube et incubez à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.
Ajoutez maintenant deux millilitres de tampon FACS et centrifugez la suspension cellulaire avant de fixer les cellules avec un millilitre d’aldéhyde paraforme à 2 % pendant 10 minutes à température ambiante. Ajoutez 3,5 millilitres de PBS dans le tube. Centrifugez la suspension cellulaire à 700 G pendant huit minutes à quatre degrés Celsius et perméabilisez les cellules avec un millilitre de fixation intracellulaire et de tampon de perméabilisation.
Mélangez le contenu d’un tube et incubez à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Après l’incubation, centrifugez la suspension cellulaire et ajoutez un millilitre de tampon de perméabilisation. Encore une fois, centrifugez la suspension, avant d’ajouter 100 microlitres de concentrations de travail d’anticorps anti-bêta5t ou d’anticorps anti-CCL21.
Incuber pendant 60 minutes à température ambiante. Ajoutez un millilitre de tampon de perméabilisation et centrifugez la suspension cellulaire à 700 G pendant huit minutes à quatre degrés Celsius. Ajoutez maintenant 100 microlitres de concentrations de travail d’IgG anti-lapin et incubez pendant 30 minutes à température ambiante.
Après avoir ajouté un tampon de perméabilisation, centrifugez la suspension cellulaire. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de tampon FACS et mélangez bien. Filtrer la suspension cellulaire à travers un treillis en nylon de 60 microns avant l’analyse cytométrique en flux.
Les profils cytométriques en flux des cellules de thymus digérées par la collagénase et la dispase de souris âgées de zéro jour et de souris âgées de deux semaines ont démontré que plus de 90 % des signaux particulaires représentaient des cellules viables. Les signaux fluorescents des cellules viables ont été représentés par CD45 et EpCAM. Au cours des stades néonatals, les cTECs étaient plus fréquents que les mTEC, mais après la naissance, les mTECs dominaient en raison de la faible efficacité de libération des cTEC.
La fixation et la perméabilisation des cellules permettent la détection de molécules intracellulaires au sein des TEC. L’expression de Beta5t a été détectée dans la majorité des cTEC, mais pas dans les mTEC. CCL21 a été détecté dans une fraction des mTEC, mais pas dans les cTEC.
En comparaison, l’air était exprimé dans une sous-population de mTEC.
Aperçu
Cet article décrit les protocoles permettant de préparer des suspensions de cellules épithéliales thymiques murines en simple cellule et leur analyse ultérieure par cytométrie en flux. La compréhension de ces cellules est essentielle pour obtenir des informations sur le développement et la sélection des lymphocytes T.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Biologie cellulaire
- Cytométrie en flux
Contexte
- Les lymphocytes T sont des cellules immunitaires essentielles qui protègent contre les maladies.
- Le thymus est responsable de la production et de la sélection des lymphocytes T.
- Les cellules épithéliales thymiques jouent un rôle clé dans le développement des lymphocytes T.
- L'analyse à l'échelle de la cellule unique aide à comprendre les mécanismes de sélection des lymphocytes T.
Objectif de l'étude
- Analyser les cellules épithéliales thymiques au niveau monocellulaire.
- Comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement des lymphocytes T.
- Améliorer les techniques d'isolement des différentes cellules épithéliales thymiques.
Méthodes utilisées
- Préparation de suspensions unicellulaires à partir de cellules épithéliales thymiques de souris.
- Marquage de molécules intracellulaires.
- Analyse en cytométrie en flux pour un examen détaillé.
- Utilisation de techniques avancées d'isolement.
Résultats principaux
- Isolation réussie de diverses cellules épithéliales thymiques.
- Compréhension améliorée des mécanismes de développement des lymphocytes T.
- La cytométrie en flux a permis d'obtenir des informations sur l'expression des molécules intracellulaires.
- Des protocoles ont été établis pour les recherches futures en biologie des lymphocytes T.
Conclusions
- L'étude contribue à la compréhension des fonctions des cellules épithéliales thymiques.
- Les protocoles peuvent être appliqués à des recherches ultérieures en immunologie.
- Les connaissances acquises pourraient conduire à des progrès dans les thérapies par cellules T.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La préparation d'une suspension unicellulaire et la coloration intracellulaire des cellules épithéliales thymiques de souris (TEC) permettent une analyse précise des mécanismes de développement des lymphocytes T au niveau cellulaire. Ce flux opérationnel soutient la détection mécanistique des risques et la validation des cibles dans les programmes de découverte axés sur l'immunologie, notamment lorsque la sélection et la tolérance dirigées par les TEC sont essentielles. Une analyse cytométrique en flux fiable des sous-populations de TEC éclaire les décisions précoces concernant le portefeuille de projets et la continuité translationnelle des stratégies de modulation immunitaire.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet la validation fonctionnelle des molécules exprimées par les CTE impliquées dans la sélection et la tolérance des lymphocytes T.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en distinguant les contributions des CTE corticales et médullaires à la formation du répertoire immunitaire.
- Donne des données quantitatives permettant d'éclairer la priorisation des cibles et les évaluations de plausibilité biologique.
Développement de criblages et de tests
- Établit des suspensions unicellulaires standardisées pour des dosages par cytométrie en flux reproductibles.
- Permet une détection robuste de marqueurs intracellulaires tels que beta5t et CCL21 dans des sous-ensembles définis de cellules épithéliales thymiques (TEC).
- Permet l'extensibilité des dosages et la comparabilité entre études pour les plateformes de profilage des cellules immunitaires.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des modèles pertinents pour la maladie en caractérisant les mécanismes induits par les CTE sous-jacents à la tolérance immunitaire.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique des cibles de modulation immunitaire.
- Fournit une base pour le développement de biomarqueurs associés à la fonction des CTE et à la sélection des lymphocytes T.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'intègre à la continuité découverte-préclinique en permettant une analyse à haute résolution des sous-populations de cellules épithéliales thymiques et de leurs signatures moléculaires.
- Découverte en biologie : Fait progresser les tests d'hypothèses sur les mécanismes de sélection et de tolérance des lymphocytes T médiés par les CTE.
- Tri : Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs par cytométrie en flux pour l'expression des marqueurs des CTE.
- Analyse : Fournit des données à résolution unicellulaire pour l'analyse comparative des sous-populations de CTE et de la prévalence des marqueurs.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les connaissances mécanistiques et les modèles précliniques de modulation et de tolérance immunitaires.
- Réutilisation en entreprise : Propose un protocole réutilisable pour l'isolement et l'analyse des CTE dans divers programmes de recherche et développement en immunologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles immunitaires et réduit l'ambiguïté mécanistique des voies de sélection des lymphocytes T.
- Valeur opérationnelle : Normalise l'isolement des CTE et la coloration intracellulaire pour des protocoles de cytométrie en flux reproductibles et évolutifs.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller ou de non-aller en fournissant des données solides sur les mécanismes immunitaires induits par les CTE.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles de modulation immunitaire fondée sur des mécanismes cellulaires validés.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en dissociation tissulaire, cytométrie en flux et protocoles de coloration intracellulaire.
- Exige un accès à un équipement de cytométrie en flux avancé et à des logiciels d'analyse.
- Implique une standardisation interéquipes des procédures de préparation et de coloration des cellules pour assurer la comparabilité des données.
- Peut nécessiter des adaptations selon l'âge des souris ou les fréquences des sous-populations de CTE.
- Des rendements limités en CTE (1 % de CTEc, 10 % de CTEm) peuvent restreindre le débit et la taille des échantillons.
