Name: Évaluation de l’activité de réparation des cassures double brin de l’ADN à l’aide de dosages rapporteurs à haut débit et quantitatifs basés sur la luminescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 1 s
Description: Découvrez des dosages rapporteurs luminescents pour évaluer la réparation des cassures double brin de l'ADN dans les cellules. Ces méthodes quantitatives facilitent la découverte de médicaments en oncologie.

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Tous les travaux ont été financés par Artios Pharma Ltd. Les figures 1 et 3 ont été créées avec Biorender.com.

Quantification de la réparation des cassures double brin de l’ADN à l’aide de dosages de nanoluciférase rapporteure

<ol><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).</li>
<li>Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism%2C+cellular+functions+and+cancer+roles+of+polymerase-theta-mediated+DNA+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).</li>
<li>Ceccaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous-recombination-deficient+tumours+are+dependent+on+Pol%CE%B8-mediated+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ-mediated repair.</a> Nature. 518 (7538), 258-262 (2015).</li>
<li>van de Kooij, B., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+reporter+constructs+to+monitor+pathway-specific+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks.</a> Front Genet. 12, 809832(2021).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).</li>
<li>Rajendra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((titratable+and+high-throughput+reporter+assays+to+measure+DNA+double+strand+break+repair+activity+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells.</a> Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Wyatt, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+for+polymerase+%CE%B8-mediated+end+joining+in+the+repair+of+chromosome+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks.</a> Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).</li>
<li>Wood, R. D., Doublié, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+protection+by+DNA+polymerase+%CE%B8%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome protection by DNA polymerase θ.</a> Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).</li>
<li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Mol Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li>
<li>Zatreanu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pol%CE%B8+inhibitors+elicit+BRCA-gene+synthetic+lethality+and+target+PARP+inhibitor+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance.</a> Nat Commun. 12 (1), 3636(2021).</li>
<li>Stockley, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-based+optimization+of+small-molecule+in+vitro+and+in+vivo+probes+for+human+DNA+polymerase+theta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta.</a> J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).</li>
<li>Scott, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+inhibitor+of+the+BRCA2-RAD51+interaction+modulates+RAD51+assembly+and+potentiates+DNA+damage-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death.</a> Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847 (2021).</li>
<li>Schep, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chromatin+context+on+Cas9-induced+DNA+double-strand+break+repair+pathway+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance.</a> Mol Cell. 81 (10), 2216-2230 (2021).</li>
</ol>

D.G., E.R., B.M., A.G., S.J.B., G.C.M.S et H.M.R.R. sont tous des employés et des actionnaires d’Artios Pharma Ltd. G.C.M.S. est actionnaire d’AstraZeneca PLC. S.J.B. est un scientifique fondateur et actionnaire d’Artios Pharma Ltd. Un brevet a été déposé sur certains des déclarants décrits dans cette étude (WO 2021/001647). Promega est à l’origine de la technologie NanoLuc® et des polynucléotides modifiés de NanoLuc®. Artios Pharma a été autorisé par Promega à générer les polynucléotides modifiés de NanoLuc®.

Ici, nous avons décrit des protocoles pour la génération et la mise en œuvre d’une suite de rapporteurs basés sur la luminescence extrachromosomique pour mesurer la compétence cellulaire des quatre principales voies DSBR (HR, NHEJ, MMEJ et SSA)7. Les substrats rapporteurs peuvent être introduits dans les cellules par transfection transitoire et utilisés pour évaluer l’activité DSBR à l’aide d’une lecture sensible et robuste de la luminescence NanoLuc, qui est reconstituée lors de l’engagement avec les voies cellulaires DSBR apparentées.
Plusieurs étapes de la génération du substrat rapporteur, de la transfection des substrats en cellules et de l’interprétation des données sont essentielles à la réussite de l’exécution de ces tests. Bien que des techniques standard de biologie moléculaire soient utilisées pour générer les substrats rapporteurs, la visualisation du processus par électrophorèse sur gel garantit la plus haute qualité et pureté des substrats avant la transfection. Comme ces tests reposent sur la transfection transitoire, des considérations courantes s’appliquent à ces méthodes. Il s’agit notamment d’optimiser la densité d’ensemencement, les conditions de transfection (y compris les réactifs et les quantités d’ADN) et d’évaluer l’adéquation dans les formats de transfection directe et inverse. Ces tests rapporteurs ont été réalisés avec succès avec une gamme de protocoles d’électroporation et de lipofection, et les options doivent être pleinement explorées avant d’effectuer ces tests. Il faut également prendre soin d’inspecter les signaux NanoLuc et Firefly plutôt que simplement le signal de réparation composite dérivé de la normalisation du signal NanoLuc (substrat rapporteur) en signal Firefly (contrôle). Des artefacts peuvent provenir du rapport déterminé par des changements dans le signal Firefly. Par exemple, l’évaluation de l’inhibition en mode dose-réponse à l’aide d’un composé hautement spécifique devrait supprimer le signal NanoLuc de manière titulable sans perturber le signal Firefly, qui devrait rester stable (Figure 4G,H). Cependant, dans les cas où les signaux Firefly sont perturbés, les impacts utiles sur la réparation peuvent encore être déterminés en identifiant une fenêtre de dose où le signal Firefly n’est pas affecté (Figure 5).
Par rapport aux tests de rapporteur DSBR les plus fréquemment utilisés, ces tests de rapporteur basés sur la luminescence extrachromosomique présentent des avantages distincts. Comme les voies DSBR sont hautement conservées, même si la machinerie cellulaire varie entre les modèles cellulaires, les tests peuvent toujours rendre compte de la compétence DSBR et du choix de la voie. Cela ouvre l’évaluation du DSBR à tout modèle d’intérêt pour l’utilisateur, à condition que les conditions optimales de transfection transitoire soient établies à l’avance.
L’utilisation de la nanoluciférase comme gène rapporteur offre également des avantages par rapport aux options fluorescentes, qui ont été traditionnellement utilisées dans les tests rapporteurs DSBR. NanoLuc est à maturation rapide et la luminescence est détectée avec une grande sensibilité à l’aide d’un lecteur de plaques8. Associé à la rapidité de réparation du substrat (car les substrats rapporteurs sont transfectés dans des cellules avec des extrémités DSB prêtes à être réparées), ce format de test rapporteur DSBR est idéal pour le délai d’exécution rapide et la robustesse quantitative requis pour le criblage de petites molécules dans le cadre d’une cascade de découverte de médicaments industriels. En effet, nous avons récemment décrit la mise en œuvre du test rapporteur MMEJ indépendant de la résection dans la cascade de découverte utilisée pour l’identification de petites molécules inhibitrices du domainepolymérase Polθ 13.
Il existe également une certaine souplesse dans la mise en œuvre des tests rapporteurs pour répondre à des questions spécifiques sur les perturbations génétiques et pharmacologiques du DSBR (Figure 3). Par exemple, avant la transfection des substrats rapporteurs, les cellules peuvent être transfectées avec siRNA contre un gène d’intérêt pendant 48 à 72 h. Alternativement, les effets de la surexpression des gènes sur les voies DSBR peuvent être testés en effectuant la transfection plasmidique 24-48 h avant la transfection des substrats rapporteurs. Pour les études pharmacologiques, le protocole actuel décrit déjà comment l’utilisation de petites molécules peut être intégrée dans le flux de travail standard, mais d’autres formats peuvent inclure des modifications dans les régimes de traitement des composés, tels que les pré-incubations ou les lavages.
L’évolutivité de la transfection transitoire pourrait également soutenir des approches de criblage à grande échelle dans lesquelles la transfection par lots des substrats rapporteurs est effectuée avant le dépistage. De plus, la durée du dosage, de la transfection à la lecture, peut également varier. Bien que les durées standard puissent être de 16 à 24 h, certains tests peuvent être lus en aussi peu que 6 h7. Les préoccupations concernant la toxicité de petites molécules ou d’ARNi qui peuvent compromettre la viabilité cellulaire doivent également être prises en compte dans la détermination de la durée de l’essai.
En résumé, les tests décrits dans cette étude et décrits en détail dans une publication récente7 fournissent une évaluation rapide et robuste de la compétence cellulaire DSBR. Ils sont très sensibles et titrables, ce qui les rend susceptibles d’études génétiques et pharmacologiques. De manière cruciale, comme les substrats rapporteurs peuvent être introduits dans les cellules par transfection transitoire, ils ont le potentiel d’être utilisés dans n’importe quel modèle de cellule transfectable d’intérêt, plutôt que d’être limités à des lignées cellulaires spécifiques par une intégration stable comme c’est le cas avec les rapporteurs DSBR chromosomiques. Cependant, une limitation distincte de ces tests extrachromosomiques rapporteurs est que le manque d’intégration dans le génome peut ne pas récapituler complètement le contexte physiologique et chromatinisé de la réparation de l’ADN et ses signaux régulateurs et orchestration associés15. À cette fin, les tests de rapporteurs extrachromosomiques sont complémentaires aux méthodes existantes d’évaluation du DSBR et élargissent la boîte à outils de ressources adaptées à la fois à la recherche fondamentale et à la découverte de médicaments.

Les cassures double brin de l’ADN (CDB) représentent une classe particulièrement toxique de lésions de l’ADN1 en raison desquelles les cellules ont développé plusieurs voies de réparation des CDB (DSBR) pour réparer ces lésions. Les quatre principaux mécanismes DSBR sont la recombinaison homologue (HR), l’assemblage d’extrémités non homologues (NHEJ), l’assemblage d’extrémités médié par microhomologie (MMEJ) et le recuit monobrin (SSA)2,3. Les voies DSBR contribuent au maintien d’un développement tissulaire et d’une physiologie sains et protègent contre des maladies telles que le cancer. De plus, ces mécanismes de réparation présentent un potentiel thérapeutique pour le développement de modulateurs à petites molécules en oncologie de précision. Par exemple, le ciblage de l’ADN polymérase θ (Polθ), une enzyme pivot dans la voie de réparation de la MMEJ, a suscité de l’intérêt en raison de sa létalité synthétique avec déficit en HR dans le cancer4.
La compréhension du DSBR a donc de vastes implications cliniques et des tests cellulaires fonctionnels capables de mesurer l’activité de toutes les principales voies du DSBR sont nécessaires5. Les tests doivent être adaptés à la fois à l’interrogation génétique et pharmacologique et pouvoir être déployés dans des modèles cellulaires d’intérêt. Pour soutenir les efforts de découverte de médicaments à petites molécules, les tests doivent être très sensibles, titrables, avoir un délai d’exécution rapide et être évolutifs vers des formats à haut débit adaptés au criblage de composés.
En général, le DSBR a déjà été mesuré à l’aide de systèmes de dosage de rapporteurs basés sur la fluorescence et intégrés de manière stable dans le génome cellulaire6. Cependant, bien que la récapitulation physiologique du DSBR chromosomique soit un avantage certain, ces tests sont limités à un modèle hôte dans lequel le rapporteur est intégré, utilisent une préparation et une analyse d’échantillons à forte intensité de main-d’œuvre par cytométrie en flux, et ont un débit, un temps d’exécution, une robustesse et une sensibilité limités, toutes des caractéristiques essentielles nécessaires aux efforts de découverte de médicaments.
Nous décrivons ici une série de tests rapporteurs DSBR qui permettent d’évaluer les quatre principales voies DSBR. La série de substrats de test rapporteur est décrite à la figure 1 et décrite plus en détail dans une publication récente7. Ils sont extrachromosomiques, permettant leur introduction dans les cellules par simple transfection transitoire, et l’incorporation d’un gènerapporteur de nanoluciférase 8, qui doit être reconstitué en s’engageant avec des mécanismes spécifiques de DSBR, engendre sensibilité, robustesse et évolutivité. Les variantes de substrat rapporteur DSBR suivantes sont incluses dans le protocole (Figure 1) :
MMEJ indépendant de la résection : Ce substrat linéaire est composé d’une région centrale d’ADN double brin (ADNdb) avec des surplombs d’ADN simple brin (ADNsb), qui imitent les extrémités d’ADN réséquées9. Quatre microhomologies nucléotidiques aux extrémités des régions de l’ADNss codent pour le codon de départ du gène rapporteur. La réparation de ce substrat par MMEJ restaure le cadre de lecture ouvert du gène rapporteur (ORF).
MMEJ dépendant de la résection : L’exon du gène rapporteur N-terminal est interrompu par un segment contenant un codon stop, qui est flanqué de 8 microhomologies de paires de bases (pb). Une résection de l’extrémité nucléolytique est nécessaire avant la réparation médiée par MMEJ pour restaurer le gène rapporteur intact.
NHEJ émoussé : Le gène rapporteur est scindé en sections N- et C-terminales, dont cette dernière est placée en amont du promoteur. Le DSB est produit à l’aide d’EcoRV et nécessite une ligature directe (sans traitement d’extrémité) par le NHEJ pour que les parties du gène rapporteur soient réunies et que l’ORF rapporteur soit restauré.
NHEJ non émoussé : Le DSB est situé à l’intérieur d’un intron et aura des extrémités cohésives ou non cohésives selon le choix de l’enzyme de restriction. La réparation de ce substrat par NHEJ nécessite que la ligature soit précédée d’un traitement final.
Modèle long HR : L’exon N-terminal du gène rapporteur est interrompu par un segment d’ADN contenant des sites de restriction, qui remplacent 22 pb de la séquence originale du gène rapporteur. Pour restaurer cette séquence, la réparation par HR utilise le modèle d’homologie de 2,5 kilobases (kb) placé en aval de l’exon C-terminal.
Modèle court HR : Le site de restriction nécessaire pour générer le DSB remplace une partie de la séquence du gène rapporteur natif et introduit un codon stop dans le cadre. Comme la version à modèle long, ce substrat HR nécessite le modèle d’homologie en aval (360 pb) pour une réparation et une restauration précises de l’ORF rapporteur.
SSA: Ce substrat contient un codon stop prématuré situé dans l’exon N-terminal du gène rapporteur. L’ablation de ce codon stop et la réintégration de la séquence du gène rapporteur intact nécessitent une réparation par SSA, ce qui implique une résection bidirectionnelle à longue portée avant l’alignement des homologies.
Pour la génération de la DSB, certains des substrats rapporteurs peuvent être digérés avec I-SceI (Figure 1). Cela générera un substrat linéaire avec des extrémités non cohésives dans les rapporteurs MMEJ dépendants de la résection, NHEJ non émoussés, HR à modèle long et SSA, qui ont des sites I-SceI en tandem dans des orientations inversées. Dans le substrat rapporteur HR modèle court, la digestion du site unique I-SceI générera des extrémités cohésives. Les plasmides NHEJ non émoussés, MMEJ dépendants de la résection, HR à matrice longue et SSA peuvent également être digérés avec HindIII, ce qui produira des extrémités cohésives complémentaires.
Nous fournissons des protocoles pour la génération des substrats de test rapporteur et décrivons comment les tests peuvent être effectués, en fournissant des détails sur la façon dont ils peuvent être utilisés pour quantifier le DSBR, y compris les réponses titrables aux petites molécules, l’évaluation de la puissance cellulaire, l’activité sur la cible et la sélectivité des voies.

<table><tbody><tr><td>10x tampon TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>20 % TBE-acrylamide gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6315BOX</td><td></td></tr><tr><td>50x tampon TAE</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13321</td><td></td></tr><tr><td>6x Gel Loading Dye, Purple</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Plaque blanche à 96 puits (avec fond et couvercle transparents)</td><td>Porvair</td><td>204012</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Cleaver Scientific</td><td>CSL-AG500</td><td></td></tr><tr><td>Perles AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Pour la purification à base de billes de l’ADN</td></tr><tr><td>Phosphatase antarctique et tampon 10X</td><td>NEB</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>CLARIOstar</td><td>BMG Labtech</td><td>430-101</td><td>Lecteur</td></tr><tr><td>de plaques Countess II Compteur de cellules automatisé</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAX1000</td><td>Compteur de cellules</td></tr><tr><td>Oligonucléotides personnalisés</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Commande personnalisée</td><td>Pour substrat MMEJ indépendant de la résection. Voir le tableau 2.</td></tr><tr><td>D300e</td><td>Tecan</td><td>30100152</td><td>distributeur de composés à base de DMSO</td></tr><tr><td>D300e Cassette D4+</td><td>Tecan</td><td>30097371</td><td>Cassette à haut volume pour distributeur de composés D300e</td></tr><tr><td>Cassette D300e T8+</td><td>Tecan</td><td>30097370</td><td>Cassette à faible volume pour distributeur de composés D300e</td></tr><tr><td>Sulfoxyde de diméthyle, qualité culture cellulaire</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Véhicule pour composés, utilisé dans la figure 4 et Figure 5</td></tr><tr><td>DSBR reporter source plasmides</td><td>Artios</td><td></td><td>Disponible pour la communauté académique sur demande&nbsp ;</td></tr><tr><td>EcoRV-HF et 10x tampon CutSmart</td><td>NEB</td><td>R3195M</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol absolu</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3031&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Échelle d’ADN GeneRuler Ultra Low Range</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM1211</td><td>Échelle d’ADN de faible poids moléculaire</td></tr><tr><td>Cellules HEK-293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>Exemple de lignée cellulaire utilisée dans le protocole</td></tr><tr><td>HindIII-HF et tampon 10x CutSmart</td><td>NEB</td><td>R3104M</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Eau de qualité biologie moléculaire</td><td>Fisher Scientific</td><td>10275262</td><td></td></tr><tr><td>I-SceI et 10x Tango Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>ER1771</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>VWR</td><td>20842.33</td><td></td></tr><tr><td>Réactif et tampon JetPRIME</td><td>PolyPlus</td><td>114-15</td><td>Réactif de transfection à base de lipides</td></tr><tr><td>MegaStar 1.6</td><td>VWR</td><td>521-1749</td><td>Centrifugeuse pour tubes de 15 ou 50 mL</td></tr><tr><td>MEM Eagle</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-08056</td><td>Milieu de culture pour cellules HEK-293</td></tr><tr><td>Microplaque agitateur</td><td>Fisherbrand</td><td>15504070</td><td>Agitateur orbital à microplaques</td></tr><tr><td>MicroStar 17R</td><td>VWR</td><td>521-1647</td><td>Centrifugeuse pour tubes de 1,5 ou 2 mL</td></tr><tr><td>MultiDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>5840300</td><td>Distributeur de réactifs à base de cellules ou d’eau</td></tr><tr><td>Cassette standard MultiDrop Thermo</td><td>Fisher</td><td>24072670</td><td>Cassette pour distributeur de réactifs</td></tr><tr><td>MultiDrop NanoDLR Stop & Réactif Glo Buffer and Substrate</td><td>Promega</td><td>N1630 ou N1650</td><td>Reporter luciférase (NanoLuc) pour éteindre la luminescence de Firefly et détecter la luminescence de NanoLuc. Fait partie du kit Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay</td></tr> System <tr><td>ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Subsubstrate Promega</td><td></td><td>N1630 ou N1650</td><td>Control luciferase (Firefly) réactif de dosage pour détecter Firefly. Fait partie du kit Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System</td></tr><tr><td>PBS (sans calcium ni magnésium)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>pGL4 Plasmide Firefly (ou similaire)</td><td>Promega</td><td>E1310 (ou équivalent)</td><td>Plasmide de contrôle Firefly</td></tr><tr><td>pNL1.1 Plasmide NanoLuc (ou similaire)</td><td>Promega</td><td>N1091 (ou équivalent)</td><td>Plasmide de contrôle NanoLuc, pour l’ajustement des paramètres de l’équipement/expériences d’optimisation</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 1 kb Échelle d’ADN</td><td>NEB</td><td>N0552S</td><td>Échelle d’ADN de haut poids moléculaire</td></tr><tr><td>Acétate de sodium (3 M), pH 5,5</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9740</td><td>Pour l’ajustement du pH lors de l’extraction de gel avec QIAquick Gel Extraction Kit</td></tr><tr><td>SYBR Gold (10,000x)</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>Pour la visualisation de l’ADNsb et de l’ADNdb</td></tr><tr><td>SYBR Safe (10,000x)</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Pour la visualisation de l’ADNdb uniquement</td></tr><tr><td>ADN T4 Ligase et tampon 10x Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue stain 0,4</td> %<td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Pour la mesure de la viabilité pendant le comptage cellulaire</td></tr><tr><td>Solution de trypsine-EDTA ; 0,25 % Trypsine et 0,53 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>XhoI et 10x tampon CutSmart</td><td>NEB</td><td>R0146M</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de l’activité de réparation des cassures double brin de l’adn à l’aide de dosages rapporteurs à haut débit et quantitatifs basés sur la luminescence

Assessment of DNA Double Strand Break Repair Activity Using High-throughput and Quantitative Luminescence-Based Reporter Assays

La réparation des cassures double brin de l’ADN (CDB) est cruciale pour le maintien de la stabilité du génome et de la viabilité cellulaire. La réparation des DSB (DSBR) dans les cellules est médiée par plusieurs mécanismes : la recombinaison homologue (HR), l’assemblage d’extrémités non homologues (NHEJ), l’assemblage d’extrémités médié par microhomologie (MMEJ) et le recuit simple brin (SSA). Les tests cellulaires sont essentiels pour mesurer la compétence et la modulation de ces voies en réponse à divers stimuli.
Ici, nous présentons une série de tests rapporteurs extrachromosomiques qui mesurent chacun la reconstitution d’un gène rapporteur de la nanoluciférase par l’une des quatre principales voies DSBR dans les cellules. Lors de la transfection transitoire dans les cellules d’intérêt, la réparation des substrats rapporteurs spécifiques à la voie peut être mesurée en moins de 24 heures par la détection de la luminescence de la nanoluciférase (NanoLuc).
Ces tests robustes sont quantitatifs, sensibles, titrables et se prêtent à un format de criblage à haut débit. Ces propriétés offrent de vastes applications dans la recherche sur la réparation de l’ADN et la découverte de médicaments, complétant la boîte à outils actuellement disponible de tests DSBR cellulaires.

La réparation de chacun des dosages rapporteurs peut être détectée et quantifiée à l’aide de la même procédure. La réparation correcte d’un substrat par sa voie de réparation apparentée dans les cellules reconstituera un ORF intact et fonctionnel codant pour NanoLuc. Ce signal de luminescence peut être détecté à l’aide d’un lecteur de plaques.
La co-transfection avec un plasmide intact codant pour la luciférase Firefly sert de contrôle de transfection. Ce contrôle a deux objectifs. Tout d’abord, il fournit une norme pour normaliser le signal NanoLuc, car il ne devrait pas être perturbé par la modulation du DSBR par des moyens génétiques ou pharmacologiques. Deuxièmement, il peut fournir une indication de perturbations cellulaires hors cible qui ont un impact sur le signal de la luciférase, telles que la modulation du cycle cellulaire, les effets sur la transcription/traduction ou la toxicité générale.
Le rapport entre NanoLuc et Firefly sert de lecture de substitution de la réparation. Les valeurs de luminescence peuvent être exportées et analysées en normalisant les deux signaux de luciférase à l’intérieur du même puits. Dans le cas d’études de perturbation génétique (p. ex., comparaison d’ARNi de type sauvage et d’ARNi KO ou non ciblés et cibles), la réparation est généralement normalisée à l’échantillon parental (cellules de type sauvage ou cellules traitées avec des ARNi témoins non ciblés). Dans le cas de la modulation pharmacologique, les valeurs d’un échantillon traité par un composé sont normalisées à la valeur produite par le traitement par véhicule.
La validation complète de la suite de rapports décrits a été récemment publiée7. Des données illustrant la caractérisation de la modulation génétique et pharmacologique de la DSBR sont présentées à la figure 4 (adaptée de 7). Polθ est le médiateur clé de la MMEJ et la perte ou l’inhibition de cette enzyme est prédite pour ablater spécifiquement la MMEJ cellulaire 3,10. En utilisant une lignée cellulaire dans laquelle POLQ, le gène codant pour Polθ, a été éliminé11, le test rapporteur MMEJ indépendant de la résection démontre que le MMEJ est en effet presque entièrement supprimé. L’évaluation des signaux de luminescence des composants NanoLuc et Firefly montre que le défaut de réparation observé est provoqué par une réduction du signal NanoLuc (codé par le substrat rapporteur) tandis que le signal Firefly (contrôle) n’est pas perturbé (Figure 4A-C). En revanche, l’évaluation de la compétence NHEJ à l’aide du rapporteur NHEJ à extrémité émoussée démontre que l’inactivation de POLQ n’inhibe pas la réparation du substrat rapporteur (Figure 4D-F). Ensemble, ces données génétiques soutiennent le rôle spécifique de Polθ dans la réparation médiée par MMEJ. Ces observations sont entièrement récapitulées pharmacologiquement avec ART55812,13, un inhibiteur hautement puissant et spécifique du domaine polymérase de Polθ (Figure 4G), où une inhibition titrable de MMEJ est observée, qui découle d’une diminution spécifique du signal NanoLuc et non du signal Firefly (Figure 4H). De plus, et en accord avec les données génétiques, il n’y a pas d’effet sur la NHEJ (Figure 4I,J). Ensemble, ces données mettent en évidence comment ces rapporteurs peuvent être utilisés pour caractériser la modulation génétique des voies DSBR et montrer la puissance cellulaire et la spécificité cible/voie des petites molécules.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig04.jpg"> Figure 4 : Effets de l’inactivation génétique et de l’inhibition pharmacologique de Polθ sur les signaux rapporteurs MMEJ et NHEJ. Les cellules eHAP1 WT et POLQ(-) ont été transfectées avec un plasmide témoin Firefly et avec (A-C) le rapporteur MMEJ indépendant de la résection ou (D-F) rapporteur NHEJ à extrémité émoussée. Le pourcentage de réparation MMEJ ou NHEJ est le rapport entre la luminescence NanoLuc et la luminescence Firefly, normalisé par rapport au témoin traité au DMSO, 24 heures après la transfection. Les données représentent la moyenne ± MEB de trois réplicats biologiques, chacun ayant une moyenne de 8 réplicats techniques. Les cellules HEK-293 ont été transfectées avec un plasmide témoin Firefly et (G,H) le rapporteur MMEJ indépendant de la résection ou le rapporteur NHEJ à extrémité émoussée (I,J) et traitées avec l’inhibiteur de la polymérase Polθ ART558. Le pourcentage de réparation est le rapport entre la luminescence de NanoLuc et la luminescence de Firefly, normalisé par rapport au témoin traité au DMSO, 24 h après la transfection. Le pourcentage d’inhibition des signaux de luminescence individuels en (G) et (I) a été calculé par rapport au témoin traité au DMSO et montré respectivement en (H) et (J). Les données représentent ± moyenne SEM de 2 réplicats biologiques, chacun ayant une moyenne de 4 réplicats techniques. Cette figure a été adaptée de Rajendra et al.7. Abréviations : NanoLuc = Nanoluciférase ; MMEJ = jonction d’extrémité médiée par microhomologie ; NHEJ = jonction d’extrémité non homologue ; WT = type sauvage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig05.jpg"> Figure 5 : Inhibition du signal rapporteur HR par l’inhibiteur de RAD51 CAM833. (A) Les cellules HEK-293 ont été transfectées avec le substrat rapporteur HR à matrice longue, un plasmide de contrôle de la luciférase Firefly, et traitées avec l’inhibiteur de RAD51 CAM83314. La luminescence de NanoLuc et Firefly a été lue 16 h après la transfection. Le pourcentage de réparation de la HR est le rapport entre la luminescence de NanoLuc et la luminescence de Firefly, normalisé par rapport au témoin traité au DMSO. Les lignes pointillées mettent en évidence le pourcentage d’inhibition de la FC et la concentration de CAM833 à la courbe EC50. Les données représentent ± moyenne SEM de 2 réplicats biologiques, chacun ayant une moyenne de 4 réplicats techniques. (B) Le pourcentage d’inhibition des signaux de luminescence individuels en (A) a été calculé par rapport au témoin traité au DMSO. Les lignes pointillées mettent en évidence le pourcentage d’inhibition de NanoLuc et Firefly à 3,33 μM CAM833 (EC50). La diminution du signal Firefly à des concentrations de CAM833 ≥ 10 μM est indicative d’une toxicité du composé à des doses élevées ; cependant, une réduction du signal NanoLuc est observée à des concentrations où le signal Firefly n’est pas affecté, ce qui suggère que CAM833 induit une inhibition de la HR sur la cible. Cette figure a été adaptée de Rajendra et al.7. Abréviations : NanoLuc = Nanoluciférase ; HR = recombinaison homologue. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Substrat rapporteur</td>
			<td>Plasmide source (taille en Ko, résistance)</td>
			<td colspan="3">Génération de DSB</td>
			<td>Taille prévue du substrat rapporteur final (kb)</td>
		</tr><tr><td colspan="2">MMEJ indépendant de la résection</td>
			<td>4.0, Kan</td>
			<td colspan="3">Résection de 3 queues par ligature des chapeaux</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">MMEJ dépendant de la résection</td>
			<td>6.5, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (non cohésif), HindIII (cohésif)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">NHEJ émoussé</td>
			<td>4.3, Kan</td>
			<td colspan="3">Extrémités arrondies lors de l’excision du plasmide par EcoRV</td>
			<td>1.7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">NHEJ non émoussé</td>
			<td>6.7, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (non cohésif), HindIII (cohésif)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Modèle long HR</td>
			<td>9.2, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (non cohésif), HindIII (cohésif)</td>
			<td>9.2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Modèle court HR</td>
			<td>9.3, ampérage</td>
			<td colspan="3">I-SceI (cohésif)</td>
			<td>9.3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SSA</td>
			<td>9.5, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (non cohésif), HindIII (cohésif)</td>
			<td>9.5</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Plasmides de substrat rapporteur. Abréviations : DSB = rupture de brin double ; MMEJ = jonction d’extrémité médiée par microhomologie ; NHEJ = jonction d’extrémité non homologue ; HR = recombinaison homologue ; SSA = recuit monobrin ; Kan = kanamycine ; Amp = ampicilline.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Séquence (5'-3')</td>
			<td>Fournisseur</td>
			<td>Purification</td>
			<td>Fonction</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT GTAGCCGGCTGTCTGTCGCCAGTCC CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACTAC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PAGE</td>
			<td>Capuchon gauche, oligonucléotide long</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PAGE</td>
			<td>Capuchon gauche, oligonucléotide court</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG GCCTCGGCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PAGE</td>
			<td>Capuchon droit, oligonucléotide long</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PAGE</td>
			<td>Capuchon droit, oligonucléotide court</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Oligonucléotides pour les coiffes pour la génération d’un substrat rapporteur MMEJ indépendant de la résection. Abréviations : ADNsb = ADN simple brin ; ADNdb = ADN double brin ; MMEJ = jonction d’extrémité médiée par microhomologie ; PAGE = électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les microhomologies sont soulignées.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Test du rapporteur</td>
			<td>ADN du substrat rapporteur NanoLuc (μg d’ADN/1x106 cellules)</td>
			<td>Plasmide luciférase de contrôle des luciférases (μg d’ADN/1x106 cellules)</td>
		</tr><tr><td>MMEJ indépendant de la résection</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>MMEJ dépendant de la résection</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>NHEJ émoussé</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>NHEJ non émoussé</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Modèle long HR</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Modèle court HR</td>
			<td>2</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>SSA</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 3 : Quantités d’ADN pour la transfection transitoire des substrats rapporteurs de NanoLuc et du plasmide luciférase de contrôle Firefly (HEK-293, format de plaque à 96 puits). Abréviations : MMEJ = jonction d’extrémité médiée par la microhomologie ; NHEJ = jonction d’extrémité non homologue ; HR = recombinaison homologue ; SSA = recuit monobrin.

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